西南大学学报 (自然科学版)  2019, Vol. 41 Issue (10): 1-10.  DOI: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.10.001
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  • 宁夏地区葡萄卷叶伴随病毒遗传变异的PCR-SSCP分析    [PDF全文]
    李文学, 吕苗苗, 胡丽杰, 闫思远, 孙牧笛, 顾沛雯     
    宁夏大学 农学院, 银川 750021
    摘要:宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄卷叶病病株率较高,严重影响了酿酒葡萄产业的健康发展,但有关其病原葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaVs)的遗传变异情况则鲜有报道.利用RT-PCR技术对宁夏酿酒葡萄不同种植区的7个主栽品种的GLRaV-1和GLRaV-3进行分子检测,利用SSCP技术对扩增片段进行遗传变异分析.试验结果共获得8个GLRaV-1和13个GLRaV-3的阳性样本.8个GLRaV-1分离物基于CP基因分析差异明显,可分为3类;13个GLRaV-3分离物基于RdRp基因分析差异明显,可分为3类,而基于CPHSP70基因分析可分为2类.说明宁夏酿酒葡萄不同种植区、不同品种的GLRaV-1和GLRaV-3种群分子特性存在差异且遗传变异明显.这有助于宁夏地区酿酒葡萄GLRaVs流行学调查和分子诊断分析,为该病害的防控提供理论依据.
    关键词葡萄卷叶伴随病毒    遗传变异    RT-PCR检测    SSCP    宁夏贺兰山东麓    

    宁夏酿酒葡萄主栽区为贺兰山东麓的狭长地带,其独特地理气候优势为酿酒葡萄生长提供了一个理想的环境,但葡萄病毒病尤其是葡萄卷叶病危害严重,降低了酿酒葡萄的产量和品质,也影响了宁夏酿酒葡萄产业的发展.与葡萄卷叶病相关的病原为葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaVs),目前已报道的GLRaVs至少有5种,分别是GLRaV-1,GLRaV-2,GLRaV-3,GLRaV-4 (包括GLRaV-4的变种GLRaV-5,GLRaV-6,GLRaV-9,GLRaV-De,GLRaV-Pr和GLRaV-Car)和GLRaV-7[1-3].在国内各葡萄产区,感染葡萄卷叶病的葡萄园中GLRaV-1和GLRaV-3发生最为普遍,报道也最多[4-7].

    2016年,吕苗苗等[7]对宁夏各种植区的8个主栽酿酒葡萄品种田间自然发病情况进行了调查,发现树龄8年以上的葡萄园GLRaVs的感染率均在50%以上,个别品种如“蛇龙珠”和“黑比诺”的发病率高达85.1%和52.7%. 2009年,顾沛雯[8]通过对CP基因的克隆和序列比对,研究GLRaV-3株系间的差异. 2018年,吕苗苗等[9]通过CPRdRpHSP70基因检测宁夏酿酒葡萄GLRaVs种类,检出率最高的为GLRaV-1和GLRaV-3.目前,宁夏地区已报道的GLRaVs检出种类主要为GLRaV-1,GLRaV-3和GLRaV-5[7-10].

    单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)技术是一种有效检测已知基因点突变或未知变异分析的方法[11-12]. Turturo[13]利用SSCP技术对14个国家的GLRaV-3的变异进行了综合分析,发现不同分离物间存在分子差异.目前,国内对GLRaVs的研究主要集中在检测技术的优化[8, 14-16]和无毒苗木的培育[17-19]等方面,而对GLRaVs的遗传变异研究较少.

    本研究在已有研究基础上,对宁夏两个酿酒葡萄主产区的15份GLRaVs样本展开研究,以GLRaV-1和GLRaV-3分离物为研究对象,利用SSCP技术进行其遗传变异分析,初步揭示宁夏GLRaV-1和GLRaV-3种群的分子特性,本研究将有助于宁夏地区酿酒葡萄品种GLRaVs流行学调查和分子诊断分析,为该病害防治提供理论依据.

    1 材料与方法 1.1 材料

    供试材料均采自宁夏银川和永宁地区,分别为银川地区志辉源石酒庄、新牛酒庄和广夏三基地;永宁地区立兰酒庄、新惠彬酒庄、玉泉营农垦东大滩和玉泉营农垦南大滩.酿酒葡萄品种为赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龙珠(Cabernet Gernischt)、黑比诺(Pinot Noir)、霞多丽(Chardonnay)、品丽珠(Cabernet Franc)、西拉(Shiraz)和梅鹿辄(Merlot).酿酒葡萄病株样品采集情况见表 1.

    表 1 供试酿酒葡萄病株样本基本情况
    1.2 GLRaVs的分子检测 1.2.1 引物序列

    依据文献资料[5, 20-21],登录NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)设计GLRaV-1和GLRaV-3的特异性引物(表 2),引物由上海生工生物工程股份有限公司合成.

    表 2 GLRaV-1和GLRaV-3的特异性引物序列
    1.2.2 RNA提取方法

    葡萄叶柄韧皮部组织100 mg,加入液氮迅速研磨至粉末状,并迅速转移至1.5 mL离心管中,按照提取植物总RNA试剂盒(美国OMEGA公司)使用说明书进行总RNA的提取.

    1.2.3 RT-PCR检测

    将提取的总RNA,利用转录试剂盒(全式金公司)反转录成cDNA,反应体系为20 μL:总RNA 4 μL,OligDT18 Primer 1 μL,RNase-free Water 3 μL,65 ℃温浴5 min,冰浴2 min;加入2×TSReaction Mix 10 μL,TransScriptTMRT 1 μL,gDNA Remover 1 μL,轻轻混匀,42 ℃孵育30 min,85 ℃加热5 s,失活TransScriptTMRT和gDNA Remover,即得到所需的cDNA.

    利用GLRaV-1和GLRaV-3特异性引物对15个样品进行病毒检测. PCR扩增反应体系为25 μL:总cDNA 1.5 μL,正、反向引物各1 μL,Maxtaq酶12.5 μL,RNase-free Water 9 μL;PCR扩增条件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ ∞.用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测,阳性样品PCR产物备用.

    1.3 SSCP分析 1.3.1 溶液配制

    配制30%聚丙烯酰胺(交联度29:1),10%过磷酸铵(APS)溶液,PCR-SSCP变性缓冲液,10× TBE Buffer,固定液,0.2%银染液和显色液.

    1.3.2 SSCP检测

    按比例配制制备胶:30%聚丙烯酰胺8 mL,5×TBE 6 mL,10% APS 250 μL,TEMED 35 μL,ddH2O补足30 mL,置4 ℃冰箱预冷30 min.阳性样品PCR产物4 μL加入至6 μL变性缓冲液中,混合均匀后95 ℃水浴变性10 min后,立即冰浴5 min,迅速上样,4 ℃条件下160 V电泳45 min.

    1.3.3 银染过程

    将胶板割下,清水冲洗;加入固定液固定7 min,清水轻轻冲掉固定液;再用银染液银染10 min,清水冲洗;后用显色液显色7 min,冲洗显色液后进行观察,拍照保存.

    1.4 聚类分析

    非变性聚丙烯凝胶电泳(非变性PAGE)中单链DNA空间构象的位阻实现不同条带的表达[22]. GLRaV-1和GLRaV-3阳性克隆PCR产物进行SSCP分析,利用统计软件SPSS 19.0对各样品在非变性PAGE中的条带数和迁移长度进行数据处理并构建树状聚类.

    2 结果与分析 2.1 DNA提取与质量检测

    按照提取RNA试剂盒(美国OMEGA公司)使用说明书进行总RNA的提取,所有提取的RNA样本凝胶电泳检测有两条清晰明亮带,分别为28S rRNA和18S rRNA;其OD 260/280值介于2.0~2.2之间,完整性和纯度较好,满足RT-PCR要求.

    2.2 GLRaV-1 CP基因的RT-PCR检测

    利用GLRaV-1 CP基因的序列特异性引物进行RT-PCR检测,检出8个阳性样本在230 bp位置出现亮带(图 1),与预期的GLRaV-1 CP基因序列大小相符.

    M:Marker;1:清水对照;2-16:同表 1顺序1-15. 图 1 GLRaV-1 CP基因的RT-PCR检测结果
    2.3 GLRaV-3 CPHSP70和RdRp基因的RT-PCR检测

    利用GLRaV-3 CPHSP70和RdRp基因的序列特异性引物进行RT-PCR检测,检出13个阳性样本分别在940,540和680 bp位置出现亮带(图 2),与预期的GLRaV-3 CPHSP70和RdRp基因序列大小相符.通过GLRaV-3的CPHSP70和RdRp基因检测发现,阳性样品的检测率一致.

    M:Marker;1:清水对照;2-16:同表 1顺序1-15. 图 2 GLRaV-3 CPHSP70和RdRp基因的RT-PCR检测结果
    2.4 GLRaV-1和GLRaV-3 PCR产物的SSCP分析 2.4.1 GLRaV-1 CP基因PCR-SSCP分析

    8个GLRaV-1 CP基因的阳性样本PCR产物在非变性PAGE中,实现了不同条带的表达.结合样本在SSCP图谱(图 3a)中的迁移长度进行树状聚类分析(图 3b),发现8个分离物之间有明显差异,可归为3类:分离物XHB-P,XHB-S和XHB-XL的相似性很高,带数均为4条,迁移长度为1.7 cm,归为Ⅰa类;XHB-C,DDT-S和DDT-C的相似性很高,带数均为3条,迁移长度为1.5 cm,归为Ⅰb类;LL-X和XHB-H的相似性很高,带数均为2条,迁移长度为1.0 cm,归为Ⅰc类. 8个GLRaV-1分离物分布存在明显的地域性差异.永宁地区酿酒葡萄品种蛇龙珠得到的分离物XHB-S和DDT-S分别归为Ⅰa和Ⅰc类;而酿酒葡萄品种蛇龙珠和品丽珠的分离物XHB-S和XHB-P则归为Ⅰb类,从黑比诺和霞多丽得到的分离物XHB-H和LL-X则归为Ⅰc类.

    图 3 GLRaV-1 CP基因PCR扩增产物的SSCP图谱及树状聚类
    2.4.2 GLRaV-3 CP基因PCR-SSCP分析

    13个GLRaV-3 CP基因的阳性样本PCR产物进行SSCP分析,GLRaV-3 CP基因的SSCP图谱表现为2种带型(图 4a),结合在图谱中迁移的长度进行树状聚类分析(图 4b),发现13个分离物之间有明显差异,可归为2类:GLRaV-3 CP基因分离物LL-C,ZH-C,XN-S,DDT-S,LL-X,GX-P,XHB-P,GX-XL,NDT-M和GX-M的相似性较高,带数为1条,迁移长度为2.3 cm,归为Ⅱa类;分离物DDT-C,XHB-S和XHB-H的相似性较高,带数为2条,迁移长度为1.8 cm,归为Ⅱb类.

    图 4 GLRaV-3 CP基因PCR扩增产物的SSCP图谱及树状聚类
    2.4.3 GLRaV-3 HSP70基因PCR产物的SSCP分析

    对13个GLRaV-3 HSP70基因阳性样本PCR产物进行SSCP分析,GLRaV-3 HSP70基因的扩增产物图谱也表现为2种带型(图 5a),结合在图谱中迁移的长度进行树状聚类分析(图 5b),发现13个分离物之间有明显差异,可归为2类:GLRaV-3 HSP70基因分离物LL-C,ZH-C,XN-S,DDT-S,XHB-H,GX-P,XHB-P,GX-XL和GX-M的相似性较高,带数为1条,迁移长度为2.3 cm,归为Ⅲa类;分离物DDT-C,XHB-S,LL-X和NDT-M的相似性较高,带数为2条,迁移长度为1.8 cm,归为Ⅲb类.分离物XHB-H,LL-X和NDT-M的聚类结果与GLRaV-3 CP基因的聚类结果不一致,可能存在碱基变异.

    图 5 GLRaV-3 HSP70基因PCR扩增产物的SSCP图谱及树状聚类
    2.4.4 GLRaV-3 RdRp基因PCR-SSCP分析

    对13个GLRaV-3 RdRp基因阳性样本PCR产物进行SSCP分析,而GLRaV-3 RdRp基因的扩增产物图谱表现为3种带型(图 6a),结合在图谱中迁移的长度进行树状聚类分析(图 6b),发现13个分离物之间有明显差异,可归为3类:GLRaV-3 RdRp基因分离物ZH-C,XN-S,DDT-S,LL-X,GX-P,XHB-P,GX-XL和GX-M的相似性较高,带数为2条,迁移长度为2.5 cm,归为Ⅳa类;分离物LL-C,DDT-C和NDT-M的相似性较高,带数为3条,迁移长度为1.5 cm,归为Ⅳb类;分离物XHB-S和XHB-H的相似性较高,带数为2条,迁移长度为0.9 cm,归为Ⅳc类.

    图 6 GLRaV-3 RdRp基因PCR扩增产物的SSCP图谱及树状聚类
    2.5 宁夏地区不同品种间GLRaV-1和GLRaV-3种群差异

    表 3可知,应用PT-PCR和SSCP技术分析GLRaVs的遗传变异,对不同区域、不同品种分离得到的GLRaV-1和GLRaV-3种群遗传变异比较发现,同一地区不同品种、同一品种不同地区分离物检出GLRaV-1和GLRaV-3结果差异较大.阳性分离物DDT-C,XHB-S,DDT-S,XHB-P,XHB-H和LL-X均存在GLRaV-1和GLRaV-3的复合侵染现象,聚类分析结果也不相同,相互之间变异较大;永宁地区新惠彬酒庄葡萄园5大酿酒葡萄品种均检出GLRaVs,但检出结果不同;广夏三基地葡萄园3大酿酒葡萄品种均只检出GLRaV-3.从宁夏地区获得的13个GLRaV-3分离物之间存在着明显的地域分布性差异,且不同品种间也存在差异.永宁地区酿酒葡萄品种蛇龙珠GLRaV-3 CPHSP70和RdRp基因的阳性分离物XHB-S和DDT-S分别归为Ⅱb,Ⅲb,Ⅳc类和Ⅱa,Ⅲa,Ⅳa类,且DDT-S与银川新牛酒庄葡萄园阳性分离物XN-S的GLRaV-3检测结果一致,但XN-S未检测到GLRaV-1.永宁地区酿酒葡萄品种霞多丽的阳性分离物LL-X和品丽珠的阳性分离物XHB-P将GLRaV-3归为Ⅱa,Ⅲa,Ⅳa类,同一地区的不同品种间GLRaV-3变异程度具有相似性.酿酒品种赤霞珠阳性分离物LL-C和ZH-C只检出GLRaV-3,XHB-C只检出GLRaV-1,而DDT-C存在复合侵染;检出GLRaV-1的聚类分析结果一致,但检出GLRaV-3的阳性分离物LL-C,ZH-C和DDT-C聚类分析结果差异较大,同一品种不同地区GLRaV-1和GLRaV-3的侵染结果不同,且变异较大.

    表 3 供试样本GLRaV-1和GLRaV-3检出和归类
    3 讨论

    宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄产业发展早期,在葡萄病毒检测体系极不完善的情况下从美国、法国、河北昌黎和山东烟台等地引种栽培,在这种粗放式管理和大面积推广种植下,葡萄病毒得以快速在产区传播蔓延[23-24]. 1999年,宁夏玉泉营地区葡萄圃中26%的品种表现卷叶病症状,酿酒葡萄品种田间发病率为31.37%[25];2006-2009年,沙月霞等[10]的调查结果显示葡萄卷叶病发病率为36.0%;2016年,宁夏产区树龄8年以上的果园中主栽酿酒葡萄品种“蛇龙珠”和“黑比诺”田间自然发生葡萄卷叶病的发病率高达85.1%和52.7%[7].近年来,宁夏开展酿酒葡萄卷叶伴随病毒检测和无病毒苗木的培育工作时,主要检测出的3种病毒类型中GLRaV-1和GLRaV-3的检出率最高,GLRaV-3的研究最为广泛,同时存在GLRaVs的复合侵染现象[7, 9-10].葡萄卷叶伴随病毒病,属于RNA病害,由于RNA病毒复制快且缺乏校正机制,碱基错配重组极易发生[26],表现出高度变异. 2002年,刘命华等[27]对GLRaV-1 CP基因序列进行分析,发现其核苷酸和氨基酸同源性相对较低,暗示GLRaV-1分离物可能具有较高的遗传变异. 2011年,Alabi等[28]对美国34个GLRaV-1分离物的4个基因(CPHSP70,CPd2和P24)进行多样性分析,发现GLRaV-1 CP基因的变异性较高.本研究结果表明,8个GLRaV-1 CP基因分离物有3种类型,表现出较高的变异性,这与上述研究结果基本一致.一些学者对获得的GLRaV-3分离物CP基因进行序列比对分析和多样性分析,结果显示CP基因是GLRaV-3基因重组较活跃的区域,可能存在着基因变异,不同分离物间的基因重组形成了新的变异种[29-30]. Turturo等[13]利用SSCP技术对45个葡萄样品GLRaV-3 CPHSP70和RdRp基因的变异研究发现,上述基因存在多种不同类型的变异型,且GLRaV-3 CP基因的变异几率较大,而HSP70基因的变异几率较小,RdRp基因若发生变异定会引起GLRaV-3分子结构的变化.本研究结果显示,13个GLRaV-3 CPHSP70和RdRp基因分离物分别有多种不同类型,与上述研究结果相类似,可能由于宁夏地区早期大面积推广苗木自繁、嫁接等措施导致病毒的复合侵染,增加了基因重组的几率,致使出现多种变异类型.但宁夏GLRaV-3分离物表现的不同类型是否由基因重组导致,还需要进一步检测.

    4 结论

    利用RT-PCR技术对宁夏酿酒葡萄不同种植区的7个主栽品种的GLRaV-1和GLRaV-3进行分子检测,试验结果共获得8个GLRaV-1和13个GLRaV-3的阳性样本.说明GLRaV-1和GLRaV-3在宁夏不同种植区的酿酒葡萄品种间都有不同程度的侵染,且存在复合侵染.利用SSCP技术对扩增片段进行遗传变异分析,表明各分离物之间存在着明显的遗传变异. 8个GLRaV-1分离物基于CP基因分析差异明显,可分为3类;13个GLRaV-3分离物基于RdRp基因分析差异明显,可分为3类,而基于CPHSP70基因分析可分为2类.说明宁夏酿酒葡萄不同种植区、不同品种的GLRaV-1和GLRaV-3种群分子特性存在差异且遗传变异明显.分离物的遗传变异不仅表现在种植区的分布上,同时也表现在不同品种间.

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    PCR-SSCP Analysis of Genetic Variation Among GLRaVs in Ningxia
    LI Wen-xue, LÜ Miao-miao, HU Li-jie, YAN Si-yuan, SUN Mu-di, GU Pei-wen     
    Agricultural College, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
    Abstract: The rate of diseased plants of grapevine leaf roll disease is relatively high in the eastern Helan mountain region of Ningxia, which seriously hinders the healthy development of the wine grape industry, but the genetic variation of grapevine leafroll-associated viruses (GLRaVs), i. e. the pathogen of this disease, is poorly understood. In an experiment reported in this paper, PT-PCR technique was used to detect GLRaV-1 and GLRaV-3 of 7 widely cultivated wine grape cultivars in different growing regions of Ningxia, and the SSCP technology was employed to analyze the genetic variation of the amplified fragments. A total of 8 positive samples of GLRaV-1 and 13 positive samples of GLRaV-3 were obtained in the test. Based on the CP gene analysis, the 8 GLRaV-1 isolates showed significant differences, which were divided into 3 categories. The 13 GLRaV-3 isolates also showed significant differences, and they were divided into 3 categories based on RdRp gene analysis and into 2 categories based on CP and HSP70 gene analyses. The above results showed that there were significant differences and genetic variations in the population molecular characteristics of GLRaV-1 and GLRaV-3 which originated from different wine grape cultivars and from different grape-growing areas in Ningxia.
    Key words: grapevine leafroll-associated virus (GLRaVs)    genetic variation    RT-PCR detection    single-strand conformation polymorphism (SSCP)    the Helan mountain region of Ningxia    
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