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北豆根是防己科植物蝙蝠葛(Menispermum dauricum DC.)的干燥根茎，始载于《中国药植志》[1]，其对咽喉肿痛、肠炎、痢疾、风湿痹痛等疾病有明确的治疗作用，因而被收载于《中华人民共和国药典》[2]. 北豆根中含有生物碱类、酚酸类、挥发油、多糖等多种成分，其中生物碱类是主要活性成分，包括氧化异阿朴菲类、双苄基异喹啉类、原小檗碱类、吗啡烷类等[3]. 现代药理研究表明，北豆根具有抗炎[4]、抗肿瘤[5]、抗心律失常[6]、抗脑缺血[1, 7]、抗阿尔兹海默症[8]、免疫调节[9]等多种药理作用. 其提取物已被开发成多种制剂，如北豆根片、北豆根胶囊，用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、支气管炎症等，取得了良好的临床效果.
北豆根配方颗粒是以北豆根饮片投料，经水提取、浓缩、干燥和制粒而成，在易用性方面优于传统煎煮方式，大大提高了患者用药的顺应性. 虽然目前北豆根配方颗粒已经在临床上广泛应用，但仅有其质量标准的研究报道[10]，尚无系统性的化学成分研究. 北豆根配方颗粒经过水提取制得，其化学成分、物质基础必然与药材、饮片有较大差异，因此亟需对北豆根配方颗粒的活性成分、药理作用及作用机制进行研究.
本研究首次建立了一种高效、灵敏的超高效液相色谱—飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术对北豆根配方颗粒化学成分进行鉴定，并通过网络药理学、分子对接技术筛选北豆根配方颗粒中的抗炎、抗肿瘤主要活性成分并进行靶点预测，构建“药物—有效成分—靶点”之间的相互作用关系，初步阐述其抗炎、抗肿瘤机制，旨在为更全面地研究北豆根配方颗粒的物质基础、药理作用、作用机制提供参考，为其质量控制、临床应用提供依据.
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北豆根配方颗粒(山东宏济堂制药集团股份有限公司，批号2010001). 青藤碱、蝙蝠葛碱(山东沃德森生物科技有限公司，批号分别为WDS170062-202006，WDS020017-202005，纯度均≥98.0%)，异紫堇定碱、紫堇达明碱(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为J26HB175042，J21HB188701，纯度分别≥98.0%，≥95.0%)，木兰花碱(上海鸿永生物科技有限公司，批号为130015-202105，纯度≥98.0%)，左旋千金藤定碱(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号16562-13-3，纯度≥98.0%)，蝙蝠葛苏林碱(江苏永健医药科技有限公司，批号200470-210103，纯度94.4%)，粉防己碱(中国食品药品检定研究院，批号110711-201810，纯度≥98.0%). 乙腈、甲醇均为质谱级(美国Fisher Scientific公司，批号分别为215625，222631)，乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，HPLC级，批号20210510)，超纯水为屈臣氏水.
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试验所用到的仪器主要有：Agilent 1290型高效液相色谱系统(美国Agilent科技有限公司)，6530 Q-TOF质谱仪(美国Agilent科技有限公司)，KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BSA224S-CW电子天平(国别赛多利斯科技仪器有限公司)，XS105电子天平(METTLER TOLEDO).
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1) 供试品溶液的制备. 取北豆根配方颗粒适量，研细，精密称定0.2 g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，回流提取30 min，放冷，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得.
2) 混合对照品溶液的制备. 取对照品适量，置于量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液，超声使对照品完全溶解，过0.22 μm微孔滤膜，即得.
3) 色谱条件. 色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，以甲醇(A)-5 mmol/L的乙酸水溶液(B)为流动相. 梯度洗脱：0~2 min，5% A；2~6 min，5%~15% A；6~10 min，15%~20% A；10~18 min，20%~60% A；18~20 min，60% A；20~30 min，60%~90% A. 流速为0.3 mL/min，波长为290 nm，进样量为1 μL；柱温为30 ℃.
4) 质谱条件. 正离子模式，电喷雾电离(ESI)，毛细管电压为4 000 V，雾化器压力为35 Psi，干燥气体温度为300 ℃，流速为8 L/min. 数据采集和处理采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis Navigator(VB.08.00)软件(美国Agilent科技有限公司).
5) 化合物结构鉴定. 按照上述条件对供试品进行检测，得到正离子模式下质谱数据，采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis Navigator B.08.00质谱分析软件进行数据采集，根据保留时间、分子式和裂解规律等信息确认化学成分及结构信息，并推导化合物的质谱裂解规律.
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1) 潜在活性组分数据库的构建. 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)(
https://old.tcmsp-e.com/ )检索北豆根配方颗粒中化学成分，按OB≥30%，DL≥0.18为条件进行初步筛选. 并根据本试验化学成分鉴定结果，选择配方颗粒中含量较高的化学成分，构建北豆根配方颗粒潜在活性成分数据库.2) 北豆根配方颗粒活性成分靶点预测与疾病靶点收集. 将筛选的化学成分输入Pubchem数据库(
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )获取SMILEs格式，将其导入SwissTargetPrediction数据库中(http://www.swisstargetprediction.ch/ )，获取成分靶点信息. 在DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org )和GeneCard数据库(http://www.genecard.org/ )中以抗炎“Inflammation”和抗肿瘤“Tumor”为关键词进行搜索，分别收集整理为抗炎、抗肿瘤基因靶点. 将活性成分靶点和疾病靶点取交集即为北豆根配方颗粒抗炎、抗肿瘤作用的潜在靶点.3) “药物—有效成分—靶点”网络的构建与分析. 为明确北豆根配方颗粒中活性成分与疾病之间的联系，将潜在活性成分和疾病基因导入Cytoscape 3.9.1软件绘制“药物—有效成分—靶点”可视化网络图.
4) 蛋白相互作用网络(PPI)构建及核心靶点筛选. 将交集靶点导入STRING平台(
https://cn.string-db.org/ )，获取蛋白相互作用网络. 下载PPI相互作用关系文件并导入Cytoscape 3.9.1软件中进行网络图优化和拓扑学分析，并计算各靶点的度值(degree)、介度(betweenness)、紧密度(closeness)，选取三者平均数以上的交集靶点为关键核心靶点.5) 交集靶点的功能和通路富集分析. 将交集靶点导入Metascape数据库进行基因本体论(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，选择物种为“Homo sapiens”，通过微生信在线平台(
https://www.bioinformatics.com.cn/ )进行可视化作图. -
北豆根配方颗粒主要为生物碱类化学成分，选取了蝙蝠葛苏林碱、千金藤定碱、木兰花碱、青藤碱、蝙蝠葛碱、异紫堇定碱、紫堇达明碱作为代表性成分与酪氨酸激酶SRC等核心靶点进行分子对接. 从PubMed中获取7个代表性化合物的二级结构，通过Open Babel 2.4.1将其转化为PDB格式，并通过AutoDock Tools 1.5.7对PDB格式的文件进行加电荷处理，作为对接配体保存为PDBQT文件. 从RCSB PDB数据库中下载SRC，ERBB2，MAPK8，MAPK3，HSP90AA1，STAT3和CDK2受体蛋白的3D结构，将受体蛋白通过pymol软件去除蛋白原有的配体以及水分子、氯原子、金属原子等非蛋白分子，保存为PDB格式. 将输出的PDB格式的蛋白用AutoDock Tools 1.5.7软件进行加氢处理，最终保存为PDBQT文件. 用Autodock Vina 1.1.2将7个配体分别与7个受体蛋白进行分子对接. 最后选取了蝙蝠葛苏林碱作为代表性活性成分，进行其与7个受体蛋白的可视化分析.
1.1. 材料与仪器
1.1.1. 主要药品与试剂
1.1.2. 仪器
1.2. 方法
1.2.1. 北豆根配方颗粒成分解析
1.2.2. 基于网络药理学预测北豆根配方颗粒抗炎、抗肿瘤作用机制
1.2.3. 分子对接
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通过比对北豆根药材、饮片中化合物保留时间、准分子离子、二级碎片离子及化合物裂解规律的质谱信息，共鉴定出33个化合物(表 1)，包括9个阿朴菲类和氧化异阿朴菲类、8个单苄基异喹啉类、8个双苄基异喹啉类、4个吗啡烷类、3个原小檗碱类化合物和1个简单喹啉类，其中8个化合物与对照品进行对照确认.
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单苄基异喹啉类是以1-苄基异喹啉为母核所衍生出来的，这类生物碱并没有大π共轭系统，容易发生母核骨架断裂，并根据苄基所连接的不同基团形成m/z 107，137，151特征碎片. 现以化合物3为例进行裂解规律分析. 化合物3保留时间为5.519 min，准分子离子峰为m/z 272.128 3[M+H]+，二级质谱可见碎片离子m/z 255.102 3[M+H-NH3]+，107.049 8[M+H-C9H11NO2]+，结合相关文献[11-12]推测为去甲基乌药碱，分子式为C16H17NO3. 去甲基乌药碱可能的裂解途径见图 1.
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双苄基异喹啉类生物碱是通过氧桥将两个苄基四氢异喹啉连接组成的生物碱，由于醚键数目、芳香氧基数目、氧桥性质等不同，导致其结构多变[13-14]. 化合物30保留时间为11.778 min，准分子离子峰为m/z 623.312 8[M+H]+，二级质谱可见碎片离子m/z 381.181 9[M+H-C16H18O2]+，192.100 8[M+H-C27H29NO4]+，174.091 3[M+H-C27H31NO5]+，结合对照品和相关文献推测为粉防己碱，分子式为C38H42N2O6[15]. 粉防己碱可能的裂解途径见图 2.
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从北豆根配方颗粒中鉴定出4个阿朴菲类化合物和5个氧化异阿朴菲类化合物. 阿朴菲类化合物具有联苯型的四环特殊结构，并含有不同的氧化态和取代基[16]，而氧化异类阿朴菲类中均含有1个1-氮杂苯并蒽酮结构[17]. 这2类化合物与苄基异喹啉类生物碱的质谱裂解规律相似，但是阿朴菲类生物碱不会发生母核骨架的断裂，只可能在侧链会发生断裂或重组. 现以化合物13，33为例进行裂解规律分析. 化合物13保留时间为7.537 min，准分子离子峰为m/z 342.170 7[M]+，二级质谱可见碎片离子m/z 282.088 3[M-C2H7N-CH3·]+，265.085 5[M-C2H7N-CH3OH]+，237.090 8[M-C2H7N-CH3OH-CO]+，结合对照品和相关文献推测为木兰花碱[18]，分子式为C20H24NO4+. 化合物33的保留时间为21.504 min，准分子离子峰为m/z 352.118 5，二级质谱中主要碎片离子峰有m/z 308.089 4[M+H-CH3-CO]+，294.077 0[M+H-CH3-CO-CH3]+，结合相关文献推测为蝙蝠葛宁碱[19]，分子式为C20H17NO5. 木兰花碱可能的裂解途径见图 3.
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吗啡烷类是由苄基异喹啉经过碳碳偶联、酚羟基氧化等过程衍生而来的一类具有部分饱和菲核的具四环基本骨架的生物碱[20]，是目前临床上用于镇痛的主要成分之一[21]. 现以化合物4为例进行裂解规律分析. 化合物4保留时间为6.050 min，准分子离子峰为m/z 330.170 2[M+H]+，二级质谱可见碎片离子为m/z 271.097 3[M+H-C3H9N]+，255.101 4[M+H-C3H9NO]+，239.069 8[M+H-C4H13NO]+，223.075 1[M+H-C3H9N]+. 结合对照品和相关文献推测为青藤碱[22]，分子式为C19H23NO4. 青藤碱可能的裂解途径见图 4.
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这类生物碱不存在大π共轭系统，母核容易发生逆狄尔斯—阿德尔(RDA)裂解，出现m/z 200以下碎片峰[23]，现以化合物16为例进行裂解规律分析. 化合物16保留时间为7.803 min，准分子离子峰为m/z 328.155 6[M+H]+，二级质谱可见碎片离子为m/z 313.131 1[M+H-CH3]+，192.103 4[M+H-C8H8O2]+，151.075 1[M+H-C10H11NO2]+. 结合对照品和相关文献推测为千金藤啶碱[23]，分子式为C19H21NO4. 千金藤啶碱可能的裂解途径见图 5.
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根据OB，DL值筛选出9个活性成分：去甲基乌药碱、衡州乌药碱、异紫堇定碱、千金藤定碱、杏黄罂粟碱、蝙蝠葛明、青藤碱、紫堇达明碱、光千金藤碱；并在此基础上，筛选出5个含量较高且类药性较好的活性成分：蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱、木兰花碱、青藤定、莲心季铵碱；共计14个活性成分. 通过SwissTargetPrediction和Uniprot数据库筛选出与14个活性成分相关的靶点共339个. 通过DisGeNET和GeneCard数据库获得抗炎相关靶点1 998个、抗肿瘤相关靶点2 300个. 将成分和疾病靶点通过Venny 2.1分析后得到抗炎相关共同靶点146个、抗肿瘤相关共同靶点138个.
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构建北豆根配方颗粒“药物—有效成分—靶点”网络，见图 6，抗炎网络中共包括161个节点、394条相互关系，抗肿瘤网络中共包括153个结点、345条相互关系. 对网络图进行拓扑学分析，依照度值排名靠前的抗炎成分主要有木兰花碱、异紫堇定碱、蝙蝠葛苏林碱、紫堇达明碱、千金藤定碱、蝙蝠葛碱、杏黄罂粟碱；抗肿瘤成分主要有千金藤定碱、异紫堇定碱、蝙蝠葛苏林碱、木兰花碱、蝙蝠葛碱、紫堇达明碱、杏黄罂粟碱、青藤碱，表明北豆根配方颗粒可能通过多组分协同发挥抗炎、抗肿瘤作用，且主要组分基本相同.
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北豆根配方颗粒抗炎、抗肿瘤PPI网络图见图 7. 如图所示，抗炎网络中共包括128个结点、690条相互关系，排名前10的靶点分别为HSP90AA1，SRC，STAT3，MAPK3，MAPK1，PIK3CA，EGFR，AKT1，JUN，MAPK8. 抗肿瘤网络中共包括127个结点、858条相互关系，排名前10的靶点分别为MAPK8，MAPK14，CDK2，ERBB2，EGFR，HSP90AA1，JUN，HDAC1，SRC，AKT1.
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利用David数据库对抗炎作用相关共同靶点和抗肿瘤作用相关共同靶点进行GO富集分析，选取生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)中p值排名前10的条目导入微生信在线软件，绘制GO生物功能富集条形图，如图 8所示. 抗炎作用GO功能分析揭示了595个生物过程，主要包括蛋白质磷酸化、丝裂原活化蛋白激酶级联的正向调节、炎症反应；83个细胞组成，主要涉及细胞质膜、受体复合物、质膜的组成成分等；138个分子功能，主要涉及蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、三磷酸腺苷结合等. 抗肿瘤作用GO功能分析最终得到835个条目，其中BP条目615个，主要与蛋白质磷酸化、蛋白质自磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化等功能有关；CC条目87个，主要涉及受体复合物、质膜、细胞质基质等；MF条目133个，主要涉及蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、三磷酸腺苷结合、蛋白激酶活性等.
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KEGG通路富集分析可知，北豆根配方颗粒抗炎作用、抗肿瘤作用可能与癌症信号通路(Pathways in cancer)、表皮生长因子受体信号通路(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、内分泌(Endocrine resistance)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等相关. 北豆根配方颗粒发挥抗炎、抗肿瘤作用的途径可能相似(图 9).
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一般认为结合能小于0时表明配体可以自发地与受体结合，且能量越低，结合的可能性越大. 当结合能小于-5.0 kcal/mol时说明配体具有良好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol说明具有强烈的结合活性，且数值越低表明结合强度越大[24]. 7个代表性成分均为网络药理学筛选出来抗炎、抗肿瘤主要成分，且经对照品比对，其与7个核心靶点的分子对接结果见表 2，结合能均低于-5.0 kcal/mol，说明7个成分均可以较好地与靶点结合. 其中蝙蝠葛苏林碱、千金藤定碱、木兰花碱与SRC，ERBB2，MAPK8，MAPK3，HSP90AA1，STAT3和CDK2的结合能均低于-7.0 kcal/mol，表明该成分与以上核心靶点结合能力较强，潜在生物活性较高. 蝙蝠葛苏林碱与靶点的分子对接可视化结果见图 10. 如图 10所示，SRC与蝙蝠葛苏林碱形成氢键的作用位点包括TYR-90，THR-247，LYS-401，LEU-322，HIS-319；ERBB2与蝙蝠葛苏林碱形成氢键的作用位点为THR-862和ARG-849；MAPK8与蝙蝠葛苏林碱形成氢键的作用位点为ASN-114；MAPK3与蝙蝠葛苏林碱形成氢键的作用位点为LYS-71和LYS-168；HSP90AA1与蝙蝠葛苏林碱形成氢键的作用位点为LYS-58；STAT3与蝙蝠葛苏林碱形成氢键的作用位点包括LEU-260，GLN-247，GLU-324，GLN-326，ALA-250；CDK2与蝙蝠葛苏林碱形成氢键的作用位点为LEU-83.
2.1. 北豆根配方颗粒成分鉴定
2.1.1. 单苄基异喹啉类
2.1.2. 双苄基异喹啉类
2.1.3. 阿朴菲类及氧化异阿朴菲类
2.1.4. 吗啡烷类
2.1.5. 原小檗碱类
2.2. 基于网络药理学预测北豆根配方颗粒目标成分抗炎、抗肿瘤作用机制
2.2.1. 北豆根配方颗粒活性成分及靶点筛选
2.2.2. “药物—有效成分—靶点”网络构建
2.2.3. PPI网络构建及核心靶点筛选
2.2.4. GO功能分析
2.2.5. KEGG通路富集分析
2.3. 分子对接
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北豆根配方颗粒作为新型中药饮片已经获得广泛的应用，但其化学物质基础及作用机制研究仍然滞后，不利于其质量控制及在临床的进一步推广. 为了阐明北豆根配方颗粒的功效物质基础与作用机制，从而确保临床用药的安全性和有效性，本试验首次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对北豆根配方颗粒中的化学成分进行系统分析，通过网络药理学和分子对接对其抗炎、抗肿瘤作用机制进行研究. 本研究鉴定出包括阿朴菲类、双苄基异喹啉类、吗啡烷类等33个生物碱类化合物，并筛选出与北豆根配方颗粒抗肿瘤、抗炎活性相关的主要活性成分为木兰花碱、异紫堇定碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱、紫堇达明碱、千金藤定碱、杏黄罂粟碱. 木兰花碱可通过调控NF-κB，MAPK，PI3K/Akt信号通路来发挥免疫抑制作用从而对抗炎症[25]，也可通过miR-410-3p，HMGB1，NF-κB信号通路抑制肿瘤细胞[26]. 异紫堇定碱发挥抗肿瘤作用与STAT3，G2/M，ERK信号通路有关[27-29]. 蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱为双苄基异喹啉类生物碱，有研究表明二者均可抑制Ca2+-CaM通路来发挥抗炎作用[30]，并通过PI3K/Akt信号通路发挥抗肿瘤作用[31-32].
网络药理学研究发现北豆根配方颗粒与肿瘤、炎症的关系最密切的潜在靶点主要有SRC，STAT3，HSP90AA1，MAPK，AKT1，EGFR，CDK2，ERBB2，JUN等. SRC是酪氨酸蛋白激酶家族中的一员，主要介导细胞的生长、分化和凋亡信号的转导，对细胞的正常发育与生长起着重要的调节作用，SRC通过激活STAT3信号，可以加重炎症及相关癌的发生，抑制SRC被认为是治疗肿瘤的一种很有前景的方法[33-34]. EGFR是表皮生长因子受体(HER/ERBB)家族成员之一，它在肿瘤无限制生长、抗凋亡、侵袭和转移中发挥重要作用[35]，EGFR已被证明与肿瘤的发生、发展有直接联系[36]. HSP90AA1是热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)家族的重要成员，它是一种位于人类14号染色体上的癌组织基因，其编码的HSP90α蛋白与细胞的创伤修复和炎症密切相关，是近年来一直受到高度关注的肿瘤筛查指标[37-38]. CDK2是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)家族中重要成员之一，可以有序驱动真核生物的细胞周期，其含量或活性直接影响肿瘤细胞的分化、衰老和凋亡[39-40]. ERBB2是受体ERBB家族中的一员，是一种跨膜受体酪氨酸激酶，通过下游信号网络，将胞外信号向胞内传导，从而实现对细胞增殖、分化、迁移和凋亡的调控，目前，ERBB2已成为肿瘤靶向药物开发的一个有效靶点[41-42]. 本试验研究结果均与上述报道一致，并选择了7个代表性化学成分进行了分子对接. 结果表明，蝙蝠葛苏林碱等7个成分均可以较好地与靶点结合，其中蝙蝠葛苏林碱、千金藤定碱、木兰花碱的结合能均低于-7.0 kcal/mol，与核心靶点结合能力较强，潜在生物活性较高，验证了网络药理学的可靠性.
GO功能富集分析结果表明，核心靶点主要涉及的生物学过程包括蛋白质磷酸化、丝裂原活化蛋白激酶级联的正向调节、炎症反应、蛋白质自磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化、激酶活性的正向调节等，这些过程与北豆根配方颗粒所具有的抗炎、抗肿瘤作用相关，表明所鉴定的北豆根配方颗粒成分具有一定的代表性.
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本研究鉴定了北豆根配方颗粒化学成分，发现其发挥抗炎、抗肿瘤作用的主要物质基础可能为木兰花碱、异紫堇定碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱、紫堇达明碱、千金藤定碱、杏黄罂粟碱，通过作用于SRC，STAT3，HSP90AA1，MAPK，AKT1，EGFR，CDK2，ERBB2，JUN等多个核心靶点发挥抗炎、抗肿瘤作用. 以上研究为阐明后续北豆根配方颗粒物质基础、作用机制、临床应用研究提供了基础.
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