西南大学学报 (自然科学版)  2018, Vol. 40 Issue (9): 29-34.  DOI: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.09.005
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  • 均匀设计法优选抗雏鸡白痢翁苋颗粒    [PDF全文]
    魏薇, 石磊, 刘娟, 黄文鹏, 莫孔源, 陈晓     
    西南大学 兽医科学工程研究中心中药创新研究室, 重庆 荣昌 402460
    摘要:利用均匀设计法及回归分析优选抗雏鸡白痢的中药组方翁苋颗粒.结合中兽药组方原则,将白头翁、马齿苋、苍术、陈皮等中药进行组方配伍,采用均匀设计法及回归分析,以不同配比的翁苋颗粒对鸡白痢沙门氏菌的体外抑菌效果作为考察指标,运用中兽医整体观念及体外抑菌活性评价筛选最优处方.采用腹腔注射鸡白痢沙门氏菌菌液的方法复制雏鸡白痢的病理模型,通过在饲料中添加一定比例的翁苋颗粒,于试验后统计有效率、治愈率.翁苋方28的组分配比为最佳处方,最优处方配比的翁苋颗粒高剂量组对雏鸡白痢的治愈率、有效率均为91.7%.该试验筛选出的优化复方制备处方翁苋颗粒能够有效防治雏鸡白痢.
    关键词翁苋颗粒    均匀设计    回归分析    鸡白痢    抑菌    

    鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的任何日龄的鸡均可发生的一种传染病,雏鸡发病表现出急性败血性经过,以发热、拉灰白色粥样或粘性液状粪便为特征[1].在集约化、高密度生产条件下,不仅鸡白痢的发生日益严重,而且在流行、发生、药敏及用药途径等方面出现了一些新变化[2].目前,抗菌药物的应用仍然是其防治的重要手段.由于大量抗生素的使用,导致沙门氏菌的耐药性逐渐增加和残留[3-4].因此,寻求防治鸡白痢等细菌性疾病疗效好、无抗药性、低残留的药物是当前防治鸡白痢急待解决的课题之一.中草药不仅具有防病治病,促进生长发育的作用,而且还能提高生产性能,调节机体免疫力,且对沙门氏菌有明显的抑杀作用[5-6].

    均匀设计主要通过让试验点在其试验范围内“均匀分散”,通过计算机运用多元逐步回归统计分析各实验因素对实验结果的影响,得出理论的最佳优化实验参数[7].将中药复方组分划分成多个剂量水平,运用均匀设计方法进行优化,使试验样本能够充分反映中药复方不同组分配伍情况,结合有关药效学模型筛选中药有效组分药物之间的最佳配比[8].本次试验按照中兽医整体观念及方剂组成原则,选用白头翁、苍术、马齿苋、五倍子等7味中药组成中药组方翁苋颗粒.运用均匀设计对翁苋颗粒进行中药类组分配伍的初步研究,筛选出一种抗雏鸡白痢的中药组方最佳配伍,为临床防治鸡白痢提供新的手段和技术.

    1 材料与方法 1.1 试验动物和菌种

    120只健康三黄鸡,购自四川刘氏种禽场,雌、雄各半,体质量为45.4~46.0 g.鸡白痢沙门氏菌由西南大学荣昌校区微生物实验室提供.

    1.2 试验药品及试剂

    翁苋颗粒,由西南大学荣昌校区兽医科学研究中心中药创新研究室研制;鸡痢灵散,广东省天宝生物制药有限公司,批号:20141101;营养琼脂,北京奥博星生物技术有限责任公司,批号:20150202;营养肉汤,青岛高科园海博生物技术有限公司,批号:20140312;其他试剂均为分析纯.

    1.3 牛津杯法测定翁苋颗粒对鸡白痢沙门氏菌的抑菌作用

    本试验设计为7因素30水平.其中,白头翁、马齿苋等7味中药为7个因素,各药物的不同配比为水平数.用Uniform Design Version 3.00软件筛选出U30(3013)表安排试验,其设计水平见表 1.将各组不同配比的翁苋颗粒用传统煎煮法[9]提取中药药液,药液经80 ℃恒温水浴浓缩至生药量1 g/mL. 115 ℃高压灭菌20 min,4 ℃保存备用.用牛津杯法[10]做翁苋颗粒对鸡白痢沙门氏菌的体外抑菌试验,用移液枪吸取0.2 mL的灭菌药液到牛津杯中,将平皿放入培养箱37 ℃恒温培养24 h.用96孔板法[11]测定翁苋颗粒对鸡白痢沙门氏菌的MIC(最小抑菌浓度)值,每组药做3个平行小组.药物和菌液上样完毕后,保鲜膜覆盖表面,置于37 ℃培养18~24 h.将每一组药物第2~10孔在SS琼脂培养基上分区划线接种,37 ℃培养箱中培养6 h后取出,观察平皿上细菌生长的情况,判定翁苋颗粒的最小抑菌浓度.

    表 1 U30(3013)均匀试验设计
    1.4 翁苋颗粒的制备

    向翁苋方28的提取液中加入占提取液总量30%的玉米淀粉和1%的蔗糖,迅速搅拌至混合均匀,向混合液中加入少量的水,将混合物揉搓至干燥的分散体状,过12目筛制成颗粒物,将颗粒物置烘箱中,60 ℃烘干8 h.

    1.5 对人工感染鸡白痢雏鸡防治效果试验分组及处理

    将120只1日龄雏鸡随机分为空白组、模型组、阳性药物组、翁苋颗粒高、中、低剂量组,每组20只,空白组、模型组给予生理盐水,阳性药物组给予0.5 g/只鸡痢灵散,翁苋颗粒高、中、低剂量组分别给予0.5 g/只、0.3 g/只、0.1 g/只的用量拌料饲喂,2次/d,连续7 d后模型组与各药物组雏鸡腹腔注射含4.9×107 CFU鸡白痢沙门氏菌的菌液.随后,各药物组再连续喂药7 d.

    模型建立判定标准[12-13]:攻毒后1 d雏鸡排出白色粪便,剖检可见心肌有灰白色粟粒样节,肝肿大、被膜下有灰白色坏死灶.细菌学检查:病料压片镜检为革兰氏阴性小杆菌,接种于麦康凯培养基上,37 ℃,24 h,生长出较密集的圆形、光滑、湿润和半透明无色小菌落.显微镜下可见粉红色、两端钝圆的小杆菌.

    防治效果判定标准[13]:①有效,在试验期间,给药后鸡的精神状态好转、食欲恢复;②治愈,在试验期间,给药后鸡的精神状态和食欲恢复正常,不再出现白色稀粪等临床症状的均属治愈;③死亡,在试验期间,出现鸡白痢病的典型症状并死亡,剖检有典型的特征性病变,并从肝脏、脾脏或肺脏中分离培养出鸡白痢沙门杆菌的判断为感染死亡.

    1.6 数据处理

    试验数据用Uniform Design Version 3.00作逐步回归分析,用SPSS 20.0统计软件进行显著性检验和方差分析.

    2 结果与分析 2.1 翁苋颗粒对鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果

    根据药物敏感试验判定标准[14],翁苋颗粒对鸡白痢沙门氏菌均极度敏感,翁苋方21的药物配比对鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果最佳.体外抑菌试验结果显示,翁苋方11、翁苋方21的MIC值最小,试验结果详见表 2.用均匀设计软件Uniform Design Version 3.00对抑菌圈直径试验结果作逐步回归分析,建立函数模型.方差分析中R2=0.988 5,F=2 400,F1,28(0.01)=7.636,FF1,28(0.01),回归方程在置信度为99%的水平下显著.拟建的函数模型可行,组方最佳用量取决于X6(五倍子)的值,X6(五倍子)的用量越大,Y值(抑菌圈直径)越大.

    表 2 翁苋颗粒对鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果(x±SD)
    2.2 翁苋颗粒对人工感染鸡白痢雏鸡的防治效果

    试验结果显示,模型组雏鸡排白色粪便,抽取雏鸡病理剖检发现肝肿大、被膜下有灰白色坏死点,心肌有灰白色粟粒样结节,细菌学检查符合鸡白痢沙门氏菌判定标准.翁苋颗粒高、中剂量组和阳性药物组雏鸡精神、食欲无特殊异常状况,无典型的鸡白痢临床症状;翁苋颗粒低剂量组有少数雏鸡表现精神抑郁、食欲欠佳,有轻微腹泻的临床症状.试验前、攻毒后各组分别取4只雏鸡剖检采样,统计攻毒后至试验后各组雏鸡的治愈率和有效率.翁苋颗粒高剂量组与阳性药物组治愈率、有效率最高,均为91.7%;翁苋颗粒中剂量组治愈率、有效率均为83.3%;翁苋颗粒低剂量组治愈率为75%,有效率为83.3%.

    3 讨论

    均匀设计为中药复方配伍理论及制剂工艺优化展开了一条新的探索思路和方法,并为复方中各味中药的剂量配比优化提供了可能,为研究复方作用于临床疾病的已知途径的效应组分提供理论依据[7].运用均匀设计方法对经方进行研究,把其所对应的“证”作为考察指标,有助于深入认识“方证”的科学内涵[15].我们以中医药理论为指导创制了防治雏鸡白痢的翁苋颗粒,在确定药物用量时为了探索更加客观、可靠的药物用量筛选标准和方法,选择了制剂学中常用的均匀设计方法.体外抑菌试验是考查抗细菌性疾病药物常用的简便而灵敏的指标,用来作为药效学判断标准.试验结果表明,翁苋颗粒各药物组合都有不同程度的抑菌效果.运用相关软件进行分析,得出了回归方程,从中可观察出各药对作用效果的贡献大小及优化用量的信息.

    鸡白痢沙门杆菌病是危害养殖业的一种主要传染病[16],按照中兽医理论,该病属湿热注入下焦,引起气机阻滞,升降失常而致泻下,湿热壅滞大肠,脾虚气滞,治宜清热燥湿,解毒止泻[17-18].因此,选用清热解毒,凉血止痢功效[19-20]的白头翁、马齿苋,清燥湿健脾和消食化积功效[21-22]的苍术、陈皮,以及清涩肠止泻、止痛、行气消积功效[23-25]的五倍子、白芍、厚朴.白头翁对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌最敏感,其次对志贺菌、枯草杆菌、伤寒杆菌等亦呈明显的抑制效应,其抗菌的有效成分为原白头翁素[26].马齿苋可食用,部分茎、叶中含有多种蛋白质、糖类等营养成分,研究证实马齿苋的根、茎叶提取物均对鸡白痢沙门氏菌有抑菌作用[27].苍术的挥发油中主要成分为β-胺叶油醇、二苯基-4-甲醛、β-胺叶烯、α-胺叶油醇和茅术醇等,其挥发油对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞等病原菌有显著的抑制和灭活作用[28].中药材五倍子的主要化学成分是鞣质,五倍子具有抗菌、抗病毒等作用,五倍子水提物对沙门氏菌抑制效果显著[23, 29].厚朴煎剂具有广谱抗菌作用,其煎剂在体外对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用[25].由于五倍子是收敛药,而雏鸡腹泻初期不宜大量使用收敛药,根据中兽医整体观念,选用翁苋方28制备颗粒并用于雏鸡白痢的防治试验.

    通过体外抑菌试验,结合中兽医整体观念及辨证论治原则,优选出翁苋颗粒的最佳配比,并用该配方进行雏鸡白痢的防治试验,通过统计试验后各组雏鸡的治愈率和有效率,证明该配方有显著的抗腹泻等功效,能有效防治雏鸡白痢.本次试验筛选出的优化复方制备处方翁苋颗粒能够有效防治雏鸡白痢.

    参考文献
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    Prescription Optimization of the Anti-Pullorosis Traditional Chinese Veterinary Medicine "Weng Xian Granule" with the Uniform Design Method
    WEI Wei, SHI Lei, LIU Juan, HUANG Wen-peng, MO Kong-yuan, CHEN Xiao     
    Traditional Chinese Medicine Innovation Laboratory, Veterinary Science Engineering Research Center, Southwest University, Rongchang Chongqing 402460, China
    Abstract: Objective:To optimize of the prescription of Weng Xian granule, a tradtional Chinese veterinary medical preparation based on Pulsatilla chinensis and Portulaca oleracea L., for pullorosis resistance. Methods:Weng Xian granules were prepared with Pulsatilla chinensis, purslane (Portulaca oleracea L.), Rhizoma atractylodis, Pericarpium citri reticulatae and other traditional Chinese medicine as ingredients with different proportions, and uniform design and regression analysis were used to evaluate the anti-pullorosis effects of different prescriptions with their bacteriostasis in vitro on Salmonella bacteria as the indicator. The wholism concept of traditional Chinese medicine and the evaluation of bacteriostasis activity in vitro were used to optimize the best prescription. The pathological model of pullorosis was made by intraperitoneal injection of Salmonella bacteria, a certain proportion Weng Xian granule was added in the feed and, finally, the effective rate and cure rate were counted. Results:The experiment showed that the Weng Xian prescription No. 28 was the best ratio, both the effective rate and cure rate of the optimal prescription in the high-dose group being 91.7%. Conclusion:The optimized prescription of Wen Xian granule in this experiment can effectively prevent and control pullorosis.
    Key words: Weng Xian granule    uniform design    regression analysis    pullorosis    bacteriostasis    
    X