下载:
-
颠茄Atropa belladonna L.，俗名“野山茄”，属茄科颠茄属的一个种，多年生草本植物，全草入药[1].颠茄味微苦、辛，气微，主要有效成分为莨菪碱和东莨菪碱等.其制剂广泛应用于临床，有解除平滑肌痉挛，缓解各种内脏绞痛，抑制腺体分泌和对抗迷走神经兴奋所致的心律失常等功效[2].
由于颠茄具有很高的药用价值，自引入中国以来，在我国的种植面积不断扩大，大多集中在山东、浙江、北京、上海等地，而这些地区多属于我国东部滨海盐土地区，颠茄的生长易受到盐土逆境胁迫的影响，造成其生长代谢减缓，严重时可导致死亡.因此，如何提高颠茄在盐碱土地中的生存能力，并保证其药用成分的产量为本研究的重点.多胺(polyamines，PAs)是一类低分子质量脂肪族含氮碱，在植物生长、形态建成、防止衰老和抵抗环境胁迫等方面起重要作用.植物体内的PAs主要包括腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)等，已有研究表明Spd与逆境胁迫抗性关系更为密切，其在植物抗逆性中不仅作为胁迫保护物质，而且在胁迫信号转导中可作为信号分子，有利于植物胁迫抗性机制的构建[3-5].本试验采用向叶片外源喷施Spd溶液的方法，研究在盐胁迫下，外源Spd对颠茄所受伤害起到的缓解作用，为提高颠茄抗盐能力和其主要生物碱质量分数提供一定的理论依据.
全文HTML
-
颠茄种子购买于湖南永州，经西南大学生命科学学院吴能表教授鉴定为颠茄Atropa belladonna L.的成熟种子.挑选颗粒饱满的颠茄种子浸泡于50 mmol/L的赤霉素溶液中，2 d后取出，将其均匀平铺在湿润的滤纸上待萌发，期间滤纸保持湿润.一周后将萌发的种子移栽到盛有充分混匀介质(泥炭土：珍珠岩：蛭石=3：1：1)的营养袋(12 cm×13 cm)中，每盆5株，在温室(20±1 ℃)中培养，当颠茄幼苗长至6片真叶时开始处理.
试验共有以下几种处理方式：空白对照(CK1)，NaCl对照(CK2)，NaCl+Spd处理(T1-T4). CK2及T1-T4组浇灌浓度为100 mmol/L NaCl溶液，至有液体从营养袋底部小孔流出为止，CK1组则浇灌等量蒸馏水.同时T1-T4组每天喷施Spd溶液于叶片表面至液滴欲滴，Spd溶液浓度分别为0.1 mmol/L，0.3 mmol/L，0.5 mmol/L，0.7 mmol/L，CK1和CK2叶片则喷施等量蒸馏水.每个处理均设置3个重复，15 d后测定颠茄叶片的叶绿素荧光参数，叶绿素、MDA、可溶性糖、SP和Pro质量分数，POD和SOD活性，并提取颠茄干物质中的生物碱，测定莨菪碱和东莨菪碱质量分数.
-
叶绿素质量分数的测定参照张宪政[6]的方法，MDA质量分数的测定参照Velikova等[7]的硫代巴比妥酸(TBA)检测法，可溶性糖质量分数参照刘海英等[8]的方法测定，SP的测定参照Bradford[9]等的方法，Pro质量分数的测定采用酸性茚三酮法[10]，POD和SOD活性的测定分别采用愈创木酚法[11]和张以顺等[12]的方法.
叶绿素荧光参数测定利用PAM-2100荧光仪(Walz，德国)预先编好的程序RUN3进行测定，天黑后将颠茄幼苗暗处理40 min，然后开始测定初始荧光(F0)，最大荧光产量(Fm)，最大光化学效率(Fv/Fm)，实际光合效率(Yield)，光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(NPQ).
生物碱提取与HPLC检测参照Wang等[13]发表的方法，颠茄叶片烘干后研磨成粉，提取托品烷生物碱，用HPLC检测莨菪碱和东莨菪碱质量分数，标准品均购于Sigma公司. HPLC检测使用岛津LC-20AT高效液相色谱仪，色谱条件：Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.05 mol/L，pH=4.0乙酸铵缓冲液(流动相体系包含0.1%甲酸)，流速1 mL/min，柱温箱40 ℃，检测波长226 nm，进样量10 μL.
-
采用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0对数据进行统计整理和方差分析，Origin 8绘图.数据均以x±s表示.
1.1. 材料
1.2. 方法
1.3. 数据分析
-
NaCl处理使颠茄叶片中的叶绿素质量分数降低，较CK1下降了23.0%.对叶片进行Spd处理后，T1，T2，T3组颠茄叶片叶绿素质量分数均有显著升高，盐胁迫导致的叶绿素合成受阻现象得到缓解，其中T1组升高得最多，但当处理浓度升高至0.7 mmol/L时，叶绿素质量分数为各组中最低(图 1).
-
相比CK2，喷施了Spd溶液的颠茄叶片F0值均有下降，T1，T2组效果显著. NaCl处理使Fm和Fv/Fm值显著降低，Spd溶液处理后有所回升，T3组Fm值上升最多，T1组Fv/Fm值上升最多. CK2的Yield和qP值都比CK1小，分别下降了27.1%和25.0%，喷施Spd溶液后，各组数值均呈现出上升趋势.荧光参数NPQ在NaCl处理后比对照组升高了46.6%，经过不同浓度的Spd处理后，各组NPQ值均下降，浓度为0.5 mmol/L时(表 1).
-
在本试验中，CK1叶片中MDA的质量分数较少，仅为0.071 mg/g，而经过NaCl处理后的CK2叶片MDA质量分数较CK1升高了24.7%.试验组向受盐胁迫的颠茄喷施较低浓度的Spd溶液时，颠茄叶片中的MDA质量分数降低，与CK2相比分别下降了28.5%，16.9%，11.9%.而浓度为0.7 mmol/L的Spd溶液处理组MDA质量分数超过CK2达到0.091 mg/g.这说明适宜浓度的Spd溶液对减缓盐胁迫导致的MDA质量分数升高有作用(图 2a).
-
脯氨酸是植物体内一种重要的渗透调节物质，植物在受到水分胁迫时，体内的脯氨酸合成会增多，细胞液浓度升高，以防止原生质体水分的散失.试验显示，当对颠茄进行NaCl溶液处理时，叶片脯氨酸质量分数显著升高，而Spd处理可使各组脯氨酸质量分数下降，特别是T2组较CK2组下降了29.6%，下降幅度最大，但仍高于CK1(图 2b).
-
试验显示(图 3)，CK1叶片中的可溶性糖质量分数为0.120 mg/g，NaCl处理使可溶性糖质量分数升高了45.3%.向颠茄叶片喷施外源Spd溶液，随着浓度增加，可溶性糖的质量分数呈上升趋势，浓度为0.1 mmol/L时，其质量分数较CK2下降了16.6%，其他浓度效果则不显著.同时盐胁迫使颠茄叶片可溶性蛋白质量分数大幅度上升，向颠茄施以浓度小于等于0.5 mmol/L Spd时，可溶性蛋白质量分数显著下降，T3组较CK2下降了45.2%，下降最多.但当Spd质量分数达到0.7 mmol/L时，其质量分数上升至CK1的2.33倍.
-
在本试验中，NaCl处理会造成颠茄叶片中的POD活性上升，随着Spd处理浓度升高，POD活性呈现出先下降后升高的趋势，分别为CK2的65.9%，56.5%，44.0%，60.3%(图 4a).盐胁迫同样也使颠茄叶片中的SOD活性升高，CK2是CK1的2.04倍，对颠茄叶片喷施Spd溶液可使SOD活性降低，而当处理浓度为0.5 mmol/L和0.7 mmol/L时，SOD活性比CK1更低，说明Spd浓度过大时会抑制颠茄叶片中SOD的活性(图 4b).
-
试验表明，100 mmol/L的NaCl溶液处理未使颠茄叶片中的东莨菪碱质量分数发生显著变化，但是导致了莨菪碱质量分数降低，仅为对照组的44.1%.对盐胁迫下的颠茄进行Spd处理，T1，T2组的莨菪碱质量分数较CK2分别升高了170.8%，149.7%，T3，T4组变化并不显著，而东莨菪碱质量分数在Spd浓度为0.1 mmol/L时有显著升高，为CK2的3.44倍，且较高浓度的Spd处理(0.5 mmol/L和0.7 mmol/L)会造成东莨菪碱合成受影响，质量分数减少(图 5).
2.1. Spd处理对盐胁迫下颠茄叶片叶绿素质量分数的影响
2.2. Spd处理对盐胁迫下颠茄叶片叶绿素荧光参数的影响
2.3. Spd处理对盐胁迫下颠茄叶片MDA质量分数的影响
2.4. Spd处理对盐胁迫下颠茄幼苗叶片脯氨酸质量分数的影响
2.5. Spd处理对盐胁迫下颠茄叶片可溶性糖、可溶性蛋白质量分数的影响
2.6. Spd处理对盐胁迫下颠茄叶片POD和SOD活性的影响
2.7. Spd处理对盐胁迫下颠茄叶片中生物碱质量分数的影响
-
叶绿素质量分数是植物生理的重要指标之一，反映了植物光合作用能力及植物生长发育和营养状况[14-15].有研究表明[16-19]，盐胁迫可导致植物的叶绿体结构被破坏，叶绿素质量分数降低.研究结果表明，盐胁迫使颠茄叶片中的叶绿素质量分数减少，而外源喷施Spd溶液可以缓解此种伤害，该结果与甜瓜、菠菜等植物的研究结论基本一致.这可能是由于Spd常以多聚阳离子状态存在，可以直接结合细胞膜上带负电荷的磷酸及光合蛋白，进而稳定细胞膜结构，减轻叶绿体结构的破坏，使叶绿素质量分数恢复正常.
在正常情况下，叶绿素吸收的光能主要通过光合电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散3种途径来消耗.这3种途径之间存在着此消彼长的关系，光合作用和热耗散的变化会引起荧光发射的相应变化.因此，可以通过对荧光的观测来探究光合作用和热耗散的情况[20].在本试验中，当颠茄受到盐胁迫时，反映PSⅡ电子传递情况的Fm值和PSⅡ光能转化效率的Fv/Fm值都显著降低，说明PSⅡ受到破坏，在光合作用过程中的电子传递和转化都受到影响.经过Spd处理后，Fm和Fv/Fm都有所增大，说明PSⅡ受到的伤害减轻，电子传递速率和PSⅡ原初光能转换效率升高.同时，Spd处理使初始荧光F0降低，光化学猝灭系数qP上升，非光化学猝灭系数NPQ下降，与苏贝贝等[21]对半夏的研究结果吻合.这反映了试验处理使PSⅡ开放程度更大，说明Spd可解除盐胁迫导致的光抑制现象，吸收的光能不再大量以热能形式耗散，而是更多地用于光化学电子传递，以完成光合作用.
-
MDA是膜脂过氧化产物，会造成细胞中酶和细胞膜的损伤，破坏膜结构的完整性和功能的稳定性，其质量分数是反应膜脂过氧化程度和膜受损伤程度的重要指标[22].逆境胁迫可使植物细胞膜受损，MDA质量分数上升.此外，盐胁迫还会导致细胞液浓度升高，造成细胞失水.试验显示Spd可以缓解颠茄叶肉细胞膜受到损伤而导致的MDA质量分数升高现象，有效保护细胞膜，减轻膜脂过氧化程度，0.3 mmol/L为最佳喷施浓度；可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物重要的3种渗透调节物质，当颠茄遭受盐胁迫时，会产生更多的调渗物质来调节细胞液浓度，减少植物失水.而适宜浓度的Spd处理使这3种物质质量分数下降，说明Spd可以降低植物体对Na+，Cl-离子的吸收，Na+，Cl-离子比值下降，使叶肉细胞水势恢复，维持细胞渗透平衡.逆境胁迫还可使植物活性氧代谢失衡，导致活性氧过度积累，从而对植物造成氧化伤害[23].
SOD与POD是植物体内活性氧清除系统中的重要保护酶，当SOD与POD处于较高活性时，能有效清除活性氧物质，减轻膜脂过氧化对细胞膜的伤害.盐胁迫导致叶片内活性氧过多，Spd处理后颠茄叶片中SOD和POD活性降低，说明Spd使叶片中的活性氧自由基减少，减轻叶片的损伤程度，但Spd浓度不能过高.亚精胺是H+载体，可能通过歧化反应直接清除活性自由基，但是酶活性的升高表明亚精胺也对酶有直接的影响.王燕等[24]认为，Spd可以结合到抗氧化酶分子上，改变酶的构象，使单位酶活性升高.后期需要对2种抗氧化酶分子结构作进一步的测定和比较分析.
-
托品烷类生物碱(主要是莨菪碱和东莨菪碱)由于其显著的临床药用价值和巨大的市场需求，一直以来都是植物次生代谢领域研究的热点之一[25].颠茄是提取莨菪碱和东莨菪碱的主要商业药源，其生物碱的积累也是颠茄研究的重要方向.在本试验中，盐胁迫对东莨菪碱的质量分数没有显著影响，但0.1 mmol/L的Spd能够促进东莨菪碱的合成和积累，使东莨菪碱质量分数升高至对照组的3.44倍.另一方面，盐胁迫导致莨菪碱的质量分数显著降低，0.1 mmol/L和0.3 mmol/L浓度的Spd都能促进盐胁迫下颠茄莨菪碱的合成，但是Spd溶液浓度过高反而不利于植物的次生代谢和生物碱的积累，这说明叶片喷施少量的亚精胺溶液即可大幅提高颠茄的生物碱质量分数，是一种简便高效的方法.目前鲜有关于亚精胺对药用植物次生代谢影响的研究，故本研究拟将以同样的试验背景，分析测定颠茄次生代谢途径中关键酶的活性及其基因表达量，进一步验证亚精胺是否通过调节次生代谢途径中的关键酶活性来影响生物碱的合成，并探讨是某种酶的作用或某几种酶共同作用产生的效应.