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宽体金线蛭Whitmania pigra俗称蚂蟥,隶属于环节动物门、蛭纲、真蛭亚纲、无吻蛭目、医蛭形亚目、黄蛭科、金线蛭属,在我国广泛分布,在国外的分布仅见于日本[1-2],经考证,宽体金线蛭属于古代药用水蛭之一[1],其干燥全体为中药材水蛭的主要来源[3],临床上可用于血瘀证[4-5]、高血压[6-8]、动脉粥样硬化[9-12]和糖尿病足[13]等疾病的治疗.
人民对于宽体金线蛭的需求量在日益增加,而其野生资源却濒临枯竭[14],开展较大规模水蛭的人工养殖势在必行.繁殖是水蛭人工养殖中需要面临的关键问题之一,开展水蛭生殖系统形态结构和胚胎发育研究有利于解决这一问题.
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宽体金线蛭种蛭购买于重庆市秀宏水蛭养殖中心.水蛭室内养殖装置自行设计并已获得国家实用新型专利授权.将购买的种蛭放置于自行设计的养殖装置中,定期投喂福寿螺.
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取宽体金线蛭于体视镜(Nikon SMZ25) 下进行解剖,观察其生殖系统结构并拍照.
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取宽体金线蛭进行麻醉、固定、石蜡切片、HE染色,之后于生物显微镜(Nikon ECLIPSE 80i)下拍照.
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取刚产下的宽体金线蛭卵茧进行解剖,倒出其中的受精卵和蛋白液于培养皿(2 cm×2 cm)中进行培养,并置于生物显微镜(Nikon ECLIPSE 80i)和体视镜(Nikon SMZ1000) 下进行观察.
1.1. 宽体金线蛭种蛭的室内人工养殖
1.2. 生殖系统形态学观察
1.3. 生殖系统组织学观察
1.4. 胚胎发育观察
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宽体金线蛭是雌、雄同体,异体受精的动物,其生殖系统包括雄性生殖系统和雌性生殖系统两部分,雄性生殖系统先成熟.
(1) 雄性生殖系统的大体解剖结构
宽体金线蛭雄性生殖系统包括精巢、输精管、贮精囊、射精球、前列腺、阴茎鞘和雄孔几部分(如图 1-a,b).精巢11对,乳白色,球形,表面覆有结缔组织,分别位于12~22节中部神经索两侧,每节1对,对称排列,并发出输出管与输精管相连(如图 1-a,e).每个精巢都发出1条输出管,与同侧的输精管相连.输精管2条,乳白色,纵行于精巢两侧,到第1对精巢前方,各自盘曲环绕形成贮精囊(如图 1-a,e).贮精囊1对,乳白色,表面有丰富的血管环绕,椭球状,位于射精球下方,前列腺两侧,始于第Ⅹ体节,止于Ⅺ或Ⅻ体节,通过输精管与射精球相连(如图 1-d).射精球1对,乳白色,长管状,表面有少量血管存在,位于贮精囊上方,前列腺两侧.末端发出射精管通过前列腺进入阴茎鞘(如图 1-f).前列腺1个,乳白色,膨大呈球形,上有血管环绕.位于Ⅹ-Ⅻ体节间,卵巢上方,与阴茎鞘相连,内有射精管通过(如图 1-g).阴茎鞘1个,乳白色,长管状,通过雄孔开口于体外.雄孔1个,位于第33/34体环环沟中部.雄孔开口呈不平整的长圆形,开口周围由齿状突起组成(如图 1-h).
(2) 雌性生殖系统的大体解剖结构
宽体金线蛭雌性生殖系统包括卵巢、输卵管、蛋白腺、阴道囊和雌孔几部分(图 2-a,b).卵巢1对,卵圆形,内为乳白色的浑浊液体,并含浅黄色物质(图 2-c),位于第11~12体节间,前列腺下方,每个卵巢各发出1条输卵管. 2条输卵管汇合成为总输卵管,通入阴道,在刚汇合部外包有蛋白腺.蛋白腺乳白色,长椭圆形(图 2-b).阴道囊乳白色,似葫芦形,两端较窄,中部较宽,有2个膨大的囊,通过雌孔开口于体外(图 2-a,b).雌孔1个,位于第38/39体环环沟中部,与雄孔相隔5环,雌孔开口处如唇状(图 2-d).
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(1) 雄性生殖系统组织学观察
雄孔由外而内依次为角质膜、上皮和真皮.上皮为单层柱状上皮,细胞核明显,位于基底部;真皮为致密结缔组织(图 3-a,b).精巢外包有薄膜,周围为疏松结缔组织,精巢内可见辐射状的生精小管,在生精小管周围可见初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞及精子(图 3-c,d).输精管由膜包被,内含许多支持细胞(图 3-e,f).贮精囊由管腔组成,管腔壁为薄膜,内含支持细胞和精子,各个管腔之间由疏松结缔组织相连接(图 3-g,h).射精球管壁较厚,由外膜、环肌层和上皮组成,外膜较薄,环肌层较厚,上皮为单层扁平上皮(图 3-g).射精管管壁由外膜、环肌层和假复层柱状上皮组成(图 3-i).前列腺由外膜、肌肉层和上皮组成,外膜较薄,肌肉层由环肌和纵肌交替排列,上皮由单层柱状上皮细胞组成,细胞核位于基底部,肌肉层中有2条射精管通过(图 3-j).阴茎鞘也由外膜、肌肉层和单层扁平上皮组成,肌肉层由环肌和纵肌交替排列,阴茎鞘中含阴茎(图 3-k),阴茎由角质层、肌肉层和上皮组成,肌肉层为环肌,上皮为单层扁平上皮(图 3-l).
(2) 雌性生殖系统组织学观察
雌孔由外而内依次为角质膜、表皮和肌肉层.表皮由柱状表皮细胞组成,细胞核位于基底面,肌肉为纵肌和环肌(图 4-a,b).卵巢由滤泡组成,滤泡壁为薄膜,滤泡腔内含有初级卵母细胞,次级卵母细胞和卵细胞,卵巢由薄膜和疏松结缔组织包被(图 4-c,d,e).输卵管由疏松结缔组织层、环肌层和上皮组成,上皮由单层柱状上皮细胞组成,细胞核位于基底部,环肌层疏松(图 4-f,g,h).蛋白腺也由疏松结缔组织层、环肌层和上皮组成,结缔组织层较厚,环肌层较薄且疏松,上皮由复层柱状上皮细胞组成,细胞核位于游离面(图 4-I,j).阴道囊由外而内依次为结缔组织层、纵肌层、结缔组织层和上皮,结缔组织层为疏松结缔组织,上皮为单层柱状上皮,细胞核位于基底面(图 4-k,l).
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宽体金线蛭环带部的体壁有两类腺体:一类分泌形成卵茧外层的物质;另一类分泌蛋白液,受精卵即悬浮在茧内的蛋白液中.卵茧呈椭圆形,外层是一层蜂窝状、米黄色的保护层(图 5-a,b).内层刚产下时,是一层透明的橄榄绿色薄膜,而后逐渐变硬,变得不透明,并且表面有许多突起,而外层的保护层就粘附在这些突起上(图 5-c).
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宽体金线蛭的受精卵在室温(23~25 ℃)下进行孵化,幼蛭经过约28 d陆续从卵茧中孵出,先后经过受精卵,卵裂,囊胚期,原肠胚期,器官发生期及孵化6个连续阶段.
(1) 受精卵
宽体金线蛭的受精卵外观为乳白色,呈圆球形,卵径大约为100 μm,悬浮于卵茧内的蛋白液中,无法用肉眼分辨出受精卵(图 6-a).
(2) 卵裂期
宽体金线蛭的受精卵产出约3 h后,进行第1次卵裂,进入2细胞期.宽体金线蛭的卵裂方式为完全卵裂中的螺旋卵裂,第1次卵裂在外表上将受精卵分成大小不等的2个细胞,卵裂沟不明显,只在两边有凹陷(图 6-b).受精卵在产出约8 h后,进行第2次卵裂,进入4细胞期.卵裂沟明显,在表面上将受精卵分成大小不等的4个细胞(图 6-c).受精卵产出后约10 h进入6细胞期(图 6-d),约12 h进入8细胞期(图 6-e),约1 d进入多细胞期(图 6-f).胚胎在进入多细胞期前大小无显著性变化,进入多细胞期后直径明显变大,并进行不停的自转运动.
(3) 囊胚期
宽体金线蛭的受精卵产出约3 d后进入囊胚期.在囊胚早期,胚层隆起,大小约占胚胎直径的1/3,各细胞间界限明显(图 6-g);随着细胞继续分裂,进入到囊胚中期,此时胚层变薄并下降,大小约占胚胎直径的2/3,胚胎直径变大,各细胞间无显著界限(图 6-h);在囊胚晚期,胚层继续变薄和下降,几乎占据了整个胚胎,胚胎直径无显著变化(图 6-i).在整个囊胚期,胚胎不停地进行变形运动.
(4) 原肠胚期
宽体金线蛭的受精卵产出约5 d后进入原肠胚期.在原肠胚期,胚胎大小发生明显变化,同时胚胎形状也发生显著变化,由原来的圆球形逐渐变为梭形,具有宽体金线蛭幼蛭的初步形状,且胚胎的变形运动加剧(图 6-j,k).
(5) 器官分化期
宽体金线蛭的受精卵产出约10 d后,开始进行器官和系统分化,从外形上隐约可看出消化系统形态(图 6-l).
(6) 幼蛭
宽体金线蛭的受精卵产出约28 d左右,幼蛭陆续从卵茧中孵出.每个卵茧能孵出20条左右幼蛭.幼蛭刚孵出时,背面呈黄褐色,较成体颜色浅,并呈现出一定的透明度,长度约为15 mm,宽度约为2 mm(图 6-m,n,o).
2.1. 生殖系统形态结构
2.1.1. 生殖系统形态学观察
2.1.2. 生殖系统组织学观察
2.2. 胚胎发育过程
2.2.1. 卵茧形态及特征
2.2.2. 胚胎发育时期及特征
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宽体金线蛭是一种大型水蛭,体长一般为60~130 mm,体宽一般为13~22 mm[2],大都活动在沿岸和浅水区域,除越冬期外很少在较深的水底出现[15].和蛭纲其他动物一样,宽体金线蛭也是雌、雄同体,含有雌、雄两性生殖系统.与蛭纲其他动物相比较,其生殖系统除精巢外,其他生殖器形态和数目相同,只是所处环数略有不同,如宽体金线蛭雄孔位于33/34环沟、雌孔位于38/39环沟;尖细金线蛭雄孔位于35环、雌孔位于40环;菲牛蛭雄孔位于31/32环沟、雌孔位于36/37环沟.精巢形态也相似,只是数目不同,如宽体金线蛭有11对精巢;尖细金线蛭有10对;宽身舌蛭有6对[2].目前,关于宽体金线蛭生殖系统形态学的研究少之又少,仅见王熙宇[16]对其进行过描述,但未见其形态学照片.本文对宽体金线蛭进行了解剖,并对其生殖系统进行了观察和拍照,以期丰富其形态学数据.
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宽体金线蛭行异体生殖,交配大多在清晨进行,交配时以彼此的雄性生殖孔对着对方的雌性生殖孔.按理说,由于彼此的雌、雄孔互对,可以互相交换精子,但事实上大多数是由一方单方面输送精子给对方的[17].亲体交配1个月左右时开始产卵茧,产卵茧时宽体金线蛭钻入土中,由环带部特有的一类腺体分泌一种白色泡沫状物质,形成卵茧蜂窝状的外层,再分泌一种橄榄色的粘稠液体形成卵茧内壁,然后亲体将受精卵产在卵茧内,并由环带部特有的另一类腺体分泌蛋白液于卵茧中,受精卵悬浮于蛋白液中.此后身体慢慢向后移动,并由前吸盘腺体分泌的液体形成的栓塞住茧前后两端的开孔.整个产茧过程历时30 min左右.卵茧在产下28 d左右时,卵茧开始孵化,每个卵茧能孵出13~35条幼蛭,平均20条左右[15, 18-19].
宽体金线蛭卵茧外表面呈蜂窝状,内层是胶质状软壳,这些可能与降低卵茧水分蒸发有关.受精卵呈乳白色,圆球形,直径约100 μm,卵裂方式为螺旋卵裂,经过28 d左右,先后经历卵裂,囊胚期,原肠胚期,器官发生期及孵化阶段,逐渐孵出卵茧,发育成为宽体金线蛭幼体,其中器官发生期耗时最长.目前尚未见到有关水蛭胚胎发育的文章,希望本文能为水蛭研究提供一定的理论依据.