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猪溃疡性结肠炎(Porcine Ulcerative Colitis，PUC)作为一种病理机制尚不明确的肠炎，发病率居高不下，严重影响着养猪业的经济效益. 主要病理变化为距肛门10 cm处肠黏膜上有多个溃疡面，中心凹陷，覆盖白苔，周边呈现充血状，临床症状主要表现为倦怠懒动，后背微弓，采食下降，出现稀便与脓血便，血便中可见肠黏膜脱落[1]. 中兽医学称溃疡性结肠炎为“休息痢” “久痢”和“肠澼”等. 根据证候可分为湿热证、寒湿证、寒热证、阳虚阴虚证、气虚气泄证、血瘀等[2]. “饲料端禁抗、治疗端减抗”背景下，寻找抗生素替代品是促进养猪业健康发展的手段之一.
以临床经验为基础，以中兽医学理论为基本准则，课题组自拟防治畜禽腹泻的中药鹳榆止泻散复方，主要功效为清热燥湿、健脾止泻. 该方由老鹳草、地榆、苦豆草、小茴香和甘草组成. 老鹳草主要功效为祛风湿、通经络、止泻痢，地榆主要用于治疗血热性出血、湿疹或疮疡痈肿等，苦豆草具有清热解毒、止痢等功效，小茴香主要功效为散寒止痛、理气和胃，甘草主要功效为和中、调和药性等[3]. 全方可治粪便中夹有脓血黏液的大肠湿热证型溃疡结肠炎，或粪便为白色胶冻状的脾虚湿蕴证型溃疡结肠炎.
临床实践证实鹳榆止泻散治疗猪溃疡性结肠炎效果确切，但其作用机制与功效物质基础尚不清楚. 网络药理学与分子对接是分析预测中药防治疾病作用机制与中药复方功效物质基础的两项重要技术. LI等[4]基于网络药理学和分子对接技术初步阐明了黄连解毒汤治疗脓毒症的潜在作用机制与功效物质基础. SIMAYI等[5]采用网络药理学和分子对接技术分析SFJDC(ShufengJiedu Capsule)对抗新型冠状病毒的活性成分和机制. FENG等[6]通过网络药理学和分子对接方法探讨EU-DR(Eucommia Ulmoides-Dipsaci Radix)对OP(Osteoporosis)的潜在机制，为治疗OP提供药理学依据. HU等[7]研究益神胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制，采用网络药理和分子对接技术探究其物质基础. 系统生物学与计算机网络分析技术从多角度、多方位分析药物活性成分对疾病作用靶点的调控和影响. 为探究鹳榆止泻散治疗猪溃疡性结肠炎的作用机制与物质基础，本研究采用网络药理学和分子对接技术分析鹳榆止泻散治疗猪溃疡性结肠炎的潜在关键靶点与信号通路，预测其作用机制，分析其功效物质基础，为兽医临床上采用鹳榆止泻散治疗猪溃疡性结肠炎提供依据，研究思路见图 1.
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为采集老鹳草、地榆、甘草、小茴香、苦豆草的活性成分，通过中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，
http://tcmspw.com/tcmsp.php )，以口服生物利用度(Oral Bioavailability)OB≥30%、类药性(Drug Likeness)DL≥0.18为筛选条件[8]，并结合文献查询，获取有效活性成分和相关作用靶点. 获得的靶点通过UniProt(https://www.uniprot.org/ )数据库[9]将检索出的蛋白名称标准化，即Official Symbol. -
PUC相关靶点基因通过GeneCards(
https://www.genecards.org/ )，OMIM(https://omim.org/ )，PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/ )，TTD(http://db.idrblab.net/ttd/ )，DrugBank(https://www.drugbank.ca/ )5大数据库[10]，以“Porcine Ulcerative Colitis”为关键词查询，并结合文献综合选取与PUC相关的靶点基因. -
将1.1项鹳榆止泻散5种中药活性成分作用靶点与PUC靶点基因导入R 4.1.0软件绘制Venn图，从而得到鹳榆止泻散治疗PUC的共同潜在作用靶点.
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将药物活性成分与对应潜在作用靶点基因导入Cytoscape 3.8.0软件进行可视化结果分析处理. 通过网络拓扑结构分析，获得活性成分及作用靶点的连接度(Degree). 选取鹳榆止泻散活性成分连接度大于等于平均数作为关键活性化合物[11]，根据药物活性成分与潜在作用靶点基因间的相互作用关系构建“活性成分-潜在作用靶点网络图”.
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将1.3项的潜在靶点导入STRING数据库(
http://stringdb.org/ )，生物种类设定为“Swine”，选择Multiple Protein模式，置信度设置为高置信度(得分为0.900)并导出PPI互作图和tsv文件进行分析[12].将tsv文件导入Cytoscape 3.8.0中，通过CytoNCA功能插件进行网络拓扑属性分析，以平台Betweenness(BC)，Closeness(CC)，Degree(DC)，Eigenvector(EC)，LAC，Network(NC)中位值参数作为重要的网络拓扑参数打分标准[13]，构建鹳榆止泻散关键活性成分作用于PUC的功能靶点网络，明确鹳榆止泻散干预PUC的核心靶点.
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将1.3项所得的潜在作用靶点导入R软件，通过R语言插件包(Colorspace，stringi，ggplot2，DOSE，clusterProfiler，enrichplot)以p＜0.05为筛选条件，进行基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，筛选GO中BP(Biological Process)，CC(Cellular Component)，MF(Molecular Function)前15个生物过程，KEGG中前30个通路. KEGG通路分析后选与疾病相关信号通路做通路图，分析工具选择R软件包的“Pathview”.
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采用分子对接软件VINA对PPI网络中使用Cytoscape 3.8.0拓扑分析所得，10个核心靶点基因中对应度值最大的靶点进行分子对接验证. PubChem(
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )数据库结合ChemOffice软件获得小分子配体结构，PDB(http://www.rcsb.org/ )数据库结合PyMOL软件获得靶蛋白受体结构，并使用AutoDockTools软件将配体和受体文件转化为PDBQT文件格式和确定其活性口袋(即分子对接搜索范围)的地址，对接结果以结合能的形式展示，Pymol软件进行配体与受体对接可视化，能量值的大小反映出结合形式的稳定性，越小的能量值结构越稳定.
1.1. 鹳榆止泻散活性成分与相应靶点的获取
1.2. PUC靶点基因的获取
1.3. 鹳榆止泻散活性成分作用靶点与PUC靶点基因Venn图的绘制
1.4. 鹳榆止泻散治疗PUC“活性成分潜在作用靶点”网络分析与构建
1.5. 蛋白相互作用网络(Protein-protein Interaction，PPI)构建与分析
1.6. 鹳榆止泻散在猪体内GO和KEGG通路富集分析
1.7. 分子对接
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通过设置OB≥30%，DL≥0.18，TCMSP数据库输入药物名称得到活性成分地榆344个、甘草2 506个、苦豆草963个、老鹳草554个、小茴香611个. 去除符合条件但靶点数为“0”且重复的化合物，共得到101个药物活性成分及233个对应的蛋白质靶点.
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使用5大数据库共获得PUC相关基因2 753个，数据库之间重复基因求并集做Venn图，图 2中相交重叠处基因数相加即为总基因数，共2 555个靶点基因.
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将鹳榆止泻散中233个作用靶点与PUC疾病2 555个基因取交集绘制Venn图，最终可得159个潜在作用靶点(图 3).
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将159个交集靶点导入Cytoscape 3.8.0软件，绘制“活性成分-潜在作用靶点”网络，实现数据可视化. 通过图 4网络拓扑性质及中心介数和度值，分析得出鹳榆止泻散中5种药物活性成分在该网络中都起到了关键作用. 从潜在作用靶点的角度分析，一个靶点受到越多活性成分影响，说明鹳榆止泻散对这个靶点的调控性越高，即鹳榆止泻散通过多成分、多靶点的相互作用来治疗PUC. 通过网络分析和查阅5种药物治疗PUC的关键活性成分筛选出7种化学成分：槲皮素、苦参碱、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、木犀草素、甘草异黄酮(表 1).
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将159个潜在作用靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，观察基因间是否具有蛋白互作的关系. PPI网络共包含140个节点，1 344条边. Cytoscape 3.8.0软件进行网络拓扑学分析，二次打分筛选过滤，最终得到其核心基因. 对核心基因进行后续的分子对接验证(图 5)，最终得到10个核心基因(表 2)：esr1 (Estrogen Receptor 1)，rela(RELA Proto-Oncogene)，akt1 (AKT Serine/Threonine Kinase 1)，mapk14 (Mitogen-Activated Protein Kinase 14)，mapk3 (Mitogen-Activated Protein Kinase 3)，stat3 (Signal Transducer And Activator Of Transcription 3)，tp53 (Tumor Protein P53)，jun(Jun Proto-Oncogene)，mapk1 (Mitogen-Activated Protein Kinase 1)，fos(Fos Proto-Oncogene). 这些核心基因的存在说明其在PPI网络中具有重要意义，可推断其在鹳榆止泻散治疗PUC方面能发挥作用.
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采用R软件对159个潜在作用靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，富集过滤条件均为p＜0.05，筛选结果得到2 461个GO条目. 生物过程(BP)相关的条目2 185条，主要涉及细菌来源分子、对氧化应激的反应、对脂多糖的调控、细胞对化学应力和氧化应激的反应、药物反应等过程；细胞组成(CC)相关的条目61条，主要涉及细胞膜上的膜筏、细胞膜区域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶反应、囊腔等方面；分子功能(MF)相关的条目215条，主要涉及转录因子结合、酶结合、相同蛋白质结合等方面. 选择结果最优的前45个条目绘制气泡图，图 6显示BP，CC，MF数目前15条.
KEGG通路176条，选取前30条信号通路做柱状图可视化分析(图 7)，主要包括癌症信号通路、结直肠癌信号通路、TNF信号通路、动脉粥样硬化、IL-17信号转导通路、炎症信号通路、细胞凋亡、Th17细胞分化、PI3K/Akt信号通路等，其中多数通路与炎症和癌症相关，表明鹳榆止泻散治疗PUC的分子机制可能与炎症反应和癌症通路更相关，对于PUC转变成结直肠癌的疾病进程或可产生一定的影响. 与溃疡性结肠炎相关的通路有JAK/STAT信号通路、Wnt信号通路、PI3K/Akt信号通路、NF-kB信号通路、MAPK信号通路，通过R语言软件插件“Pathview”进行通路图的绘制(图 8)，发现鹳榆止泻散关键活性成分通过多靶点、多成分、多通路发挥对PUC的治疗作用. 表 3为与鹳榆止泻散治疗PUC关系密切的前30条通路.
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为明确鹳榆止泻散治疗PUC中核心基因(蛋白)与关键化合物之间的结合能活性，此次研究选取7个主要的活性化合物作为配体，即槲皮素、苦参碱、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、木犀草素、甘草异黄酮. 以rela，esr1，akt1，tp53，jun，mapk1，fos 7个基因作为受体，进行分子对接验证，并记录其分子对接的结合能. 根据文献查阅研究其成分与蛋白结合的自由能若小于-5 kcal/mol认为二者结合稳定，且结合能的数值越低，结合的构象越稳定. 分子对接结果可以看出，活性成分与蛋白结合能均小于-5 kcal/mol(表 4). 对接结果表明鹳榆止泻散中活性化合物与PUC基因受体有着很好的结合作用，其中化合物与对应靶点最佳的分子对接有：fos与槲皮素，jun与木犀草素，rela与山奈酚，rela与苦参碱，esr1与甘草异黄酮，jun与β-谷甾醇，esr1与柚皮素(图 9).
2.1. 鹳榆止泻散活性成分及相应靶点
2.2. PUC靶点基因
2.3. 鹳榆止泻散活性成分作用靶点与PUC靶点基因Venn图
2.4. “活性成分潜在作用靶点”网络分析与构建
2.5. 鹳榆止泻散治疗猪溃疡性结肠炎的蛋白互作网络构建与分析
2.6. 鹳榆止泻散在猪体内GO功能和KEGG通路富集分析
2.7. 分子对接分析
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随着猪集约化养殖模式的快速发展，溃疡性结肠炎发病率居高不下，严重影响养殖效益. 鹳榆止泻散是临床上用于治疗溃疡性结肠炎的纯中药复方，其作用机制尚不明确. 本研究采用网络药理学与分子对接的方法探究鹳榆止泻散治疗猪溃疡性结肠炎的作用机制，发现其作用机制与炎症、细胞分化、细胞凋亡、TNF信号通路、IL-17信号转导通路、PI3K/Akt信号通路等密切相关. 鹳榆止泻散治疗PUC的中药活性成分主要包括槲皮素、柚皮素、山奈酚、木犀草素等.
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鹳榆止泻散有效成分经网络图分析和查阅文献筛选出槲皮素(quercetin)、苦参碱(matrine)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、柚皮素(naringenin)、木犀草素(luteolin)、甘草异黄酮(licoisoflavone)7种活性化合物. 槲皮素是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、抑菌等药理作用[14]. 苦参碱是一种生物碱类化合物，陈碧涛[15]研究显示苦参碱可调节机体细胞免疫功能使其达到免疫平衡，进而促进溃病性结肠炎(UC)病变恢复. 曲一帆[16]研究表明山奈酚可改善UC小鼠的疾病症状，同时可提高UC小鼠肠道菌群的丰富度及多样性. β-谷甾醇是一种植物甾醇，冯思敏等[17]研究发现，β-谷甾醇能有效改善DSS引起的小鼠结肠炎. 谢春燕等[18]研究发现柚皮素通过上调miR-22水平，抑制NLRP3炎症小体活化，发挥对UC大鼠肠屏障的保护作用. 木犀草素作为一种黄酮类化合物，其多种药理活性发挥抗炎、抑菌和抗氧化等作用[19]. 严展鹏[20]研究证实木犀草素能够通过激活Nrf2/ARE信号通路预防结直肠癌. 甘草异黄酮为甘草中的黄酮类成分，研究发现甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、保肝、抗溃疡等功效[21].
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通过“活性成分-潜在作用靶点”网络图的构建，可直观反映鹳榆止泻散治疗PUC是通过多种药物化合物、多个目标靶点来发挥作用的. 在PPI网络图中可以看到靶点与靶点间、单个靶点与多个靶点间相互作用，连接度值越大，表明在治疗UC时，药物化合物通过该靶点发挥治疗作用的可能性越大[22]. 治疗PUC疾病核心靶点基因主要包括rela，esr1，akt1，mapk14，mapk3，stat3，tp53，jun，mapk1与fos. rela是NF-κB的一个亚单位，rela磷酸化可能促进炎症反应，rela磷酸化还可能抑制NF-κB调控的炎症反应[23]. esr1可编码雌激素受体，研究发现UC机体肠道黏膜中炎症活动性增强，伴随esr1甲基化程度升高，该基因还参与UC的致癌作用[24]. 现代研究发现akt1为UC中的一个突变，该突变通过增强其膜联系作用来激发激酶，从而将akt1与癌症的发生直接关联起来. mapk通路是多种信号通路的交汇中心，在许多细胞增殖、癌变、炎症、凋亡等相关信号通路中起到关键作用，可产生多种效应[25]. stat3响应细胞刺激而介导多种基因表达，该基因的突变和自身免疫疾病与高免疫球蛋白E综合征有关[26]. 赵迪克[27]研究发现青蒿琥酯通过tp53靶点，上调Bax表达，下调Bcl-2表达，使下游Caspase-3表达增加，进而通过增进p53通路炎性细胞的凋亡来治疗UC. 王艳红等[28]研究发现，复发性结肠炎大鼠结肠组织中c-Jun表达明显升高. fos对肠黏膜细胞和肝具有保护作用，可增强机体免疫力[29]. 以上基因均参与了PUC的调控，也为鹳榆止泻散治疗PUC提供了科学依据.
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GO功能分析发现鹳榆止泻散治疗PUC主要生物过程包括：对脂多糖的调控、细胞对化学应力和氧化应激的反应、酶结合等. 通过这些生物过程，药物作用于相关靶点来发挥药效[25]. KEGG通路分析发现鹳榆止泻散通过癌症信号通路、TNF信号通路、IL-17信号转导通路、PI3K/Akt信号通路等发挥作用. 最新研究表明，PI3K通过第二信使PIP3与Akt的PH结构域结合，引起Akt构象改变，对细胞分化、增殖、凋亡等过程进行调节[30]. 方培植等[31]发现炎症状态下，PI3K/Akt-mTOR信号通路过度活化，在UC中发挥重要作用. 何秋月等[32]研究发现具核梭杆菌通过结直肠癌细胞HCT116促进TNF-α诱导细胞损伤、死亡，阐述了TNF信号通路在引发UC过程中的重要作用. 白介素-17(IL-17)作为重要的促炎细胞因子之一，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用[33]. 王丽丹等[34]研究发现，青黛与苦参碱配伍通过调控IL-6，TGF-β，RORγt与STAT3水平，从而抑制Th17细胞分化，抑制IL-7释放，改善Th17/Treg免疫失衡，发挥治疗溃疡性结肠炎的作用. 有研究发现影响UC相关的信号通路主要包括JAK/STAT，PI3K/Akt，MAPKs，TGF-β/Smad，Wnt，NF-κB等[35-41]，这些通路与前期KEGG富集分析通路是一致的.
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分子对接结果表明鹳榆止泻散主要活性成分与筛选出的rela，esr1，akt1，tp53，jun，mapk1，fos核心靶点均有较好的结合活性，构象稳定，说明鹳榆止泻散可能通过多靶点发挥疗效，初步验证了预测结果.
综上所述，本研究首次采用网络药理学和分子对接技术证实鹳榆止泻散中多种药物的活性成分通过不同类型的靶蛋白对多种通路进行调控，从而治疗PUC，并体现出中药复方对疾病治疗的系统性与整体性的特点. 鹳榆止泻散通过多成分、多靶点与多途径来干预猪溃疡性结肠炎，为阐明鹳榆止泻散干预溃疡性结肠炎的具体机制提供了依据，为鹳榆止泻散在后期兽医临床上的应用奠定了基础.