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杏子(Prunus armeniaca L.)属于蔷薇科杏属落叶乔木,果实一般呈圆形或卵圆形,口味酸甜,营养丰富,含有大量的糖、有机酸、胡萝卜素和糖苷[1-3]。目前,对新疆不同产区杏子的研究主要集中于总有机酸和总糖含量的差异化、品种特性差异[4]、采后的保鲜贮藏[5-7]以及产品加工[8-9]等方面。我国杏种植资源相对丰富,主要种植在华北及西北地区,而新疆作为杏子栽培种植的主产区之一,种质资源丰富[10],所产杏子果实风味浓郁、营养品质较好。
近年来,核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)技术在研究待测物的系统性和完整性方面有一定的优势,可以通过获得样本间化学成分的结构信息,比较不同样本之间的差异,现已成为食品研究领域中颇受青睐的技术之一[11-14]。NMR技术可以系统完整地分析果实品质的差异,也可以分析不同品种或不同产地作物间的品质差异。安莉等[15]基于NMR技术从不同品种草莓的氮谱(1H-NMR)图中识别出20种化学成分,分析了不同品种草莓间的化学成分差异,并结合多元统计分析筛选出了丙氨酸、柠檬酸、苹果酸等7种潜在的差异代谢物; 魏亮等[16]的研究表明NMR技术可以比较不同产地铁棍山药间的化学成分,通过谱图信息指认共识别出30种主要的化学成分,并利用葡萄糖、果糖的含量鉴别铁棍山药是否为道地怀山药。此外,NMR技术还用于分析灵芝[17]、甜瓜[18]、芍药[19]等作物的品质差异。
杏果中化学成分组成多样,仅靠感官评价或某一类化学成分含量都不能全面反映其果实的品质。传统的研究方法往往忽略了杏果中化学成分的整体特征,无法实现对杏果中所含化学成分信息的高通量捕获和不同杏果间化学成分的差异性鉴别。NMR技术则可以系统全面地分析待测物的化学成分,是一种可以应用于生物的代谢组学分析方法[20]。杏果中的糖类、氨基酸类和有机酸类物质与杏果的口味和营养品质密切相关,故本研究利用NMR技术结合多元统计分析方法探讨新疆6产区主栽品种杏果的营养品质差异,旨在为新疆不同产区主栽品种杏果特色挖掘提供一定的理论依据。
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N,N二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO),化学纯,国药集团化学试剂有限公司。
核磁共振波谱仪(ADVANCE 400型),瑞士Brucker公司; 电子天平(FA2004型),上海舜宇恒平科学仪器有限公司; 磁力加热搅拌器(IKA RCT basic型),德国IKA公司; 真空泵(IKA VACSTAR digital),德国IKA公司; 真空冷冻干燥机(LGJ-25C型),北京四环科学仪器厂有限公司。
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根据杏果成熟及上市时间,于2023年7-8月,采集新疆阿克苏产区小白杏、巴音郭楞蒙古自治州产区大白杏、和田产区穆克尤杏、喀什产区赛麦提杏、吐鲁番产区塔西杏、伊犁哈萨克自治州产区树上干杏,分别对应A、B、C、D、E、F产区。根据采样产区主栽杏果种植面积的大小,在产区内各乡镇采集杏果样品,A产区10份、B产区16份、C产区15份、D产区27份、E产区27份、F产区10份,共采集杏果样品105份,样品采集详细信息见表 1。
每份杏果样品质量为(3±0.5) kg,样品采集后直接运回实验室。由于核磁共振谱图采集成本较高,无法采集所有样品谱图,故将同产区内采集的样品以该产区乡镇为单位混匀后表征该产区杏果的整体营养品质特征,去核取果肉后打浆制成混样。根据各产区作物种植面积大小确定混样个数,混样共24份,其中A产区4份、B产区3份、C产区3份、D产区6份、E产区4份、F产区4份,置于-80 ℃冰箱预冻后,经真空冷冻干燥机冻干为粉末状待测。
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称取20 mg的冻干杏果样品粉末,加入0.4 mL的磷酸缓冲液(0.05 mol/L Na2HPO4和NaH2PO4的重水溶液)以及1 mL氘代DMSO,超声促进溶解,用一次性注射器吸取样液,微量过滤器过滤,使滤液装入核磁管待测。核磁共振氢谱(1H-NMR)检测于室温(25 ℃)测定,5 mm OneNMR探头,脉冲序列为PRESAT以压制样品中的水峰,扫描64次,谱宽4 800 Hz,采样点数16 K,弛豫时间2 s,采集时间3.408 s。
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使用MestReNova软件(V 9.0.1,Mestrelab Research,Santiago de Compostela,Galicia,Spain)对谱图进行傅立叶变换,相位调整,基线校正等处理,所有谱图在进行傅立叶变换时均乘以增宽因子为0.3 Hz的指数窗函数以提高信噪比。核磁共振谱图以内标物(TSP)在δ 0 ppm处的单峰定标,对比6产区杏果样品的1H-NMR分段谱图,对谱图进行分段积分。积分区间为δ 0.2~10 ppm,积分间距为0.04 ppm,全谱积分并将数据导出后归一化。为了消除基线波动和溶剂峰、水峰对数据分析带来的影响,在进行统计分析时去除δ 2.52~3.32 ppm和δ 4.72~5.12 ppm之间的信号。
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使用SIMCA-P14.0软件对归一化后的核磁数据进行主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)和最小二乘法判别分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA),对于PLS-DA模型,利用随机置换排列对模型的可靠性进行验证。
1.1. 试剂与仪器
1.2. 试验方法
1.2.1. 样品采集
1.2.2. 检测及分析方法
1.2.3. 核磁共振谱图数据预处理
1.2.4. 核磁共振数据分析
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从6产区杏果混样的氢谱图中各选取1张作为该产区代表杏果样品的谱图,结果如图 1。根据试验报道、文献数据[21-23]以及对照品的氢谱图,对杏果中的化学成分进行归属和识别,共指认出34种化学成分,具体的特征化学成分归属见表 2,主要含有氨基酸、有机酸及糖类物质。
通过对6产区杏果样品氢谱图的初步解析,可以将其大致可分为3个区域,即脂肪区、碳水化合物区和芳香区。指认出的氨基酸包括精氨酸、亮氨酸、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺; 有机酸包括苹果酸、富马酸、柠檬酸、2-酮丁酸、异戊酸、琥珀酸、乙酸、氧代戊二酸和丙二酸; 糖类物质包括蔗糖、α-D-葡萄糖和D-果糖等。
从6产区谱图信息得到,相较于其他5产区,吐鲁番产区塔西杏中解析到的化学成分信号较多,如精氨酸和丝氨酸等; 伊犁哈萨克自治州产区树上干杏中柠檬酸、谷氨酸、没食子酸等化学成分的信号峰较弱; 2-酮丁酸、乙醇两种化学成分的信号峰在喀什产区赛麦提杏、巴音郭楞蒙古自治州产区大白杏、吐鲁番产区塔西杏和伊犁哈萨克自治州产区树上干杏中较为明显,在阿克苏产区小白杏和和田产区穆克尤杏中信号较弱; 喀什产区赛麦提杏的乙酸信号峰较强。通过对比谱图信息,可以解析到信号峰在6产区内都有较为明显的化学成分,如蔗糖、D-果糖、赖氨酸等; 还有一些化学成分在部分产区信号较为明显,如2-酮丁酸、乙醇等。
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通过PCA模型得分图初步观察各产区样本间的总体分布,分析是否存在离异样本。图 2中,R2X[1]=0.364表示第1主成分的累积贡献率为36.4%,R2X[2]=0.176表示第2主成分的累积贡献率为17.6%,R2X[3]=0.120表示第3主成分的累积贡献率为12.0%。由3个主成分所得的PCA 3D得分图可见,24个样本未出现强异常值,没有离异样本存在。由于PCA分析是无监督的分析方法,只能反映数据的原始状态,为进一步分析组间差异,确定6地区杏果之间的化学成分差异,对相应数据进行有监督的PLS-DA分析。
图 3a为6产区杏果样品PLS-DA得分图,结果表明吐鲁番产区塔西杏(E)和伊犁哈萨克自治州产区树上干杏(F)对比其他4个产区的杏果有良好的分离度; 喀什产区赛麦提杏(D)对比阿克苏产区小白杏(A)、吐鲁番产区塔西杏(E)及伊犁哈萨克自治州产区树上干杏(F)的样品均有较好的分离度,但喀什产区赛麦提杏(D)与和田产区穆克尤杏(C)有1个样品重叠,巴音郭楞蒙古自治州大白杏(B)与阿克苏产区小白杏(A)样品大致重叠。总体而言,6产区样品有良好的分离度。对所建的PLS-DA模型进行200次随机置换排列检验(图 3b),得到模型的R2大于将数据随机打乱建模后得到的Q2,且Q2的回归线在t[2]轴上的截距小于0,证明所建立的PLS-DA模型具有统计学意义,可用于进一步筛选6产区杏果中的潜在差异化学成分。
图 4为6产区杏果PLS-DA分析的载荷散点图,图中从冷色调的蓝色到暖色调的红色是变量对不同产区杏果化学成分之间的差异贡献值(Variable Important in Projection,VIP)由小到大的显示,散点形状越大,颜色越接近暖色,表明该变量在不同产区杏果化学成分之间的差异贡献越大,定义VIP较大的变量为有显著差异的化学成分。通过鉴别,发现组氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、蔗糖、D-果糖等7种化学成分对不同产区杏果的差异贡献大,可视为不同产区之间杏果的潜在差异化学成分。
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图 5为6产区杏果潜在差异化学成分相对含量相关性热图,图中高含量区域表示为红色,低含量区域表示为蓝色。结果表明,阿克苏产区小白杏(A)中含量较高的是丝氨酸和赖氨酸,含量较低的是组氨酸和精氨酸; 巴音郭楞蒙古自治州产区大白杏(B)中含量较高的是赖氨酸、谷氨酰胺、D-果糖、组氨酸,含量较低的是丝氨酸和蔗糖; 和田产区穆克尤杏(C)和喀什产区赛麦提杏(D)中含量较高的是组氨酸和蔗糖,含量较低的是赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺; 吐鲁番产区塔西杏(E)中含量较高的是精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺,其余3种化学成分含量较低; 伊犁哈萨克自治州产区树上干杏(F)中组氨酸、蔗糖和D-果糖3种化学成分含量较高,其余4种化学成分含量较低。分析发现,吐鲁番产区塔西杏(E)中相对高含量的化学成分最多,且都为氨基酸类物质。包括精氨酸、丝氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺,这与6产区杏果氢谱图解析结果一致。
2.1. 6产区杏果氢谱(1H-NMR)图中化学成分的鉴定
2.2. 潜在差异化学成分的鉴别
2.3. 潜在差异化学成分相对含量相关性分析
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基于NMR技术以及PLS-DA模型分析发现,6产区样品整体分离度较好,其中巴音郭楞蒙古自治州大白杏(B)与阿克苏产区小白杏(A)样品大致重叠,原因可能是两个产区的主栽品种都是白杏,差异并不显著; 喀什产区赛麦提杏(D)与和田产区穆克尤杏(C)有1个样品重叠,可能是由于两个产区地理位置较接近,气候差异较小、种植方式相近等。有研究报道显示,在不同产区的作物会由于地理位置较近等因素导致化学成分较为相似,差异不明显[6]。
新疆6产区主栽杏果品种中潜在的差异化学成分为氨基酸和糖类,各产区杏果中差异代谢物含量与杏果品质之间均有着密切的联系,这些差异可能使不同产区杏果呈现出不同的特征优势。氨基酸是蛋白质、酶和核酸的前体物质,作为信号分子在果实的合成代谢和渗透调节中发挥作用,蔗糖、D-果糖是果实中主要的可溶性糖,是杏果口感与风味的重要影响因子[24]。果实中部分氨基酸与可溶性糖的转化具有相关性,特别是呈味氨基酸,如甘氨酸本身作为一种甜味氨基酸,能够通过促进气孔开放和光合电子转移速率提高净光合速率,增加光合产物,提高果实中可溶性糖的含量,利于果实着色[25]; 谷氨酰胺是果实中氮同化过程中产生的第一种氨基酸,除了为果实带来鲜味外,还可以降解柠檬酸,降低杏果的酸度,从而提高适口性。
研究表明,氨基酸种类及含量与果实品质和抗病性密切相关,Yan等[26]发现以丝氨酸为前体合成的丝氨酸蛋白酶处理果实后可以通过抑制菌类生长、提高果实抗病性等相关基因的相对表达量来增强果实对病原真菌的抗性。诸多学者[27-29]的报道表明,赖氨酸处理可以抑制相关病原真菌的活性,提高果实的抗病性,减少果实腐烂,从而保持果实的采后品质。阿克苏产区小白杏(A)和吐鲁番产区塔西杏(E)果实中丝氨酸、赖氨酸含量较高,这为新疆杏果的病害防治与采后贮藏提供了新的思路。还有研究发现[30-31],精氨酸处理可以通过调控果实中多胺、脯氨酸和一氧化氮等物质的合成、增强抗氧化酶活性并提高植物的抗冷性,减轻果实贮藏期的冷害。吐鲁番产区塔西杏(E)果实中精氨酸含量较高,在冷藏期冷害率较低,可能更适合长途冷链运输。通过研究解析新疆不同产区主栽品种杏果差异化学成分的相对含量,有利于明确不同产区主栽品种杏果的营养品质特征及差异性,对打造和增强新疆不同产区杏果品牌特色具有积极的意义。
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对6个产区的主栽品种杏果进行化学成分指认和差异分析,并找出潜在的差异化学成分,共鉴别出组氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、蔗糖、D-果糖等7种差异化学成分。研究表明,NMR技术能够用于不同产区杏果化学成分及其含量的差异分析,并且可以结合多元统计分析筛选各产区之间影响杏果品质的差异化学成分,可为新疆不同产区杏果营养品质差异分析及杏果资源深度开发利用提供理论依据。
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