Let-7a负性调控人肾上皮细胞293T中UHRF1基因的表达

文利; 彭睿; 孙艳; 武天慧; 彭惠民; 张政

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2017.07.012

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Let-7a负性调控人肾上皮细胞293T中UHRF1基因的表达

1.
重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室，重庆 400016

2.
重庆医科大学生物信息学教研室，重庆 400016

3.
重庆医科大学实验教学中心，重庆400016

基金项目: 国家自然科学基金面上项目(81270912)

详细信息

作者简介:
文利(1989-)，女，重庆忠县人，硕士，主要从事细胞生物学及遗传学研究 .

通讯作者: 张政，副教授

中图分类号: Q813

MicroRNA Let-7a Negatively Regulates the Expression of UHRF1 in Human Renal Epithelial Cells 293T

1.
Department of Cell Biology and Genetics, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

2.
Department of Bioinformatics, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

3.
Experimental Teaching Center, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

摘要:

目的探讨人肾上皮细胞293T中let-7a对靶基因UHRF1的负性调控作用.

方法运用生物信息学技术对let-7a靶基因进行预测和分析.构建含有UHRF1 3'UTR全长的野生型(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt)和突变型荧光素酶报告质粒(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut)，分别将pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt，pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut，pmiR-RB-REPORT vector与let-7a mimics或mimics control共转染293T细胞，双荧光素酶报告系统检测转染后293T细胞的荧光素酶表达水平. 293T细胞分别转染let-7a mimics和inhibitor，western blot和real-time RT PCR检测UHRF1基因的表达.

结果生物信息学结果显示let-7a有48个预测靶基因，包括UHRF1，HMGA2，MAPK6等，主要涉及microRNA在肿瘤、细胞周期、PI3K-AKT、p53等信号通路.其中UHRF1 3'UTR含有一个let-7a的结合位点，且在多个物种中呈高度保守.进一步双荧光素酶检测发现，共转染let-7a mimics和pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt的293T细胞荧光素酶活性显著降低(p＜0.01). Western blot和real-time RT PCR结果显示转染let-7a mimics的293T细胞UHRF1表达降低，而转染let-7a inhibitor的293T细胞UHRF1表达增高.

结论人肾上皮细胞293T中let-7a能通过与UHRF13'UTR靶向结合，负性调控UHRF1的表达.

关键词:

微RNA /
UHRF1 /
基因表达

Abstract:

ObjectiveTo explore the negative regulatory effect of let-7a on the expression of UHRF1 in human renal epithelial cells 293T.

MethodsBioinformatics methods were used for let-7a target prediction and analysis. The full length wild type of UHRF1-3' (pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt) and the mutant type (pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut plasmid) were constructed, and the 293T cells were co-transfected with pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt or pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut plasmid or pmiR-RB-REPORT vector with let-7a mimics or mimics control intervention. Luciferase expression level of the 293T cells was detected by the dual luciferase reporter assay system. Western blot and real-time RT PCR were used to detect the expression of UHRF1 gene in the 293T cells which had been transfected with let-7a mimics or inhibitor.

ResultsBioinformatics analysis indicated that let-7a contained 48 potential target genes including UHRF1、HMGA2 and MAPK6, which were mainly involved in the signaling pathways of cancer, cell cycle, PI3K-AKT and p53. Among these targets, UHRF1 was found to contain a phylogenetically conserved binding site with let-7a. Furthermore, dual luciferase reporter displayed that luciferase activity in 293T transfected with let-7a mimics and pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt intervention was significant decreased (p < 0.01). Moreover, western blot and real-time RT PCR demonstrated that the expression of UHRF1 declined in let-7a over-expressed 293T cells, while the expression of UHRF1 was enhanced in let-7a down-expressed 293T cells.

ConclusionLet-7a negatively regulates the expression of UHRF1 in human renal epithelial cells 293T through binding UHRF13'UTR.

Key words:

microRNA (miRNA) /
UHRF1 /
gene expression .

Let-7a负性调控人肾上皮细胞293T中UHRF1基因的表达

通讯作者: 张政，副教授

作者简介: 文利(1989-)，女，重庆忠县人，硕士，主要从事细胞生物学及遗传学研究
1. 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室，重庆 400016

2. 重庆医科大学生物信息学教研室，重庆 400016

3. 重庆医科大学实验教学中心，重庆400016

收稿日期: 2016-09-23

基金项目: 国家自然科学基金面上项目(81270912)

关键词:

微RNA /
UHRF1 /
基因表达

摘要:

目的探讨人肾上皮细胞293T中let-7a对靶基因UHRF1的负性调控作用.

结论人肾上皮细胞293T中let-7a能通过与UHRF13'UTR靶向结合，负性调控UHRF1的表达.

MicroRNA Let-7a Negatively Regulates the Expression of UHRF1 in Human Renal Epithelial Cells 293T

¹,

²,

¹,

³,

^1,

Corresponding author: Zheng ZHANG

1. 重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室，重庆 400016

2. 重庆医科大学生物信息学教研室，重庆 400016

3. 重庆医科大学实验教学中心，重庆400016

Received Date: 2016-09-23

Keywords:

微RNA /
UHRF1 /
基因表达

Abstract:

ObjectiveTo explore the negative regulatory effect of let-7a on the expression of UHRF1 in human renal epithelial cells 293T.

ConclusionLet-7a negatively regulates the expression of UHRF1 in human renal epithelial cells 293T through binding UHRF13'UTR.

全文HTML

微RNA(MicroRNA，miRNA)let-7自从被发现后，其在疾病中的作用引起广泛关注.在人类基因组中存在12个由let-7同源基因家族编码的miRNA分子，分别为let-7a-1，a-2，a-3，7b，7c，7d，7e，f7-1，f7-2，7g，7i，Mir-98，其序列具有高度的保守性，在肿瘤、内分泌等疾病中发挥作用.新近的研究报道，let-7家族与肾脏疾病关系密切，let-7a和let-7c在肾透明细胞癌患者中呈低表达，let-7g和let-7i在肾透明细胞癌患者中呈高表达，并与患者的愈后相关联^[1-2]，Let-7b和let-7c在肾细胞癌患者中呈低表达，并与5-氟尿嘧啶治疗的耐药性产生相关性^[3]，let-7b靶向GALNT2调控IgA肾病^[4]，Let-7b通过靶向作用于TGFBR1调控TGF-β1诱导的肾纤维化^[5].同时本课题组前期研究通过芯片和real-time PCR检测发现在糖尿病肾病患者中循环let-7a呈低表达，参与疾病的发生^[6].因此let-7a可能是肾脏疾病发生发展的因素之一，但其确切机制目前仍不清楚.

miRNA种子序列与靶基因3'UTR序列的互补结合是miRNA发挥生物学功能的重要方式之一，参与疾病的病理生理过程.因此，我们以人肾上皮细胞293T为研究对象，综合运用生物信息学方法和实验室手段，分析let-7a的一个靶基因UHRF1.

1. 材料与方法

1.1. 主要材料

Escherichia coli DH5α和人肾上皮细胞293T由本实验室保存.荧光素酶报告载体pmiR-RB-REPORT vector购自广州锐博生物科技有限公司；let-7a mimics，inhibitor及对照购自上海吉玛制药技术有限公司；双荧光素酶报告系统检测试剂盒购自Promega公司；各种限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Trizol和LipofectamineTM 2000脂质体购自Invitrogen公司；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Hyclone公司；UHRF1抗体和β体actin抗体购自Santa Cruz公司.引物合成和测序由上海生工生物技术有限公司进行.

1.2. let-7a靶基因生物信息学分析

运用microRNA靶基因预测软件TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRTarBase(http://www.mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)和RepTar(http://bioinformatics.ekmd.huji.ac.il/reptar)预测let-7a的靶基因.在本研究中，至少来源于2个软件的基因才被考虑为let-7a的潜在靶基因.应用Cytoscape^[7]的插件BiNGO^[8]，对预测到的靶基因做GO(Gene Ontology)过度表达分析.从Gene Ontology Consortium^[9]的网站下载基因本体和人类基因组GO注释的数据.其中，GO采用最基本的版本(go-basic.obo)，过度表达分析采用超几何测试和Bonferroni校正，以全基因组为参考.

1.3. UHRF13'UTR野生型与突变型质粒的构建

根据人的UHRF1基因3' UTR序列(GenBank，NM_001048201) 设计上、下游引物：UHRF1-wt-F：5'-CCGCTCGAGTCTCCAAGCACTTCTCGACA-3'；UHRF1-wt-R：5'-GAATGCGGCCGCTCTATCTGTGAAAAACATTTATTCTGAGAA-3'.以293T细胞株基因组DNA为模板，按照TaKaRa生物有限公司提供的PCR试剂盒扩增UHRF1基因3'UTR序列.将PCR产物和荧光素酶报告载体pmiR-RB-REPORT vector分别用Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，回收目的基因和载体片段，以T4连接酶16 ℃连接过夜12 h并将产物转化感受态DH5α细胞，提取质粒验证获得野生型重组质粒pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt.根据let-7a种子序列与UHRF1基因3' UTR序列结合位点设计突变引物，UHRF1-3'-UTR-mut上游：5'-GGGTTTGTTAATTTTTCTAATTTTACCAAAGTTTGCAGCCTAGCTTGTCATAAAACAGGGATATTTTAAATCACATACCTGCAGACAAACT-3'；下游：5'-AGTTTGTCTGCAGGTATGTGATTTAAAATATCCCTGTTTTATGACAAGCTAGGCTGCAAACTTTGGTAAAATTAGAAAAATTAACAAACCC-3'.测序验证构建质粒.

1.4. 细胞培养和瞬时转染

293T细胞接种于100 mL细胞培养瓶，用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的DMEM高糖培养基在37 ℃，5% CO₂条件下培养，每2~3 d换液. 239T细胞分为下列4个组：let-7a组(细胞转染let-7a mimics)、对照组(细胞转染mimics control)、无处理组及let-7a抑制组(细胞转染let-7a inhibitor).待细胞生长到80%左右，按照脂质体LipofectamineTM 2000试剂盒说明书将let-7a mimics，mimics control和let-7a inhibitor转染至293T细胞，4~6 h后更换新鲜的DMEM培养基，24~48 h后收集各组细胞.

1.5. 双荧光素酶报告系统检测

将293T细胞按照每孔4×10³个细胞种植于96孔板，然后按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt (200 ng/mL)，pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut (200 ng/mL)，pmiR-RB-REPORT vector (200 ng/mL)及let-7a mimics (50 nmol/L)转染至293T细胞.转染48 h后，裂解各组细胞，按Dual Glo Luciferase Assay System说明书操作，以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示各组细胞的荧光强度.

1.6. Real-time PCR

采用Trizol法提取细胞和血液总RNA.采用PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行逆转录反应. UHRF1引物，上游：5'-ATCTCGGGTGGGGTTTTTCC-3'；下游：5'-ATGCTCTAAGGAGTCGGGGT-3'.逆转录反应总体系20 μL，其中5x gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 1 μg，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5x PrimeScript Buffer 4 μL，加RNase Free dH₂O至20 μL.逆转录反应条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃放置.实时定量反应总体系20 μL，其中SYBR@ Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus)10 μL，Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，RT products 1.6 μL，dH₂O 6.8 μL.反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环.每个检验指标做3个复孔.以β-actin作为内参，用2^-ΔΔCT法相对定量UHRF1的表达水平.

1.7. Western blot检测

按试剂盒说明书操作提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白质总含量.根据目的蛋白相对分子质量用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，200V转膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，按照一抗说明书稀释抗体，4 ℃过夜12 h孵育；TBST漂洗3次，二抗孵育90 min，TBST洗涤3次，ECL化学放光法曝光条带，Quantity One软件采集图像并分析.

1.8. 统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件分析，实验数据以±s表示，多组数据使用单因素方差分析，组内比较用Dunnett-t检验.

3. 讨论

近年来，随着microRNAs数据的不断增加，这一类小RNA分子为我们提供了一个全新的角度来认识基因和基因表达调控的本质.文献报道miRNA在多种疾病包括肾脏疾病中表达异常，比如Mir-21和Mir-210在肾透明细胞癌表达上调，Mir-141，Mir-200c和Mir-429表达下调^[10]，MiR-21，miR-192和miR-433在TGF-β1诱导的肾纤维化中具有协同促进作用，而miR-29和miR-200家族则具有抑制效应^[11].以上均提示在肾脏疾病的发生发展中，miRNA扮演了重要角色.因此，我们选择进一步研究let-7a在肾病中的生物学功能.

尽管目前有很多microRNA靶基因预测软件，但由于这些软件所采用的计算方式在某些细节上存在差异，导致各个软件的预测结果并不完全一致^[12].而且，经生物信息学预测所得的靶基因必须经过实验室研究验证.在本研究中，我们运用microRNA靶基因预测软件TargetScan，miRTarBase和RepTar^[13]预测let-7a的靶基因，共有48个至少在2个软件有交集的基因作为let-7a的预测靶基因.进一步运用生物信息学技术对let-7a的预测靶基因进行功能富集性分析. GO分析结果显示这些靶基因在细胞成分、分子功能、生物过程中参与了诸多生理过程. KEGG分析结果显示有21条信号通路包含3个或以上的let-7a预测靶基因，主要涉及microRNA在细胞周期、PI3K-AKT、p53等信号通路.在这些预测靶基因中，UHRF1引起了我们的注意.最近的研究发现，UHRF1通过一种独特的半甲基化CpG结合活性，将DNMT1召集到DNA复制叉周围，维持DNA的甲基化^[14]，UHRF1通过结合K9甲基化或甲基化DNA，能有效定位到异质染色体上，并在异质染色体的形成与维持中起重要作用^[15].

本实验通过生物信息学技术发现UHRF1基因的3'UTR含有一个let-7a的结合位点，其与let-7a的5'端第2~8位碱基序列，即“种子序列”完全互补，而且该UHRF1基因3' UTR结合位点在多个物种(包括人类、黑猩猩、恒河猴、兔、猪等)的基因组中高度保守.因此，UHRF1基因是较好的Let-7a预测靶基因.为证实let-7a与UHRF1是否存在直接靶向作用，我们构建了UHRF1-3'UTR-wt和UHRF1-3'UTR-mut的荧光素报告载体质粒进行荧光素酶活性检测.结果显示，过表达let-7a可抑制UHRF1-3'UTR-wt荧光素酶活性，提示let-7a可与UHRF1 3'UTR上的互补位点结合，从而抑制目的基因的表达.接下来，我们在293T细胞中转染let-7a mimics和inhibitor使之高表达和低表达let-7a，通过Western blot和real-time RT PCR检测结果显示，在293T细胞中let-7a组UHRF1蛋白和mRNA表达量明显降低，而let-7a inhibitor组，UHRF1蛋白和mRNA表达水平上调，表明let-7a可负性调控UHRF1基因的表达，是let-7a的一个靶基因.

本研究从生物信息学手段和实验室证据两方面来探讨let-7a对UHRF1的靶向调控作用，后者建立在前者的基础之上.该研究可为我们提供更丰富的关于let-7a参与转录或转录后调控机制的有关信息，而后续对其靶基因UHRF1的下游效应研究，将为深入认识let-7a的生物学功能提供重要启示.

参考文献 (15)

[1]	GOWRISHANKAR B, IBRAGIMOVA I, ZHOU Y, et al. MicroRNA Expression Signatures of Stage, Grade, and Progression in Clear Cell RCC [J]. Cancer Biol Ther, 2014, 15(3): 329-341. doi: 10.4161/cbt.27314
[2]	HEINZELMANN J, HENNING B, SANJMYATAV J, et al. Specific miRNA Signatures Are Associated with Metastasis and Poor Prognosis in Clear Cell Renal Cell Carcinoma [J]. World J Urol, 2011, 29(3): 367-373. doi: 10.1007/s00345-010-0633-4
[3]	PENG J, MO R, MA J, et al. let-7b and let-7c are Determinants of Intrinsic Chemoresistance in Renal Cell Carcinoma [J]. World J Surg Oncol, 2015, 13(1): 1-8. doi: 10.1186/1477-7819-13-1
[4]	SERINO G, SALLUSTIO F, CURCI C, et al. Role of let-7b in the Regulation of N-Acetylgalactosaminyltransferase 2 in IgA Nephropathy [J]. Nephrol Dial Transplant, 2015, 30(7): 1132-1139. doi: 10.1093/ndt/gfv032
[5]	WANG B, JHA J C, HAGIWARA S, et al. Transforming Grouth Factor-β1-Mediated Renal Fibrosis is Dependent on the Regulation of Transforming Growth Factor Receptor 1 Expression by let-7b [J]. Kidny Int, 2014, 85(2): 352-361. doi: 10.1038/ki.2013.372
[6]	ZHOU J, PENG R, LI T, et al. A Potentially Functional Polymorphism in the Regulatory Region of let-7a-2 is Associated with an Increased Risk for Diabetic Nephropathy [J]. Gene, 2013, 527(2): 456-461. doi: 10.1016/j.gene.2013.06.088
[7]	MAERE S, HEYMANS K, KUIPER M. BiNGO: a Cytoscape Plugin to Assess Overrepresentation of Gene Ontology Categories in Biological Networks [J]. Bioinformatics, 2005, 21(16): 3448-3459. doi: 10.1093/bioinformatics/bti551
[8]	EPPIG J T, HARRIS M A, HILL D P, et al. Gene Ontology: Tool for the Unification of Biology. The Gene Ontology Consortium [J]. Nat Genet, 2000, 25(1): 25-29. doi: 10.1038/75556
[9]	LEE R C, FEINBAUM R L, AMBROS V. The C. Elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity to lin-14 [J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854. doi: 10.1016/0092-8674(93)90529-Y
[10]	doi: https://www.researchgate.net/publication/276358670_Prognostic_value_of_meta-signature_miRNAs_in_renal_cell_carcinoma_An_integrated_miRNA_expression_profiling_analysis TANG K, XU H. Prognostic Value of Meta-Signature miRNAs in Renal Cell Carcinoma: an Integrated miRNA Expression Profiling Analysis [J]. Sci Rep, 2015(5): 10272-10284.
[11]	doi: https://www.researchgate.net/publication/273323766_MicroRNAs_in_renal_fibrosis CHUNG A C, LAN H Y. MicroRNAs in Renal Fibrosis [J]. Frontiers in Physiology, 2015(6): 50.
[12]	AMBROS V. The Functions of Animal MicroRNAs [J]. Nature, 2004, 431(7006): 350-355. doi: 10.1038/nature02871
[13]	doi: https://www.researchgate.net/profile/Jens_Allmer/publication/258856319_Computational_Methods_for_MicroRNA_Target_Prediction/links/0deec53c68857801be000000.pdf?inViewer=true&pdfJsDownload=true&disableCoverPage=true&origin=publication_detail EKIMLER S, SAHIN K. Computational Methods for MicroRNA Target Prediction [J]. Genes (Basel), 2014, 5(3): 671-683.
[14]	SHARIF J, MUTO M, TAKEBAYASHI S, et al. The SRA Protein Np95 Mediates Epigenetic Inheritance by Recruiting Dnmt1 to Methylated DNA [J]. Nature, 2007, 450(7171): 908-912. doi: 10.1038/nature06397
[15]	doi: https://www.researchgate.net/profile/Haruhiko_Koseki2/publication/235797069_UHRF1_targets_DNMT1_for_DNA_methylation_through_cooperative_binding_of_hemi-methylated_DNA_and_methylated_H3K9/links/57d7672f08ae601b39ac2dac.pdf?origin=publication_detail LIU X, GAO Q, LI P, et al. UHRF1 Targets DNMT1 for DNA Methylation Through Cooperative Binding of Hemi-Methylated DNA and Methylated H3K9 [J]. Nature Communications, 2013, 4(3): 1563.

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