西南大学学报 (自然科学版)  2019, Vol. 41 Issue (11): 25-29.  DOI: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.11.004
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  • 不同地区藏药达乌里秦艽MEKC指纹图谱研究    [PDF全文]
    李成思1,2,3, 卢永昌1, 王志波1, 张军文1, 白雪1, 宋仁君1    
    1. 青海民族大学 药学院, 西宁 810007;
    2. 青海省青藏高原植物化学研究重点实验室, 西宁 810007;
    3. 青海省药物分析重点实验室, 西宁 810007
    摘要:在最佳的毛细管电泳条件下建立达乌里秦艽指纹图谱.实验选择胶束毛细管电泳法,测得的指纹图谱具有11个共有峰.通过共有峰的相对保留时间和峰面积,可以衡量药材的质量及其真伪.实验方法的稳定性、精密度、重现性良好,说明实验方法准确可靠,可以为达乌里秦艽质量控制研究提供方法和思路.
    关键词达乌里秦艽    胶束毛细管电泳    指纹图谱    相似度    

    龙胆科植物达乌里秦艽(Gentiana dahurica Fisch)是青藏高原特有的多年生草本,常用于藏药方剂中,在《藏药方剂宝库》中出现上百次,如在培根瘀紫症方剂的代表方剂《九味秦艽散》中作君药,功效主治培根阻喉、中毒下泻、呕吐、黄水病、中毒病;《十三味甘青乌头散》中作为君药,功效主治清热解毒,镇静.治疗天花痘的代表方剂有《六味秦艽汤散》,用于赤巴引起的口渴、口苦、发热、失眠,恰牙虫引起的身痒,对热性赤巴病有裨益[1].为保证原料药的质量,通过建立药材指纹图谱,辨别原料药的真伪,同时对应用MEKC指纹图谱控制药材质量的方法起到推广效果.运用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》,将测得的10个MEKC图谱导入其中,生成10个不同地区的藏药达乌里秦艽MEKC叠加图[2-3].同时,应用SPSS 13.0统计软件对测得的达乌里秦艽胶束毛细管电泳的数量化特征进行系统聚类分析,可以有效地鉴别不同产地的达乌里秦艽药材[4].

    1 实验材料 1.1 仪器

    Agilent 7100毛细管电泳系统,梅特勒—托利多AL204型电子天平.

    1.2 药材

    达乌里秦艽,于2017年8-9月份采自青海,经中国科学院生物研究所卢学峰鉴定为龙胆科植物达乌里秦艽(Gentiana dahurica Fisch).药材信息见表 1.

    表 1 药材信息
    1.3 试剂

    异荭草苷(批号:MUST-1307250)、乙腈(色谱纯)、硼砂、十二烷基磺酸钠均为分析纯试剂、自制三重蒸馏水.

    2 方法 2.1 对照品溶液及样品溶液的制备

    异荭草苷对照品溶液:用80%甲醇配制,质量浓度为1.002 mg/mL.样品溶液制备方法:精密称取达乌里秦艽样品0.50 g,加10 mL的80%甲醇浸提12 h,后超声1 h,过滤后取少量甲醇洗涤滤器,将滤液完全转移至25 mL的容量瓶中,定容.使用时将溶液蒸干,加缓冲液溶解至5 mL即可.

    2.2 实验条件

    缓冲溶液:Ⅰ:分别称取1.91 g硼砂,1.63 g十二烷基磺酸钠于烧杯中,加适量蒸馏水溶解,完全转移至100 mL容量瓶中,定溶得浓度为50 mmol/L硼砂-60 mmol/L十二烷基磺酸钠的混合溶液. Ⅱ:乙腈.将Ⅰ和Ⅱ按5:1的比例混合后,调pH值至9.44.电泳参数为Voltage:18 kV;Cassette Temperature:20 ℃;Apply Pressure:5 kPa×5 s;Stoptime:60 min;毛细管规格:56 cm×50 μm,检测波长:254 nm[5].

    2.3 参照物的选择

    采用峰高增加法检测到试样中含异荭草苷,其出峰时间为28.323 min,在色谱图的中间处,宜选为参照峰.

    2.4 方法学考察[6-7] 2.4.1 稳定性实验

    按2.1的方法制备1份S1号达乌里秦艽样品,在最佳色谱条件下选择7个时间点,分3 d进行检测,第1天8:00开始,每隔2 h检测1次,共5次,第2天8:00检测1次,第3天8:00检测1次.计算7个时间点的色谱图共有峰相对保留时间(RT)和相对峰面积(RA)的RSD值,如表 2所示.该方法的稳定性良好.

    表 2 方法学考察结果 
    2.4.2 精密度实验

    按2.1的方法制备1份S1号达乌里秦艽样品,在最佳色谱条件下连续5次进样测得色谱图,计算共有峰的相对保留时间(RT)和相对峰面积(RA)的RSD值,如表 2所示.该方法的精密度良好.

    2.4.3 重现性实验

    按2.1的方法取5份S1号达乌里秦艽样品,在最佳色谱条件下检测其色谱图,计算各共有峰的相对保留时间(RT)及相对峰面积(RA)的RSD值,如表 2所示.该方法的重现性良好.

    2.5 实验结果 2.5.1 参照物

    根据峰高增加法鉴定达乌里秦艽色谱图中含有异荭草苷的色谱峰,其色谱峰在图谱中分离度较好,出峰时间适中,可作为参照峰.异荭草苷对照品色谱图如图 1所示.

    图 1 异荭草苷对照品
    2.5.2 MEKC指纹图谱

    按优化的电泳条件进行测试,测得达乌里秦艽10个地区供试品的MEKC色谱图,如图 2所示.应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统版软件》[8-9],将10个地区的达乌里秦艽色谱图导入其中,生成指纹图谱叠加图,如图 3所示.

    图 2 达乌里秦艽色谱图
    图 3 达乌里秦艽指纹图谱叠加图
    2.6 指纹图谱相似度分析 2.6.1 夹角余弦法

    根据夹角余弦法计算达乌里秦艽指纹图谱的相似度[10-11],计算结果见表 3.

    表 3 10个地区达乌里秦艽指纹图谱的相似度
    2.6.2 系统聚类分析

    采用系统聚类分析法测定达乌里秦艽指纹图谱的相似度[12],结果见图 4.聚类通过青海省地理方位分组,从图 4中得知S1,S2,S6,S7聚为一类,这4种药材来源地属于青海省南部.东经分别为102°,100.75°,101.5°,102°,北纬分别为35.54°,35.57°,35.03°,35.54°,其纬度相似,均在北纬35°附近.

    图 4 系统聚类图

    S3,S5,S8,S9,S10聚为另一类,东经分别为101.95°,102.92°,101.47°,99.03°,101.57°,北纬分别为36.84°,34.98°,36.02°,37.28°,36.49°,其经度有差异,纬度均大于北纬36°(除S5外),相比于第一类,纬度增大了. S5为北纬34.98°,其药材来源于甘肃省甘南藏族自治州. S4单独为一类.

    3 结语

    缓冲液种类的选择是实验的关键.为了达乌里秦艽中各个特征峰达到较好的分离度,本实验中采用了十二烷基磺酸钠(SDS),SDS容易起泡沫,因此采用有机溶剂消除,本实验选择了乙腈,当乙腈加入缓冲液的体积超过1/5时,缓冲液变浑浊,毛细管柱无法正常工作.缓冲液的pH值也是实验成功与否的关键,它直接影响峰形.毛细管电泳的电压大小与出峰时间呈正比,可根据情况适当调节.

    实验采用夹角余弦法、系统聚类分析法对10个地区达乌里秦艽指纹图谱相似度进行了分析,2种分析方法都显示出不同地区的达乌里秦艽存在差异,其中夹角余弦法计算结果可体现出更高的灵敏度,系统聚类分析方法却更加直观.结合这2种方法计算的结果体现出它们的相似度较高,反映了达乌里秦艽药材的同源性,可为提高青海省达乌里秦艽药材质量提供准确的技术依据.

    参考文献
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    Study of MEKC Fingerprint of the Tibetan Medicine Gentiana dahurica Fisch from Different Areas
    LI Cheng-si1,2,3, LU Yong-chang1, WANG Zhi-bo1, ZHANG Jun-wen1, BAI Xue1, SONG Ren-jun1    
    1. College of Pharmacy, Qinghai Nationalities University, Xining 810007, China;
    2. Key Laboratory of Plant Resources Chemical Research of Qinghai-Tibet Plateau in Qinghai Province, Xining 810007, China;
    3. Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai Province, Xining 810007, China
    Abstract: An MEKC (micellar electrokinetic chromatographic) fingerprint of Gentiana dahurica Fisch was established under optimal capillary electrophoresis conditions. The fingerprint had 11 common peaks. The relative retention time and peak area of the common peaks were used to measure the quality and authenticity of medicinal materials. This experimental method was shown to have good stability, precision and reproducibility and, therefore, is accurate and reliable and is recommended for quality control of G. dahurica Fisch.
    Key words: Gentiana dahurica Fisch    micellar capillary electrophoresis    fingerprint    similarity    
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