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魔芋(Amorphophallus Blume)是天南星科魔芋属的多年生草本植物，也是唯一可提供大量葡甘聚糖的经济作物，起源于亚洲中南半岛北部和云南南部，其始祖种是森林下层的留居者，主要有白魔芋、珠芽魔芋、花魔芋等多个种[1]。魔芋葡甘聚糖作为良好的可溶性膳食纤维，具有预防高血压、高血脂以及减脂瘦身等功效，在医药、食品加工和功能材料等方面都有十分重要的作用[2]。魔芋在生产中常受到病害的侵袭，通常有软腐病、白绢病、病毒病、日灼病、叶枯病等，其中软腐病最普遍，一旦发病会导致魔芋减产和品质下降，造成难以挽回的经济损失，被称为魔芋的“癌症”[3-4]。
魔芋软腐病是细菌性病害，主要由果胶杆菌属(Pectobacterium)、迪基氏菌属(Dickeya)和一些未知菌株引起[5]，在高温、高湿环境及雨季或排水不良的田间易暴发。软腐病主要侵染魔芋的叶片、叶柄和球茎。叶片染病时，先出现水浸状的暗绿色小斑，组织逐渐腐烂并伴有汁液流出，叶片泛黄最后干枯；叶柄染病时，出现水浸状条斑或叶柄基部发生溃烂，汁液沿叶柄逐渐蔓延，导致叶柄腐烂离解，植株朝发病一侧倒伏；球茎染病时，发病部位表现暗褐色水浸状病斑，逐渐朝内部侵染，出现灰褐色黏液状腐烂并散发臭味，叶片萎蔫卷缩，后期地上部全株或半边发黄[6-8]。
化学防治是魔芋软腐病防控的主要手段，应用广泛的农用链霉素已退出农药市场，目前噻菌铜、氢氧化铜、波尔多液等化学农药应用普遍。研究表明青枯立克、四霉素水剂、噻森铜等均对软腐病有良好的防治效果[9]。化学农药虽然效果显著、用药成本低、操作简单，但是施用过多不仅会致使病原菌出现耐药性，还易造成环境污染、药物残留等问题[10]，不符合绿色健康可持续发展的要求。因此，在生产中应选择安全健康、选择性高、无药害、低残留的农药。生物农药又称天然农药，可源自植物(例如其分泌物、精油以及树皮、根和叶的提取物)、微生物(例如代谢物)以及生物来源的纳米颗粒(例如银和金纳米颗粒)等[11-12]，具有环境友好、来源广泛、选择性强的特点，应用范围正在逐步扩大。生物农药在防治魔芋软腐病方面的研究较少，主要有枯草芽孢杆菌、大蒜素、木醋液等[13-14]。采用生物农药防治魔芋软腐病能大大减少化学农药所带来的污染，避免抗药性问题，减少对魔芋自身生长的影响[15]。但生物农药易受环境因素干扰，防治效果缓慢，生产成本高，将生物农药与化学农药合理复配，不仅能增强防治效果，减缓病原菌抗药性，还能降低生产成本，减少对环境的影响。
为探究不同农药对魔芋软腐病病原菌的防治效果，本研究从魔芋发病植株中分离纯化魔芋软腐病病原菌，选用市售常见的6种生物农药和8种化学农药，分别探讨其对魔芋软腐病病原菌的抑制效果，并进一步探究二者在复配条件下的抑制效果，以期为魔芋软腐病防治提供高效、环境友好的绿色防治方案，同时为魔芋安全生产提供技术支撑和科学依据。
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2024年6月从重庆市北碚区西南大学歇马魔芋资源圃采集发病的白魔芋植株。
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NA培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15~20 g/L，pH值7.0；LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物3 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0；LB固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物3 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15~20 g/L，pH值7.0。
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供试6种生物农药种类及名称见表 1，供试8种化学农药种类及名称见表 2，细菌基因组DNA提取试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司生产。
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采用划线分离法分离病原菌[16]，采集发病魔芋植株并清理表面泥土，流水冲洗30 min，用75%酒精对材料表面进行消毒，在超净工作台中吹干，用灭菌刀切下病健交界处，放入75%酒精浸泡2 min，用无菌水漂洗3次；将病样组织放入含有1 mL无菌水的灭菌离心管中，用无菌玻璃棒捣碎，静置2 min后用接种环蘸取液体，在NA培养基上划线，28 ℃培养24 h，将单菌落进行多次划线培养获得纯化菌株。
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用灭菌牙签蘸取单菌落接种在LB液体培养基中，在28 ℃摇床(180 r/min)中培养24 h，制成OD600≈0.6的菌悬液。选择无病害的白魔芋球茎，流水冲洗干净，75%酒精表面消毒并在超净工作台中吹干；将球茎切成厚0.5 cm左右的方块，培养皿中放入无菌滤纸，加入2 mL无菌水保湿，在切片中央划出十字形伤口，用移液枪吸取20 μL菌悬液接种在伤口处，保鲜膜密封，28 ℃培养24 h。对照接种无菌水，设置3次重复。将培养后发病的魔芋球茎再次分离病原菌，根据柯赫氏法则进行验证。
菌株致病能力强弱根据病斑平均长度(L)[17]评价：0级，无明显病斑，标注为“-”；1级，L＜10 mm，标注为“+”；2级，10≤L＜15 mm，标注为“++”；3级，15≤L＜20 mm，标注为“+++”；4级，L≥20 mm以上，标注为“++++”。
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球茎接种同1.2.2，对照接种无菌水，设置3次重复。叶柄接种：选择生长健壮的叶柄，流水冲净，75%酒精表面消毒，吹干后用灭菌刀切开，每段8 cm左右，将叶柄形态学下端用湿润的无菌棉球包住，放入培养皿，灭菌牙签在中间扎3个小孔，移液枪吸取20 μL菌悬液接种在伤口处，保鲜膜密封，28 ℃培养24 h，对照接种无菌水，设置3次重复。叶片接种：选择生长健壮的叶片，流水冲净，75%酒精表面消毒，吹干后用湿润的无菌棉球包住小叶柄，放入培养皿，灭菌牙签在中间扎3个小孔，移液枪吸取20 μL菌悬液接种在伤口处，保鲜膜密封，28 ℃培养24 h，对照接种无菌水，设置3次重复。
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提取病原菌菌株DNA，利用细菌16S rDNA通用引物27F/1492R(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGGCTACCTTGACGACTT)[16]进行PCR扩增。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收纯化产物后送测序。将测序结果进行BLAST比对，下载相关同源序列，利用MEGA11软件并采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，明确病原菌菌株的分类地位。
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挑取菌株单菌落在NA培养基上划线，放置在28 ℃培养箱中培养24 h，观察菌落形态、颜色等特征，进行革兰氏染色鉴别菌株，在扫描电子显微镜下进一步观察病原菌的形态特征。
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选取新鲜无病害的芋、番薯、马铃薯、芹菜、胡萝卜、白萝卜、白菜7种不同植物的根茎、块根、块茎、茎或叶进行试验。材料用流动的水冲洗干净，75%酒精表面消毒，番薯、马铃薯、芋、白菜切成3 cm×2.5 cm×0.5 cm的方块，胡萝卜和白萝卜分别切成0.5 cm的圆片和三角片，芹菜切成8 cm长的小段。将切好的材料放进含有无菌滤纸的培养皿中，加入2 mL无菌水保湿，用灭菌牙签在中央扎3个小孔，移液枪吸取20 μL菌液接种在伤口处，保鲜膜密封，28 ℃培养24 h，观察发病情况。对照接种无菌水，设置3次重复。
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采用抑菌圈法[18]进行测定，提前制备OD≈0.6的菌悬液并用无菌水配制6个不同浓度的药液。将药液同样配成6个不同浓度。配制LB固体培养基并灭菌，待温度降到45 ℃左右倒板，每皿20 mL，培养皿凝固晾干后用一次性无菌棉签蘸取菌悬液涂板备用，在平板中间用直径0.65 cm的打孔器打孔，吸取50 μL药液加入，密封后28 ℃培养24 h。对照加入无菌水，设置3次重复。抑菌圈直径采用十字交叉法测量并计算药液抑制率，使用DPS 9.01进行毒力回归方程计算，并比较不同杀菌剂的抑制中浓度(EC50)。
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依据1.2.7试验结果进行药剂复配最佳组合筛选，分别配制各药剂母液，浓度为50倍EC50，按照0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0的比例混合，同样采用抑菌圈法测定。培养结束后测量抑菌圈直径，计算实际抑制率、理论抑制率、毒效比率，按照毒效比率＜1为拮抗作用、毒效比率=1为相加作用、毒效比率＞1为增效作用的标准进行评定[19]。
理论抑制率(%)=单剂A实际抑制率×单剂A所占比例+单剂B实际抑制率×单剂B所占比例
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用无菌水配制浓度为50倍EC50的药液，按照1.2.8中有增效作用的比例进行混合配成母液，2倍稀释法稀释成5个浓度梯度，按照1.2.7方法进行抑菌圈试验，得到毒力回归方程和EC50。依据Wadley法[20-21]进行药剂增效作用评价，即当SR＞1.5时为增效作用，0.5≤SR≤1.5时为相加作用，SR＜0.5时为拮抗作用。
增效系数(SR)的计算公式：
式中：A、B为杀菌剂在混剂中的比例；EC50(A)、EC50(B)为单剂抑制中浓度；EC50(TH)为理论抑制中浓度；EC50(OB)为实际抑制中浓度。
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试验数据整理用Excel 2016进行，使用DPS 9.01计算毒力回归方程，使用SPSS 26.0并采用Duncan's新复极差法进行差异显著性分析。
1.1. 试验材料
1.1.1. 供试材料
1.1.2. 供试培养基
1.1.3. 供试药剂
1.2. 试验方法
1.2.1. 病原菌分离纯化
1.2.2. 菌株致病性初步鉴定
1.2.3. 病原菌致病性鉴定
1.2.4. 病原菌分子生物学鉴定
1.2.5. 病原菌形态学鉴定
1.2.6. 病原菌寄主范围测定
1.2.7. 单药剂对魔芋软腐病病原菌XM-6抑制作用测定
1.2.8. 复配药剂对魔芋软腐病病原菌XM-6抑制作用测定
1.2.9. 复配药剂对魔芋软腐病病原菌XM-6的协同增效作用
1.3. 统计分析
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本试验共分离24株菌株，命名为XM-1~XM-24。接种试验结果表明，有2株菌株存在致病性，接种后球茎出现水浸状腐烂并散发恶臭，菌株XM-6的致病能力强于菌株XM-7，菌株XM-6致病能力表现为4级，菌株XM-7为3级(表 3)。科赫氏法则验证结果显示，接种后发病球茎中分离出的菌株与接种菌株一样，证明接种菌株为魔芋软腐病致原菌。
菌株XM-6和菌株XM-7致病性鉴定试验表明，接种24 h后魔芋球茎、叶柄和叶片(图 1b、c、e、f、h、i)都出现明显的发病情况，组织软化腐烂，并散发恶臭，且叶片和叶柄的发病速度比球茎快，对照组无发病症状(图 1a、d、g)。菌株XM-6在球茎、叶片和叶柄上的发病面积与严重程度均高于菌株XM-7，因此，后续室内药剂筛选试验以菌株XM-6为研究对象。
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菌株XM-6和菌株XM-7的16S rDNA序列长度均为1 404 bp，序列相似性为99%，GenBank登录号分别为PV361861、PV361862。将测序结果进行BLAST比对，发现菌株XM-6和菌株XM-7的16S rDNA序列与已报道的标准菌株Pectobacterium aroidearum strain SCRI 109(NR159926.1)同源性最高，分别为99.86%、99.93%。以Dickeya fangzhongdai strain M1L1 (MT613400.1)为外群构建系统发育树(图 2)，结果表明菌株XM-6和菌株XM-7与P. aroidearum strain SCRI 109、P. aroidearum strain SCRI 3、P. aroidearum strain CCRMPA102、P. aroidearum聚集在一个类群，因此菌株XM-6和菌株XM-7初步鉴定为Pectobacterium aroidearum。
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菌株XM-6和XM-7经28 ℃培养24 h后在NA培养基上都呈乳白色圆形，表面光滑、边缘齐整(图 3a、b)，革兰氏染色结果为阴性(图 3c、d)。菌株XM-6在扫描电镜下呈短杆状，菌体直或稍弯曲(图 3e)，符合Pectobacterium aroidearum的形态特征。
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菌株XM-6和菌株XM-7对所选的7种作物均存在致病性，接种病原菌培养24 h后，芹菜(Apium graveolens)、胡萝卜(Daucus carota)、番薯(Ipomoea batatas)、马铃薯(Solanum tuberosum)、芋(Colocasia esculenta)、白萝卜(Raphanus sativus)、白菜(Brassica rapa)都有不同程度的发病(图 4)，表现出水浸状病斑，组织软化溃烂并伴有浓烈的臭味。
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供试的6种生物农药中有3种对菌株XM-6有抑制效果(表 4)，分别是1%申嗪霉素SC(抗生素杀菌剂)、1%香芹酚AS(植物源杀菌剂)和0.5%大黄素甲醚AS(植物源杀菌剂)；供试的8种化学农药中有4种对菌株XM-6有抑制作用(表 5)，分别是80%福美双WG、3%噻霉酮ME、6%春雷霉素AS和50%咪鲜胺SC。将上述有抑制作用的药剂进行EC50测定，在生物农药中，1%香芹酚AS抑制活性最好，EC50为58.959 8 mg/L；1%申嗪霉素SC和0.5%大黄素甲醚AS抑制活性相差不大，EC50分别为306.545 5 mg/L、326.263 6 mg/L，但1%申嗪霉素SC在低浓度时无抑制作用(表 6)。在化学农药中，80%福美双WG抑制活性最好，EC50为10.863 3 mg/L，其次是EC50为35.576 9 mg/L的3%噻霉酮ME和EC50为112.133 9 mg/L的6%春雷霉素AS，50%咪鲜胺SC对菌株XM-6最不敏感(表 6)。
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根据单剂测定结果，选择EC50低的药剂按不同比例进行复配，即生物农药1%香芹酚AS与化学农药80%福美双WG、3%噻霉酮ME分别进行复配。毒效比率测定结果如表 7，1%香芹酚AS∶80%福美双WG(2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1)以及1%香芹酚AS∶3%噻霉酮ME(6∶4、8∶2、9∶1)的复配组合毒效比率大于1，具有增效作用，其他组合均表现相加或拮抗作用。
在确定最佳组合的基础上，根据Wadley法评价复配药剂的增效作用(表 8)，1%香芹酚AS∶80%福美双WG(8∶2、9∶1)有增效作用，增效系数(SR)分别是1.55、2.19；1%香芹酚AS∶3%噻霉酮ME(9∶1)有增效作用，增效系数(SR)是1.89。除1%香芹酚AS∶80%福美双WG(2∶8、3∶7)和1%香芹酚AS∶3%噻霉酮ME(6∶4)为拮抗作用外，其余的组合均为相加作用。
2.1. 病原菌分离与鉴定
2.1.1. 病原菌分离及致病性鉴定
2.1.2. 病原菌分子生物学鉴定
2.1.3. 病原菌形态学鉴定
2.1.4. 魔芋软腐病病原菌XM-6、XM-7寄主范围测定
2.2. 室内防治药剂筛选
2.2.1. 单药剂对魔芋软腐病病原菌XM-6的抑制效果
2.2.2. 复配药剂对魔芋软腐病病原菌XM-6的抑制效果
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近年来，随着分子生物技术在细菌分类中的应用，很多病原菌的分类发生了变化，引起植物软腐病的病原菌也经历了多次变更，原来的欧文氏菌属(Erwinia)被拆分成5个属，其中能产生果胶酶的软腐欧文氏菌群现被归入果胶杆菌属(Pectobacterium)和迪基氏菌属(Dickeya)[22]。果胶杆菌属目前包含19个种，主要是胡萝卜果胶杆菌(P. carotovorum)、黑腐果胶杆菌(P. atrosepticum)、海芋果胶杆菌(P. aroidearum)、山葵果胶杆菌(P. wasabiae)、巴西果胶杆菌(P. brasiliense)等[23]。迪基氏菌属是2005年从后称菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)中分离出来的新属[24]，目前包括12个种。引起魔芋软腐病的病原菌存在多样性，吴金平[25]对收集的33份魔芋软腐病病原菌进行鉴定，发现魔芋软腐病病原菌属于胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(P. carotovorum subsp.carotovorum)和菊果胶杆菌(P. chrysanthemi)，还鉴定了一株新病原菌为肠杆菌科细菌(Enterobacter. sp.)。研究人员对湖北省宜昌市魔芋软腐病病原菌进行分离鉴定，发现主要是P. aroidearum和Dickeya fangzhongdai，其中P. aroidearum占66.7%[26]。还有其他报道也表明魔芋软腐病病原菌为P. carotovorum subsp.carotovorum、P. aroidearum、Dickeya sp.等[27-29]。综上所述，魔芋软腐病致病菌大多属于果胶杆菌属(Pectobacterium)和迪基氏菌属(Dickeya)。本研究经分离纯化得到菌株XM-6和菌株XM-7，它们的16S rDNA序列与已报道的标准菌株P. aroidearum strain SCRI 109(NR159926.1)同源性高达99%以上，在构建的系统发育树中与P. aroidearum明显聚为一个类群，基于形态学及16S rDNA将其鉴定为海芋果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)。Pectobacterium aroidearum一般被认为主要引起单子叶植物患病，但也能侵染其他植物引发细菌性软腐病[30]，在大白菜、红泡椒、马铃薯、西葫芦[31-34]等植物中也有P. aroidearum致病的报道。病原菌寄主范围测定试验也表明分离出的病原菌寄主范围广泛，不仅能侵染魔芋，还能侵染伞形科(Umbelliferae)、旋花科(Ipomoea Batatas)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae Burnett)等多种植物。在实际生产中要注意田间卫生管理，及时清除发病植株残体，避免出现交叉感染，同时，还应注意与非寄主作物轮作，减少病原菌积累等情况。
化学农药作用效果快，适用范围广，用药成本低，目前仍是病害防治的主要手段。生物农药来源广泛，选择性强，且不易产生抗药性，但在当前生产应用中占比依然较少。随着人们环保意识的不断增强，未来生物农药应用会越来越广泛[35]。化学农药和生物农药各有优缺点，将两种类型农药合理混配制成农药混剂，不仅能取长补短起到增效作用，还能减少环境污染，符合可持续发展的要求。本研究进行的室内药剂筛选试验发现生物农药1%香芹酚AS和化学农药80%福美双WG、3%噻霉酮ME对病原菌抑制效果最强，赵青华等[36]研究也表明3%噻霉酮WP对魔芋软腐病病原菌抑制效果较好，80%福美双WG和1%香芹酚AS在防治魔芋软腐病中尚未见报道。1%香芹酚AS是一种植物源杀菌剂，以香芹酚母药加工而成，是天然源的单帖类苯酚，具有抗病毒、抗菌的作用[37]。香芹酚对多种细菌和真菌有抑制作用，在防治马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、辣椒白粉病中表现良好[38-40]。将1%香芹酚AS与其他两种抑制效果好的化学农药合理复配，有望获得高效、安全的用药方案。在复配组合中1%香芹酚AS∶80%福美双WG(8∶2、9∶1)和1%香芹酚AS∶3%噻霉酮ME(9∶1)表现出增效作用，1%香芹酚AS∶80%福美双WG(9∶1)的效果最佳。但药剂在田间的表现还未明确，下一步需开展田间试验对室内筛选结果进行验证。
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本研究从魔芋发病植株中分离纯化出XM-6和XM-7两个魔芋软腐病病原菌，结合形态学及分子生物学鉴定均为Pectobacterium aroidearum，并以菌株XM-6为研究对象筛选出对病原菌有抑制作用的最佳复配药剂组合；在室内药剂筛选中发现1%香芹酚AS∶80%福美双WG(9∶1)表现最佳，增效系数(SR)为2.19。本试验结果为生产上防治魔芋软腐病提供了一定的科学依据。