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2024 Volume 46 Issue 6
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FU Yangyun, WEN Xiaopeng. Development of EST-SSR Marker System for Phaseolus vulgaris and Construction of Molecular ID for Some Important Germplasms[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2024, 46(6): 63-73. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.06.006
Citation: FU Yangyun, WEN Xiaopeng. Development of EST-SSR Marker System for Phaseolus vulgaris and Construction of Molecular ID for Some Important Germplasms[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2024, 46(6): 63-73. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.06.006
shu

Development of EST-SSR Marker System for Phaseolus vulgaris and Construction of Molecular ID for Some Important Germplasms

  • Institute of Agro-Bioengineering, Guizhou University/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education), Guiyang 550025, China

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  • Corresponding author: WEN Xiaopeng
  • Received Date: 08/02/2024
    Available Online: 20/06/2024

  • MSC: S643.1

  • To develop an efficient marker system for Phaseolus vulgaris as well as to elucidate the phylogenetic relationships of important germplasms, in the present work, EST-SSR primers were designed based on the transcriptome data, subsequently, an EST-SSR marker system was established. Using PCR and capillary electrophoresis with selected polymorphic primers, the 81 Phaseolus vulgaris germplasms, most of which originated in Guizhou Province, were fingerprinted and genetically identified. With MISA software, a total of 11 649 EST-SSR loci were identified from 85 276 unigene sequences in the transcriptome data of Phaseolus vulgaris. The main repetitive units of SSR markers in the transcriptome of Phaseolus vulgaris are 1 to 3 bases, with single base repeats being the main type, accounting for 56.7% of the total, followed by triple base repeats, accounting for 21.1% of the total. Totally, 18 pairs of EST-SSR primers with higher polymorphism and better repeatability were selected from 128 primer pairs. The polymorphic information content (PIC) of the tested germplasms were ranged from 0.50 to 0.95, with an average value of 0.88. The genetic similarity coefficient (DICE) varied from 0.15 to 0.65. When DICE is 0.35, the 81 germplasms can be divided into three categories, among which, the germplasms from Guizhou were mainly distributed in class Ⅰ and Ⅲ, and the cultivars from the other provinces were only distributed in class Ⅱ. The core primers TDc9 and TDc66 might efficiently differentiate the 81 Phaseolus vulgaris germplasms, thereby were employed to construct the molecular ID. Conclusively, the established EST-SSR marker system may be effective for identifying Phaseolus vulgaris germplasms and elucidating genetic diversity.

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Development of EST-SSR Marker System for Phaseolus vulgaris and Construction of Molecular ID for Some Important Germplasms

    Corresponding author: WEN Xiaopeng
  • Received Date: 08/02/2024
  • Available Online: 20/06/2024

Abstract: 

To develop an efficient marker system for Phaseolus vulgaris as well as to elucidate the phylogenetic relationships of important germplasms, in the present work, EST-SSR primers were designed based on the transcriptome data, subsequently, an EST-SSR marker system was established. Using PCR and capillary electrophoresis with selected polymorphic primers, the 81 Phaseolus vulgaris germplasms, most of which originated in Guizhou Province, were fingerprinted and genetically identified. With MISA software, a total of 11 649 EST-SSR loci were identified from 85 276 unigene sequences in the transcriptome data of Phaseolus vulgaris. The main repetitive units of SSR markers in the transcriptome of Phaseolus vulgaris are 1 to 3 bases, with single base repeats being the main type, accounting for 56.7% of the total, followed by triple base repeats, accounting for 21.1% of the total. Totally, 18 pairs of EST-SSR primers with higher polymorphism and better repeatability were selected from 128 primer pairs. The polymorphic information content (PIC) of the tested germplasms were ranged from 0.50 to 0.95, with an average value of 0.88. The genetic similarity coefficient (DICE) varied from 0.15 to 0.65. When DICE is 0.35, the 81 germplasms can be divided into three categories, among which, the germplasms from Guizhou were mainly distributed in class Ⅰ and Ⅲ, and the cultivars from the other provinces were only distributed in class Ⅱ. The core primers TDc9 and TDc66 might efficiently differentiate the 81 Phaseolus vulgaris germplasms, thereby were employed to construct the molecular ID. Conclusively, the established EST-SSR marker system may be effective for identifying Phaseolus vulgaris germplasms and elucidating genetic diversity.

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  • 开放科学(资源服务)标识码(OSID)：

  • 菜豆(Phaseolus vulgaris L.)属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionoideae)菜豆属(Phaseolus)植物，是菜豆属重要的栽培种之一，又称芸豆、四季豆[1]，由墨西哥、中美洲中心和南美洲中心驯化为栽培种[2]. 中国有悠久的菜豆栽培历史，主要分布在黑龙江、内蒙古、吉林、云南、贵州、山西、陕西等地[3]. 我国菜豆产业目前存在品种单一、退化严重，以及种质资源命名混乱等问题，如“同物不同名，同名不同物”等现象普遍存在[4-5]，因此，对菜豆种质的真实性进行区分整理，揭示其亲缘关系，对菜豆种质资源的保护与利用有重要意义.

    简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，又称微卫星DNA，是指基因组中由1~6个核苷酸组成的基本单位多次重复而构成的DNA片段，因其多态性丰富、稳定性好和具共显性而备受关注. 根据来源不同，可分为基因组SSR和表达序列标签SSR(EST-SSR)，其中EST-SSR标记因开发简单、快捷和低成本而在很多作物上得到应用. 徐国辉等[6]利用10对EST-SSR核心引物，对蓝莓优良品系的父本进行了鉴定，并构建了相应的DNA指纹图谱. 杨仕美等[7]基于火龙果转录组测序数据，开发出EST-SSR标记并用于火龙果种质的亲缘关系分析. 李松等[8]利用20对SSR核心引物，对云南玉溪玉米自交系进行遗传多样性分析，为云南玉米品种推广提供了理论依据. 在菜豆上，陈其福等[9]采用SSR标记分析了14个食荚菜豆品种的亲缘关系，并建立了特异性指纹图谱. 杨义杰等[10]应用8对SSR引物分析了20份芸豆品种的遗传多样性. Shabib等[11]利用SSR分子标记技术对11份菜豆品种作遗传多样性分析，为新品种选育提供了研究依据，但尚未见菜豆EST-SSR分子标记开发利用的报道.

    菜豆是贵州主要夏季蔬菜之一，也有极为丰富的种质资源，但其亲缘关系和遗传背景不清晰，极大地影响了遗传育种和知识产权保护. 本文基于菜豆转录组数据，设计EST-SSR引物，建立EST-SSR标记系统；筛选出核心引物，分析了50种贵州种质和31个省外品种间的亲缘关系，并构建其分子身份证，旨在为菜豆育种亲本的选择、品种鉴定以及品种知识产权保护提供可靠的遗传学依据.

1.   材料与方法

    1.1.   试验材料

  • 本研究所用菜豆种质共81份，其中50份采自贵州各地，由贵州大学蔬菜研究院提供，剩余31个品种为市面采购. 种质名称信息见表 1.

    • 1.2.   菜豆转录组测序及引物设计

  • 将菜豆转录组测序样本送至生工生物工程(上海)股份有限公司，利用Illumina HiSeq平台进行分析测序，对上机测序得到的原始序列进行过滤，去掉含接头的短序列和低质量的短序列，得到高质量的测序数据. 使用MISA软件对基因转录本进行SSR检测，根据搜索出的SSR位点及其侧翼序列，使用Primer 3完成EST-SSR引物设计.

    • 1.3.   PCR扩增及产物检测

  • 将获得的81份菜豆种子浸种2~3 d后，移栽至土壤培养2~3周，直至长出2片真叶，采摘包于锡纸，放置于-20 ℃冰箱内，用于后续DNA提取. 采用北京天根生化科技有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取所有样品DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行. DNA提取完成后采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，采用全波长酶标仪(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)检测其浓度与纯度，质量合格后将其存于-20 ℃冰箱中备用.

    选取种子性状差异性较大的8个样品DNA为模板，利用128对引物分别进行扩增. PCR扩增体系为10 μL：模板基因组DNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL(北京天根生化科技有限公司)，ddH2O补充至10 μL. SSR-PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，最适退火温度57~60 ℃反应30 s，72 ℃反应1 min，共38个循环；72 ℃延伸10 min；扩增产物放置于4 ℃冰箱中冷藏保存.

    PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，初步筛选出有多态性的引物. 将多态性较好、重复性高、稳定性好的引物对81份菜豆样品进行PCR扩增，最后使用毛细管电泳对扩增产物进行检测分析. 毛细管电泳由Qsep100TM全自动核酸蛋白分析仪完成.

    • 1.4.   数据处理

  • 利用毛细管电泳方法采集条带，人工读条统计100~500 bp内的条带，记录明显条带，对多态性佳的引物重复扩增至少3次，其中绝大多数带型可重复，对不稳定谱带忽略不计. 有谱带的标记为“1”，没有谱带的标记为“0”，建立数据库. 利用POPGEN 32软件分析每对EST-SSR引物的等位基因数、有效等位基因数、Nei' s基因多样性指数及Shannon信息指数；应用PIC_CALC软件计算PIC值；用NTSYS pc 2.10e软件计算相似系数，并按UPMGA方法构建亲缘关系树状图.

    • 1.5.   DNA分子身份证构建

  • 利用核心引物扩增的带型数据，赋值“0/1”形成菜豆种质的指纹代码，通过条形码和二维码生成器(https://www.qr-batch.com/)生成包含各供试种质基本信息的DNA分子身份证.

2.   结果与分析

    2.1.   菜豆转录组EST-SSR位点分析及引物设计

  • 利用MISA软件对菜豆转录组测序数据85 276条非冗余序列进行分析，共挖掘出11 649个EST-SSR位点. SSR标记的重复单元碱基数有单碱基重复、二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复、六碱基重复，还有复杂的重复碱基(略)，对应的标记数目分别为6 610，2 389，2 458，132，36，24. 菜豆转录组EST-SSR标记主要重复单元为1~3个碱基，其中单碱基重复位点数最多，占总量的56.7%；其次是三碱基重复，占总量的21.1%. 使用Primer 3共设计EST-SSR引物30 177对，随机合成128对EST-SSR引物，分析81份菜豆种质的遗传多态性.

    • 2.2.   菜豆EST-SSR引物筛选

  • 在128对EST-SSR引物中，122对引物能扩增出条带，有效扩增比例为95%. 经重复筛选，有18对引物能稳定扩增出多态性好、重复性高的条带(表 2)，部分引物筛选结果见图 1.

    • 2.3.   菜豆EST-SSR引物多态性分析

  • 利用18对多态性引物对81份菜豆样品进行PCR扩增，将扩增产物进行毛细管电泳，部分种质的电泳结果见图 2. 通过POPGEN 32对统计的“0/1”数据进行分析，结果显示，18对引物在81份样品中共检测出492个多态性位点：最小多态性位点数为8个，最大为39个，平均27.3个. 等位基因数平均为2.0个，有效等位基因总数为23.0个，单对引物产生有效等位基因数为1.1~1.4个，平均为1.3个. Nei' s基因多样性指数为0.07~0.25，平均为0.18. Shannon信息指数变化范围为0.14~0.40，平均为0.30. PIC值为0.50~0.95，平均为0.88(表 3). 结果表明，筛选出的18对EST-SSR引物具有很好的多态性，81份菜豆种质也具有丰富的遗传多样性.

    • 2.4.   菜豆种质的亲缘关系分析

  • 利用NTSYSpc 2.01e软件计算81份菜豆种质的遗传相似性系数. 聚类结果表明，遗传相似性系数变化幅度为0.15~0.65，其中MD4和MD8亲缘关系较近，相似系数为0.65，而MD37和MD77亲缘关系较远，相似系数仅为0.15. 在遗传相似系数为0.35时，可将81份种质分为3大类(图 3)：第Ⅰ类包含MD1，MD3，MD4等18份种质. 第Ⅱ类中包含的种质数量最多，共计59份种质，在相似系数为0.37时，又可将其分为3个亚类，其中第一亚类包含MD24，MD25，MD30等36份种质，第二亚类包含MD56，MD58，MD63等22份种质，而第三亚类仅有种质MD57. 第Ⅲ类仅有4份来源于贵州的种质，即MD36，MD37，MD38和MD47. 省外种质(MD51~MD81)全部聚在第Ⅱ类群，极有可能与来源地有关，因为这31份品种均是来源于北方，可能其遗传背景重合度较高；而来自贵州的50份种质在3大类中均有聚类，折射出贵州种质间的遗传差异大，可以从中挖掘优异资源，在遗传育种上有较大的潜在价值.

    • 2.5.   DNA分子身份证的构建

  • 利用18条EST-SSR引物对81份菜豆种质进行毛细管电泳，获得每对引物扩增的带型数据，这些“0/1 ”数据可作为菜豆种质指纹图谱或分子身份证构建的直接依据. PIC值较高的引物为TDc17(0.95)，TDc47(0.95)，TDc66(0.94)，TDc69(0.94)及TDc97(0.95)(表 3)，其中TDc17，TDc66，TDc97均能鉴别出77份种质，TDc66的Shannon信息指数(0.40)最高，故选取TDc66作为核心引物，但仍有4份种质不能被识别，分别为MD42，MD49，MD57和MD63. TDc9，TDc47和TDc97等3对引物可鉴定这4份种质. 这3对引物的多态性位点数分别为33，39，37，选取多态性位点数少且具备同等鉴别力的引物对TDc9，能避免构建分子身份证的繁琐性，因此，利用引物对TDc9和TDc66扩增的EST-SSR标记，可构建全部供试种质的分子身份证，分别生成包含基本信息的条形码和二维码(表 4).

3.   讨论

    3.1.   菜豆的EST-SSR分子标记

  • 相比于主观意识强，且易受环境、气候等外界因素影响的传统形态学标记，共显性强、标记数量充足、多态性高、能够高效快速鉴别种质特异性的分子标记备受关注. 菜豆作为我国主要的粮食作物，却存在种植品种单一、品种退化严重以及种质资源命名混乱等问题，因此急需开发更为可靠且方便快捷的分子标记来促进菜豆育种. 转录组数据是开发标记的理想资源[12]，相较于基因组测序，转录组测序成本低、耗时短. 近年来许多果树[13]、木本植物[14]、药用植物[15]以及食用菌[16]等，均基于转录组测序开发出EST-SSR分子标记用于遗传多样性分析和品种种质鉴定及辅助育种. 本研究基于菜豆转录组数据分析结果，开发合成了128对EST-SSR引物，并验证挖掘了18对重复性好、特异性强、多态性高的引物，用于分析菜豆的遗传多样性.

    根据目前的相关研究报道，当PIC＞0.5时，表明引物有较高多态性；0.5≥PIC＞0.2时，表明引物有中等多态性；PIC≤0.2，则表明引物多态性较低[17]. 夏春阳等[3]利用SSR分子标记分析了69份普通菜豆种质资源的遗传多样性，PIC值平均为0.659. 另外，陈琼[18]也利用33对SSR核心引物对26份菜豆DUS测试标准品种的遗传多样性进行了分析，PIC值平均为0.604. 本研究中所筛选的18对引物的PIC(0.50~0.95)≥0.5，表明这18对引物具有较高多态性，因此，本文开发的EST-SSR标记系统能用于菜豆种质的鉴定及亲缘关系分析.

    • 3.2.   贵州菜豆种质亲缘关系

  • 地理来源不仅是物种亲缘关系分析的重要指标，更是影响物种遗传分化的重要因素[19]. 在长期的自交或近交下，不但会降低种群的遗传多样性，还会大大限制挖掘优良种质的可能性和培育新品种的创新性. 本研究中所用种质主要分为贵州省内及省外两类样本，省外31份菜豆样本主要来源于山东、河北和甘肃等地. 基于菜豆转录组分析结果，本研究成功完成EST-SSR分子标记的引物设计开发，筛选出18对多态性极佳的EST-SSR引物，利用这些多态性好的引物能将81份菜豆种质明确区分开，可分为3大类群. 由聚类结果可以看出，省外品种主要集中在第Ⅱ类群. 这一趋势表明这些品种的亲缘关系较近，极有可能是具有相同或相似的遗传背景，导致遗传变异水平低. 贵州省内收集的50份菜豆种质资源可被分为3大类群，且第Ⅰ，Ⅲ类群均为省内种质，仅有少量种质在第Ⅱ类群的第三亚类中，表明这50份种质遗传变异水平高，且遗传背景丰富多样. 这可能与我国西南优质菜豆种质资源交流逐年加强、少量新育成品种逐渐具备更丰富的遗传背景有关[18]，因此，在杂交育种时需尽量选取来源不同的资源进行组配，以拓宽遗传背景，从而提高我国菜豆种质资源的遗传多样性[20].

    • 3.3.   菜豆种质的分子身份证

  • 目前，有3种构建分子身份证的方式：1) 赋值“0/1”形成字符串；2) 编码等位基因；3) 编码基因型[21]. 谢倩等[22]利用12对EST-SSR引物对59份橄榄种质进行遗传多样性分析，并构建了分子身份证. 刘伟等[23]应用SSR荧光标记法构建山东地方桃种质资源分子身份证. 陆育生等[24]利用SSR标记分析了广东黄皮种质资源的遗传多样性水平及亲缘关系，并构建了分子身份证. 本研究以“0/1”字符串生成条形码，作为构建分子身份证的直接依据；利用TDc9和TDc66作为鉴定全部供试种质的高效核心引物，以此构建81份菜豆种质的分子身份证.

    本研究开发的EST-SSR标记可用于菜豆的系统发育、物种进化及亲缘关系等研究，为今后菜豆品种资源保存、利用、育种和提高育种效率等奠定理论基础，充分发挥它们在育种工作中的应用价值.

Figure (3)  Table (4) Reference (24)

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