Research on the Antibacterial Activity of the Volatile Oil of Traditional Chinese Medicine Combined with Iron Chlorine e6 against Magnaporthe oryzae

将不同浓度梯度的中药挥发油与二氢卟吩铁进行复方配伍。

中药挥发油：广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]、山苍子[Litsea cubeba (Lour.)Pers.]、黄连(Coptis chinensis Franch.)、苍耳子(Xanthium sibiricum Patr.)挥发油，成都中医药大学西南特色中药资源国家重点实验室提取。

二氢卟吩铁：南京百特生物工程有限公司购买。

供试病原菌：Guy11稻瘟病菌株，由四川农业大学西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室提供。

供试水稻：丽江新团黑谷(LTH)，种植于四川农业大学试验田。

稻瘟灵乳油剂：有效成分分子式为C₁₂H₁₈O₄S₂，体积分数为40%，重庆树荣作物科学有限公司购买。

研究分为室内含毒介质试验、田间防治试验两大部分。由室内含毒介质试验得出不同浓度、不同种类的中药挥发油以及配伍二氢卟吩铁的复合药剂对稻瘟病菌的抑制效果，筛选出活性较好的组合，随后进行田间试验，验证复合药剂的实地防治效果。

中药挥发油：以5%体积分数的吐温80为溶剂，加入不同浓度的挥发油。广藿香组质量浓度分别为0.481、1.442、1.922 g/L，对应体积分数分别为0.05%、0.15%、0.20%；山苍子组质量浓度为0.442、0.884、1.326 g/L，对应体积分数分别为0.05%、0.10%、0.15%；苍耳子组质量浓度为0.435、0.869、1.736 g/L，对应体积分数分别为0.05%、0.10%、0.20%；黄连组质量浓度为1.296、1.943、2.590 g/L，对应体积分数分别为0.10%、0.15%、0.20%。

复合药剂：中药挥发油(浓度梯度同上)和0.391 g/L的二氢卟吩铁(体积分数为0.03%)配置成复合药剂。

对照组：阴性对照吐温，质量浓度为2.700 g/L，体积分数为0.25%；阳性对照稻瘟灵，质量浓度为2.460 g/L，体积分数为0.20%。

对4种中药挥发油活性成分进行测定，采用高效液相色谱分析^[9]。广藿香挥发油主要成分确定为百秋李醇(图 1a)，其中百秋李醇的含量为26%。山苍子主要成分为α-柠檬醛、β-柠檬醛和D-柠檬烯(图 1b)，3种成分占比达68%。苍耳子挥发油主要成分为D-柠檬烯、α-紫罗兰酮等物质(图 1c)，其中萜类成分占比达67%。黄连挥发油主要成分为香叶烯、石竹烯(图 1d)，其含量占挥发油比例分别为19%和18%。二氢卟吩铁分子式为C₃₄H₃₁ClFeN₄O₆·3H，相对分子质量为685.9^[14]。

将4种中药挥发油及复合药剂分别配制成不同浓度的溶液，然后取适量分别加入到15~20 mL温度约为50 ℃的稻瘟病菌培养基中，充分混合后，待其凝固形成带药平板。将面积约0.2 cm²且长势大致相同的稻瘟病菌菌饼置于平板中央，加入相应体积的吐温溶液作为空白组。将平板置于25 ℃恒温培养箱内培养20 d后，统一观察稻瘟病菌菌丝生长情况。采用Image J软件测算每个平板的菌落生长直径，重复测量3次，最后计算得出各组平均抑制率，计算公式如下：

试验在四川省成都市四川农业大学试验田进行，地理坐标103°8′N，30°72′E，海拔510~650 m，属亚热带湿润季风气候，气温较高。水稻采用直播方式于2024年4月20日从苗床移栽于田间，共计100个小区，每小区面积0.5 m²，每区50~60株，每小区做3组重复。试验对供试水稻进行统一喷雾接菌，以保证水稻处于同等发病程度。接菌后采用随机区组排列的方法进行给药处理，接菌12 h后进行第一次给药，24 h后进行第二次给药，待水稻发病稳定后，进行随机取样，计算病斑数量及水稻病情指数，计算公式如下：

根据水稻叶瘟病斑的严重程度，采用以下分级标准对病斑进行量化评估，即0级：无病斑；1级：仅有针尖大小的褐点病斑；2级：较大褐点病斑；3级：褐点病斑直径为1~2 mm；4级：病斑面积/叶片总面积≤2%；5级：2%＜病斑面积/叶片总面积≤10%；6级：10%＜病斑面积/叶片总面积≤25%；7级：25%＜病斑面积/叶片总面积≤50%；8级：50%＜病斑面积/叶片总面积≤75%；9级：病斑连成片，占叶面积50%以上或全叶枯死。

数据处理采用Microsoft Excel软件、SPSS软件、Image J软件、Origin绘图软件进行分析，统计方法使用Duncan's Multiple Range Test。

本研究通过含毒介质法对4种中药挥发油及其复合药剂进行稻瘟病菌抑菌活性测定，以溶剂吐温为空白对照，化学药物稻瘟灵为阳性对照，处理组抑菌活性越高，稻瘟病菌菌落直径越小。由表 1可知，二氢卟吩铁自身具有一定的抑菌效果，在使用浓度下菌丝生长抑制率可达25.74%；同时，相比于中药挥发油单药对稻瘟病菌的抑菌效果，二氢卟吩铁和4种中药挥发油联用的复合药剂产生了协同增效效应，提高了对稻瘟病菌的抑制作用。其中，0.05%广藿香、0.20%黄连、0.15%山苍子、0.20%苍耳子复合药剂抑制率达到100%，抑菌效果与化学农药稻瘟灵相当，且中药挥发油的平均用药浓度低于稻瘟灵。

实验对各处理组进行了显微观察。在高倍镜下观察阴性组和复合药剂处理组的孢子悬浮液，在相同视野范围内，阴性组(图 2a)孢子悬浮液密度较大，孢子数量较多；复合药剂处理组(图 2b)孢子悬浮液密度明显降低，数量较少。高倍镜下观察菌丝形态，发现阴性组(图 2c)菌丝分明、形态纤细光滑，复合药剂处理组(图 2d)菌丝发生曲折，褶皱明显(箭头标识)。在低倍镜下观察，发现阴性组(图 2e)菌丝纤细、分明、轮廓清晰，复合药剂处理组(图 2f)菌丝肿胀较为明显(箭头标识)。由此可见，复合药剂处理会破坏菌丝的正常形态，影响病菌正常生长。

田间观察发现，对比阴性对照组，处理组常见水稻害虫数量明显减少，水稻叶片残存水分减少，表明挥发油起到了良好的气味驱虫、燥湿化湿效果。其中，山苍子挥发油病斑抑制效果最佳，最高达72.94%；其次是广藿香挥发油，最高防效达71.82%。在配伍二氢卟吩铁后，两者产生明显的协同增效效应(图 3)，阴性组稻叶枯黄、病斑密集(图 3a)，0.15%山苍子挥发油单药防治效果为72.94%(图 3b)，配伍二氢卟吩铁后组成的复合药剂，防治效果达到95.43%(图 3c)。通过单因素方差分析(ANOVA)得出，中药挥发油防治效果的F值为1.583，p值为0.269，表明在统计学意义上，不同中药挥发油处理组与稻瘟灵处理组之间的防治效果没有显著差异；复合药剂防治效果的F值为1.303，p值为0.346，表明在统计学意义上，不同复合药剂处理组与稻瘟灵处理组之间的防治效果也没有显著差异。

中药挥发油和复合药剂的田间实地防治效果见表 2，由表 2可知，796.55 g·a·i/hm²山苍子复合药剂防治效果达95.43%，1 155.60 g·a·i/hm²广藿香复合药剂防治效果达到92.32%，复合药剂防效普遍高于单用中药挥发油的防效，且531.00和796.55 g·a·i/hm²山苍子复合药剂、1 155.60 g·a·i/hm²广藿香复合药剂、1 044.00 g·a·i/hm²苍耳子复合药剂的防效，均高于化学农药稻瘟灵。

有研究发现，广藿香等4味中药挥发油对稻瘟病菌均具有一定的抑菌活性，在田间试验中防效良好，但防治效果略低于化学农药稻瘟灵^[12]。二氢卟吩铁作为农业前沿热点，能够使作物产生显著的抗逆性，有提质、增产效果，且已被证实可大幅增强水稻的抗稻瘟病能力。近年来，中药源农药的研究逐步从药物筛选深入到多成分配伍及作用机制的探究，若要研发出兼具高抑菌性和低耐药性的药物，中药提取物之间的配伍用药至关重要。后续研究应当在中医药理论指导下，对相关配伍展开思考与尝试，如此，中药农药的开发将更具科学性与针对性。相较于植物源农药，中药源农药的定义更加新颖，但现有研究还未体现出中药源农药独特的中医药理论优势，所以中药源农药仍存在巨大的理论研究价值。

本研究在中医扶正祛邪的理论指导下，通过提升水稻抵抗力实现扶正，借助高效抑菌、气味驱虫、叶片燥湿达到驱邪目的，选取新型植物生长调节剂二氢卟吩铁与4种燥湿化湿中药挥发油配伍，形成一种复合药剂，并展开针对稻瘟病菌的室内抑菌及田间防效探索。结果表明，在室内含毒介质试验中，中药挥发油在配伍二氢卟吩铁后，抑菌效果得到明显提升，0.05%广藿香、0.20%黄连、0.15%山苍子、0.20%苍耳子复合药剂抑制率达到100%，抑菌效果同化学农药稻瘟灵相当，且中药挥发油的平均用药浓度低于稻瘟灵。在田间试验中，抑制稻瘟病菌效果最好的是796.55 g·a·i/hm²山苍子复合药剂、其次是1 155.60 g·a·i/hm²广藿香复合药剂，两者防治效果均高于化学农药稻瘟灵，且中药挥发油与二氢卟吩铁产生了明显的协同增效效应。该复合药剂以中医药理论为指引，成本低廉、原料易得，具有绿色安全、低残留、低抗药性的优势，进一步将其研发为中药农药产品，不仅具有良好的可操作性，对于推动农业可持续发展也具有重要的现实意义。