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青蒿，又名黄花蒿(Artemisia annua)，属菊科一年生草本植物，是提取青蒿素的唯一原料药材[1].青蒿素被世界卫生组织推荐为治疗疟疾的首选药物，为人类防治疟疾做出了巨大贡献.研究表明青蒿素除了具有抗疟作用外，还能抗癌[2-3]，抗白血病[4]，抗寄生虫(日本血吸虫、弓形虫、肺孢子虫、球虫、锥虫等)[5]等等.目前，青蒿主要靠人工栽培，大量施用化肥导致土壤板结，环境污染.
木霉菌是一种广泛存在于土壤、植物根际和叶面的腐生型真菌，对多种植物病原真菌具有拮抗作用[6-8].有的木霉对一些作物还有促生长作用[9-13].因为木霉对植物的这些作用，一些木霉被成功开发为微生物肥料和微生物农药，占领了巨大的市场份额.目前，国内外已经有50多种木霉商品化制剂[14].
本实验室从青蒿内生菌中分离出一株深绿木霉(Trichoderma atroviride)，前期研究表明其液体发酵菌丝体对青蒿幼苗有显著的促生长作用[15].本研究用深绿木霉的发酵菌丝体和分生孢子施用于青蒿幼苗和大田成株，进一步验证其对青蒿的促生作用，为开发深绿木霉菌肥及减少青蒿种植中化肥施用奠定基础.
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供试青蒿品种为本课题组保存：药客佳1号、华立、渝青2号.
深绿木霉分离自青蒿内生真菌[15].
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采用以下方法培养深绿木霉分生孢子，比较产孢效果，筛选最佳产孢培养条件(表 1).
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将4 ℃低温保存的试管菌种活化后接种到PDA固体培养基上，置于25 ℃培养箱培养，间歇照光使其产生分生孢子.加入无菌水配制分生孢子悬浮液，用血球计数板计数，无菌水稀释，最终浓度为1×108个/mL.取1 mL悬浮液于100 mL PDB液体培养基(250 mL三角瓶)，置于25 ℃，140 r/min的摇床中培养.约6~7 d后取出培养物，纱布过滤去多余液体，得到菌丝体，用搅拌机搅拌均匀.
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品种：药客佳1号. 3月播种青蒿于育苗格，在苗生长至10~15 cm时分别用菌丝体(约3 g/株)和分生孢子悬浮液(1 mL/株，孢子浓度1×108个/mL)灌根，部分苗10 d后分别用相同量菌剂第2次灌根，以复合肥100 mg/株1次和清水为对照. 3个重复/处理，20株/重复.第2次灌根15~20 d后统计植株相关生育指标和生理指标.
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(1) 深绿木霉不同施用量对青蒿成株生长的影响
品种：药客佳1号. 3月播种，5月移栽，6月初分别施用菌丝体1次(30 g/小区)和孢子悬浮液1次(50 mL/小区，孢子浓度1×108个/mL)，部分苗7月初分别再施用同样量菌剂1次，以复合肥170 g/小区2次和清水为对照. 3小区/处理，10株/小区，随机区组排列. 8月中、下旬收取青蒿，统计相关生育指标.
(2) 深绿木霉对不同品种青蒿成株生长的影响
品种：华立、渝青2号、药客佳1号. 3月播种，5月移栽，6月初分别施用菌丝体1次(30 g/小区)和分生孢子悬浮液1次(50 mL/小区，孢子浓度1×108个/mL)，7月初分别再施用同样量菌剂1次，以复合肥170 g/小区2次和清水为对照. 3小区/处理，10株/小区，随机区组排列. 8月中、下旬收取青蒿，统计相关生育指标.
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可溶性蛋白质量分数测定：考马斯亮蓝法[16]
叶绿素质量分数测定：丙酮提取法[16]
可溶性总糖测定：蒽酮比色法[16]
青蒿素测定：石油醚提取-高效液相色谱法
1.1. 供试材料
1.2. 深绿木霉产孢培养条件研究
1.3. 深绿木霉液体发酵菌丝体培养
1.4. 深绿木霉对青蒿生长的影响
1.4.1. 深绿木霉对青蒿幼苗生长的影响
1.4.2. 深绿木霉对青蒿成株生长的影响
1.5. 生理指标测定
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从表 2可见，10，11，12号处理的孢子发生情况最好，且均能持续生产数茬孢子.但从减少麦粒用量，节约成本角度出发，以11，12号处理为佳.可以将细木屑:麦粒=15~20:1作为深绿木霉菌肥孢子培养的基质.
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从表 3可见，施用深绿木霉发酵菌丝体1次的幼苗各生长指标与清水对照差异不具有统计学意义；施用菌丝体2次的处理其根粗、地上鲜质量、地上干质量、地下干质量、总鲜质量、总干质量均显著高于清水处理，增加率分别达10.72%，60.89%，43.59%，22.22%，53.25%，40.63%，且在这几个指标上与复合肥处理差异不具有统计学意义.施用2次菌丝体的幼苗地上鲜质量、地上干质量、总鲜质量、总干质量均显著高于施用1次菌肥的苗，增加率分别为40.75%，38.27%，36.73%，35.00%.
施用1次深绿木霉孢子的青蒿幼苗根粗、茎粗、株高、地上鲜质量、地上干质量、地下干质量、总鲜质量、总干质量均高于清水对照，增加率分别为11.80%，11.02%，21.66%，44.99%，53.85%，83.33%，38.51%，59.38%.且在根粗、茎粗、地上干质量、总鲜质量、总干质量方面与复合肥处理差异不具有统计学意义.施用2次深绿木霉孢子的青蒿幼苗在根粗、茎粗、株高、地上鲜质量、地上干质量、地下干质量、总鲜质量、总干质量等指标上均高于清水对照，其增加率分别为13.14%，8.14%，21.11%，38.31%，46.15%，27.78%，33.99%，42.71%，且在根粗、茎粗、地上干质量、地下干质量、总干质量等方面与复合肥差异不具有统计学意义.施用1次菌肥和2次菌肥的幼苗各生长指标的差异基本不具有统计学意义.
从表 4可见，不同施用量菌丝体对青蒿幼苗各生理指标均没有显著提高；施用1次孢子对叶片叶绿素b和总叶绿素质量分数有显著提高；施用2次孢子对叶片叶绿素a和总叶绿素质量分数有显著提高.
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从表 5可见，施用深绿木霉菌丝体1次对青蒿植株的生长没有影响，施用2次对地下干质量有显著提高；施用深绿木霉孢子1次和2次对青蒿植株的生长均没有影响.施用深绿木霉对干叶产量和青蒿素百分比没有显著影响.
从表 6可见，施用深绿木霉孢子对渝青2号各指标没有显著影响；对华立根粗、茎粗、株高、地下干质量有显著提高；对药客佳1号的根粗有显著提高.施用深绿木霉菌丝体对3个品种各指标没有显著影响.施用深绿木霉对3个品种青蒿成株干叶产量和青蒿素百分比没有显著影响.
2.1. 深绿木霉产孢培养条件比较
2.2. 深绿木霉对青蒿幼苗生长的影响
2.3. 深绿木霉对大田成株青蒿生长的影响
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目前，国内在木霉对植物促生作用方面的研究比较多，哈茨木霉、长枝木霉、钩状木霉等均对某些作物有一定的促生作用[9-11].有研究表明，深绿木霉孢子对禾本科和豆科牧草、小麦、黄瓜有提高种子发芽率和促进生长的作用[12-13].
本研究表明，深绿木霉对青蒿幼苗也有显著的促生作用，但其促生效果受木霉制剂剂型、施用量、施用时期等多种因素影响.深绿木霉发酵菌丝体对药客佳1号品种青蒿幼苗的生长，无论是地上还是地下部分的干物质积累均有促进作用，但必须达到一定的施用剂量才能有明显效果.而深绿木霉孢子对青蒿苗的生长也有促生作用，且一些生长指标也与复合肥没有显著差异，但没有剂量效应，1次菌肥和2次均能显著促进青蒿苗生长.可见，孢子比菌丝体更适合作为青蒿苗的苗肥，因为孢子不存在剂量效应，且更容易大规模生产，适合长期储藏和运输.
由于发现深绿木霉孢子和菌丝体对青蒿幼苗有促生作用，因此笔者进一步对深绿木霉对青蒿成株的促生作用进行了研究，并比较了对不同品种成株青蒿的促生效果，结果发现无论是孢子还是菌丝体对青蒿成株均没有显著促生作用.笔者之前对深绿木霉发酵菌丝体和孢子对不同播种时期青蒿幼苗生长的影响进行了研究，发现发酵菌丝体在4-5月对青蒿幼苗有促生作用，对7月以后的幼苗(注：6月播种)均没有促生作用[15].而本研究也发现，深绿木霉菌丝体和孢子对5月的苗有促生作用(施用菌肥在4-5月)，对大田成株没有促生作用(施菌肥在6-7月)，推测其原因可能是由于季节温度和湿度对深绿木霉活力的影响.本地4-5月气温适宜，雨量丰沛，土壤温度和湿度都适合深绿木霉生长，而7-8月是(35~40) ℃的连晴高温，土壤干燥，深绿木霉菌可能脱水死亡，失去活性.
因此，深绿木霉适合在4-5月施用，作为青蒿苗肥；如果施用于大田成株青蒿，应配合化肥，即在中温多雨的5月施用深绿木霉，在高温干燥的7月施用化肥，这样菌肥和化肥优势互补，减少化肥的用量.
目前，深绿木霉孢子培养基一般有纯麦麸、麦麸+泥土、纯麦粒、玉米渣+稻壳+稻草粉+麦麸等[13, 17].本研究发现，纯麦粒不能大量产生分生孢子，估计是由于碳氮比不合适.因为深绿木霉对纤维素降解利用能力不强，麸皮、玉米芯、木屑产孢效果也不好，本研究采用细木屑与麦粒的组合，大量加入木屑可以降低培养基成本，麦粒中的淀粉可为木霉提供充足养分，保证其可以长出多批健壮的分生孢子，提高培养基利用效率.此外，生产上制作菌肥，在麦粒粉碎后，麦粉可以为深绿木霉分生孢子在土壤中萌发生长提供充足的养分，利于木霉充分发挥其促生抗病作用.但是，木屑和麦粒的比例要控制在一定范围，否则碳氮比不合适，也不能产孢.