Cloning and Characterization of GDP-Mannose Pyrophosphorylase Gene in Konjac and Its Promoter

Peng-jia LI; Mao-juan JIAO; Qi-jun WANG; Cheng-gang SU

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2019.03.003

In this study, tBlastn searches of high-throughput transcriptome sequencing databases of Amorphophallus konjac and A. albus were aligned and spliced with the amino acid sequence of Arabidopsis thaliana, and the GMP transcript was assembled. The putative full-length sequence of the GMP gene was cloned. By designing gene-specific primers, a partial cDNA sequence of konjac GMP gene with a length of 1 233 bp was cloned. The length of the coding region of the gene was 1086 bp, and the encoded amino acid was 361. Based on the above results, using FNPI-PCR technology, we got konjac GDP-mannose pyrophosphorylase gene GMP upstream promoter 2 116 bp in length. According to bioinformatics analysis, typical TATA-box, CAAT-box, and stress-related elements and light responsive elements and other cis-elements were identified in the promoter region.

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魔芋是天南星科(Araceae)魔芋属(Amorphophallus)多年生草本植物，是迄今发现的极少能大量合成葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)的植物种群，主要分布在亚洲和非洲热带及亚热带的一些国家和地区，仅部分亚洲国家有栽培.大面积主栽种为花魔芋(A.konjac K. Koch)和白魔芋(A.albus P. Y. Liu et J. F. Chen)，其中我国学者刘佩瑛、陈劲枫发现并命名的新种白魔芋为我国特有，品质最佳.魔芋是我国传统栽培的重要经济作物，具有极高的经济价值，其所含葡甘聚糖具有诸多优点，已成为食品、医药、化工、石油、纺织等工业中具有重要用途的原料与产品，出口欧美、日本等，带动了一大批相关产业的发展^[1].

葡甘聚糖含量是魔芋品质的最重要衡量指标. 1975年，Muoat通过实验认定GDP-甘露糖是魔芋葡甘聚糖生物合成的甘露糖供体，而GDP-甘露糖的合成由GDP-甘露糖焦磷酸化酶催化形成，因此GDP-甘露糖焦磷酸化酶对于葡甘聚糖的合成起着重要调控作用.何春梅等的研究表明^[2]，在铁皮石斛中，GDP-甘露糖焦磷酸化酶参与葡甘聚糖的合成、抗坏血酸合成以及糖基化作用等过程，对植物的正常生长以及抗逆性起着重要作用^[3].近年来，已有学者在其他一些植物例如拟南芥中分离纯化出这种酶，得到了GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的全长序列，并对其功能进行了研究^[4].但在魔芋当中，对于GDP-甘露糖焦磷酸化酶及其基因的研究非常少，仅有Markus Pauly^[5]通过转录组454高通量测序方法，得到该基因的全长序列，并已在GenBank登陆(登陆号JF727269).其基因全长801 bp(包含部分UTR区域)，编码氨基酸长度是146个(登陆号AEH27534.1)，对比其他物种GDP-甘露糖焦磷酸化酶氨基酸长度为360多个氨基酸，数目和序列相差都很大.且文中未显示该序列的PCR扩增鉴定，更未有进行功能验证，故Markus Pauly得到的GMP基因序列可能存在一定的问题.本研究将重新克隆该基因及其启动子序列，将得到的基因序列与其他物种进行对比，并对启动子序列进行功能分析预测，以期初步验证我们的猜想，也为之后进行该基因的功能验证打下基础.

1. 材料与方法

1.1. 材料

花魔芋、白魔芋叶片、球茎等.

1.2. 菌株和载体

大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell和克隆中间载体pEASY-Blunt Simple Cloning Kit购自全式金生物；克隆中间载体pClone007 Simple Vector Kit购自北京擎科新业生物技术有限公司；

1.3. 试剂

Quick RNA Isolation Kit试剂盒(北京华越洋生物技术有限公司)；TaKaRa反转录试剂盒(宝日医生物技术有限公司)；克隆所需酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase和2×Taq Master Mix(诺唯赞生物)；Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker(全式金生物)；高效植物基因组DNA提取试剂盒Hi-DNAsecure Plant kit、通用型DNA纯化回收试剂盒Universal DNA Purification Kit、质粒小提试剂盒TIANprep Mini Plasmid Kit(天根生化科技有限公司)；Nucleic Acid Stain核酸染料(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；PCR引物合成和DNA测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成，X-Gal，LB，琼脂粉等为常规试剂.

1.4. GDP甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆

利用Quick RNA Isolation试剂盒提取花魔芋球茎总RNA，利用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成单链cDNA，并通过魔芋仅有的5个转录组高通量测序数据库，与拟南芥中GMP氨基酸序列，进行Blast比对、拼接，得到魔芋GMP基因的推定全长，尽量包括UTR区域，再据此序列设计基因特异性引物GMP-F/GMP-R(表 1).

使用高保真酶进行GMP基因的克隆，PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸50 s，32个循环，总延伸5 min. PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收目标条带，将纯化后的产物与pEASY-Blunt Simple Cloning载体连接，再经过42 ℃热激转入大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中，菌落PCR检测后将阳性克隆送北京擎科新业生物技术有限公司测序.

1.5. GDP甘露糖焦磷酸化酶基因启动子的克隆和其生物信息学分析

以魔芋幼叶为材料，利用试剂盒提取花魔芋的总DNA.根据已克隆得到的GMP基因序列测序结果，利用FPNI-PCR法克隆GMP基因的启动子，设计3个嵌套式的特异性引物80063，80064，80065(表 1)，3轮反应程序具体参照WANG等^[6]的方法，在第3轮中发现3条特异条带，经切胶回收、热激连接pClone007 Simple Vector，阳性菌落检测，送样测序.

根据第1轮测序结果设计引物，分别在距离ATG上游2 116 bp和207 bp处设计扩增全长启动子上下游引物，为80073和80065(表 1).以花魔芋的总DNA为模板，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行扩增，PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，总延伸5 min.经切胶回收、热激连接pEASY-Blunt Simple Cloning载体(全式金生物)，阳性菌斑检测，送样测序.

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线数据库分析所克隆得到的GMP基因的启动子调控原件，据此，对GMP基因的启动子进行功能分析预测，利用TSSP(http://www.softberry.com/cgi-bin/programs/promoter/tssp.pl)，分析预测GMP基因转录起始位点.

3. 讨论

由于与魔芋的近缘物种，即使是一个科的研究都很少，魔芋尚未进行全基因组测序，目前魔芋分子生物学特别是功能基因组的研究相当滞后，已发现的基因组资源极为有限，在GenBank上登陆的魔芋属(Amorphophallus)的核酸序列、ESTs和克隆的基因序列都很少，而关于葡甘聚糖合成调控分子机制的研究更是有限，这都极大地阻碍了魔芋品质改良的进程. GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)直接控制GDP-甘露糖的合成，为魔芋葡甘露聚糖的合成最后一步提供两个底物之一，故是魔芋葡甘露聚糖生物合成路径中的关键酶.目前已有学者从一些植物中克隆得到了GMP基因并对其进行了功能验证，如拟南芥、铁皮石斛.在魔芋中，对于GDP-甘露糖焦磷酸化酶及其基因的研究非常少，仅有Markus Pauly^[5]通过转录组454高通量测序方法，得到注释为花魔芋的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的全长序列，并已在GeneBank登陆(登陆号JF727269).登陆的基因全长801 bp(包含部分UTR区域)，编码氨基酸长度是146个，对比其他物种GDP-甘露糖焦磷酸化酶氨基酸长度为360多个氨基酸，数目和序列相差都很大.但其研究结果未显示该序列的PCR扩增鉴定以及功能验证，我们推测所登陆的该基因序列很可能存在问题.因此对魔芋GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因进行克隆和功能研究是非常有必要的.本研究利用魔芋的转录组高通量测序数据库，进行tBlastn和拼接，再据此设计基因特异性引物，扩增得到推定的GMP基因，包含部分UTR区的序列，其编码氨基酸序列与其他物种的具有很高的相似性，初步说明我们得到的应该是该基因，关于其功能验证正在进行中.

现阶段克隆启动子比较常用的方法有PCR法、TAIL-PCR^[7]、接头PCR^[8]等方法. PCR法较为简便，但只限于已知序列的克隆；TAIL-PCR近年来应用比较广泛，但过程较为繁琐，总之这些启动子克隆方法各有利弊.由于魔芋的整个基因组没有进行完全的测序，因此花魔芋GMP基因的启动子序列是未知的，不能直接用常规的PCR的方法进行克隆，本研究采用了FPNI-PCR的方法^[9]克隆得到了GMP基因ATG上游长度为2 116 bp的启动子序列，并在拼接得到的启动子序列的基础上设计引物，运用常规的PCR方法，使用高保真酶，在花魔芋总DNA中再次克隆得到GMP基因的启动子序列.运用PlantCARE等在线软件对序列进行预测分析^[10]，发现该启动子含有多种生物学顺式作用元件，推测GMP基因的转录水平可能受到多种因素的调控.除了典型的TATA-box和CAAT-box核心启动子原件外，还具有一些与光响应、激素相关的调控元件，推测GMP的转录水平与激素的调节有关.在拟南芥中，已研究得到GDP-甘露糖焦磷酸化酶参与抗坏血酸的合成；在铁皮石斛中，也有研究表示该酶与抗盐胁迫密切相关.因此，我们推测在GMP基因的启动子中可能含有一些与抗胁迫相关的调控元件.通过对得到的启动子序列的分析发现，除以上顺式作用元件外，该序列中还包含MYBHv1结合位点元件，厌氧诱导所必需的顺式作用调节元件等非生物胁迫响应元件，暗示在魔芋中GMP基因可能参与对非生物胁迫的耐受能力.

已有研究表明，GDP-甘露糖焦磷酸化酶参与植物多糖合成、抗坏血酸合成以及糖基化作用等过程^[11]，对植物的正常生长以及抗逆性起着重要作用.鉴于Markus Pauly虽拼接得到花魔芋GMP基因的序列，但是并没有对其进行功能验证，而本研究得到的魔芋GMP基因的全长序列具有较强的保守性.并且本研究还克隆得到了该基因的启动子序列，该序列具有可能提高植物对非生物胁迫的耐受能力的调控元件，因此GMP基因极有可能与抗逆性有关，这更加验证了我们的猜测——Markus Pauly在GeneBank中登陆的GMP基因的全长序列存在一定的问题.为了证实我们的猜测，还需要进行GMP基因及其启动子的功能验证^[12]等方面的研究.

Figure (8) Table (2) Reference (12)

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