西南大学学报 (自然科学版)  2019, Vol. 41 Issue (2): 9-16.  DOI: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.02.002
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  • 茉莉酸甲酯对颠茄生长及其氮代谢的影响    [PDF全文]
    刘兴1,2, 张翠平2, 杨怡1,2, 韦悦3, 吴能表1     
    1. 西南大学 生命科学学院/三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆 400715;
    2. 沂水县第一中学, 山东 沂水 276400;
    3. 中国农业科学学院 棉花研究所, 新疆 昌吉 831100
    摘要:以颠茄(Atropa belladonna)幼苗为材料,研究了不同质量浓度(0,100,200,300和400 μmol/L)茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)处理不同时间(7,14,21和28 d)对颠茄鲜质量、光合色素和主要含氮化合物质量分数以及氮代谢关键酶活性的影响,为药材产量的提高提供理论依据.结果表明,随处理时间的延长,各质量浓度MeJA处理组中颠茄鲜质量、光合色素质量分数呈降低的趋势,并明显低于同时期对照(0 μmol/L);相反可溶性蛋白(SP)、游离脯氨酸(Pro)质量分数呈增加的趋势,其中低质量浓度(100,200 μmol/L)MeJA更能促进SPPro质量分数的积累.在MeJA处理28 d时,硝态氮质量分数显著降低(p < 0.05);硝酸还原酶(GS)与谷氨酰胺合成酶(NR)活性的变化趋于一致,呈先升高后降低趋势,均是在200 μmol/L MeJA处理时活性达到最高值,分别是对照的1.35倍和1.672倍.综上,MeJA能够抑制颠茄的生长,降低光合色素、硝态氮质量分数,而低质量浓度MeJA可提高SPPro质量分数以及GSNR活性,因此在颠茄人工栽培过程中喷施低质量浓度MeJA有利于颠茄的生长和氮素代谢.
    关键词颠茄    茉莉酸甲酯    生长    氮代谢    硝酸还原酶    谷氨酰胺合成酶    

    颠茄(Atropa belladonna)为茄科(Solanaceae)颠茄属(Atropa)的多年生草本植物,全草入药,具有解痉镇痛、麻醉镇静及止咳平喘等功效[1-2].近年来,人们对颠茄药材需求量逐渐增加,人工栽培已成为其主要的来源[3-4].但在人工栽培过程中,颠茄经常会受到干旱、病虫害等环境胁迫的影响,致使其莨菪碱(天仙子胺)、东莨菪碱(莨菪胺)和阿托品(颠茄碱)等主要次生代谢产物托品烷类生物碱(Tropane Alkaloids,TAs)质量分数低,从而影响颠茄药材的产量和品质[5-6].如何在人工栽培过程中提高药用植物产量,是目前值得研究的课题.茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)是一种新型植物内源生长调节物质,广泛存在于高等植物体内,对植物生长具有极为广谱的生理效应[7].研究发现MeJA可促进苦玄参(Picria feltearrae)成熟期提前,缩短苦玄参生育期,从而抑制苦玄参生物量的形成[8].李琳琳[9]研究表明,MeJA抑制了颠茄毛状根的生长,随着MeJA质量浓度越高对颠茄毛状根生长的抑制作用越明显,游离脯氨酸和可溶性蛋白质质量分数也有不同程度的变化.董桃杏等[10]研究了干旱胁迫下施用MeJA对水稻(Oryza sativa)幼苗的叶绿素荧光和光合作用特性的影响,结果表明干旱胁迫下外源MeJA处理可显著提高水稻幼苗的叶绿素质量分数、叶绿素荧光参数Fv/F0Fv/Fm值.徐曲毅[11]研究结果显示,MeJA在大田实验中都能稳定地促进各个品种大豆(Glycine max)的鲜质量、干质量和根瘤固氮酶活性,从而影响植物氮代谢途径.鉴于MeJA在植物生长发育和抗逆反应过程中的重要作用,近年来其在植物中的应用引起了植物学家广泛的关注,但关于MeJA对颠茄幼苗的生长和生理生化特性的影响尚未见报道.因此,本研究以颠茄幼苗为材料,通过添加外源MeJA,探究不同质量浓度MeJA不同时间处理下对颠茄生长生理和氮代谢相关生理指标的影响,以期为颠茄人工种植产量的提高作理论指导.

    1 材料与方法 1.1 实验材料

    颠茄种子购买于湖南永州,经西南大学生命科学学院吴能表教授鉴定为茄科颠茄属植物的颠茄(Atropa belladonna)种子.挑选大小一致的颠茄种子,先用蒸馏水清洗3次,用50 mmol/L赤霉素溶液进行浸种2 d,之后均匀地铺撒在有湿润滤纸的培养盘上,放置在25 ℃培养室中催芽,待种子萌发出两瓣子叶后,选取苗高一致的幼苗种植在高12 cm,直径13 cm的塑料营养盆中,基质为混匀介质(腐殖土、珍珠岩、蛭石比例为3:1:1),每钵3株,共200钵,放置于培养室中.培养室条件为温度为(25±1) ℃,相对湿度为60%~80%,光照为16 h/d,光强为400~500 μmol/(m2·s).每7 d对颠茄幼苗浇灌1次基本营养液,30 d培养后进行不同质量浓度的MeJA处理.基本营养液配方采用Hoagland营养液配方和Arnon营养液配方作为大量元素和微量元素,pH值为6.0[12].

    1.2 实验设计

    MeJA设置为4个水平,分别为100,200,300,400 μmol/L质量浓度,以喷施蒸馏水为对照(CK),其他条件均一致(表 1).待颠茄苗生长30 d后,每1 d喷施1次不同水平MeJA溶液的处理,喷施至颠茄幼苗叶片湿润为止,每个处理3个重复,每个重复4盆,每盆3株,各重复间随机排列.喷施MeJA溶液后分别在不同的处理时间7 d,14 d,21 d和28 d进行随机采样,样品于-80 ℃保存备用.

    表 1 不同时间不同质量浓度MeJA处理组
    1.3 指标测定与方法 1.3.1 鲜质量的测定

    每个处理每个时间段随机选取3株颠茄苗,从营养盆中取出后,用蒸馏水清洗干净颠茄苗表面土壤和灰尘,用吸水纸吸干水分,称鲜质量.

    1.3.2 叶绿素质量分数测定

    参照张宪政[13]的方法,称取0.2 g新鲜的颠茄叶片,剪碎成细丝,加入20 ml丙酮-乙醇混合液(1:1)中浸泡,暗处封口放置,待叶片组织变白后混匀,取上清液3ml在比色皿中,用紫外分光光度计在663 nm和645 nm下测定吸光度值,计算叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素质量分数.

    1.3.3 氮代谢生理指标测定

    游离脯氨酸(Pro)质量分数测定参照邹琦[14]的方法,采用茚三酮显色法;可溶性蛋白(SP)质量分数测定参照邹琦[14]的考马斯亮蓝(G-250)染色法;硝态氮质量分数测定参照高俊凤[15]的水杨酸比色法.

    谷氨酰胺合成酶(GS)活性测定参照王小纯等[16]的方法,一个GS活性单位定义为在15 min反应时间内催化形成1 μmol γ-谷氨酰异羟肟酸需要的酶量,GS总活性为每克新鲜样酶粗液在15 min反应时间内催化形成γ-谷氨酰异羟肟酸的μmol数.硝酸还原酶(NR)活性测定参照南京建成生物工程研究所的NR试剂盒(A096)说明书,一个酶活力单位U定义为每毫克植物组织在37 ℃条件下每分钟还原1.0 μmol硝酸盐为亚硝酸盐,在540 nm下测定的吸光值.

    1.4 数据分析

    采用Microsoft Excel (2010)和SPSS 22.0软件对所有实验数据进行统计分析,数据结果用平均值和标准误(X±S)表示.对同一处理时间不同处理组间进行单因素方差分析,并用Duncan法对各数据进行多重比较,显著水平为p<0.05.采用Microsoft Excel (2010)制图.

    2 结果与分析 2.1 不同质量浓度MeJA对颠茄幼苗生长的影响

    不同处理时间不同质量浓度MeJA处理下颠茄幼苗的生长状况不同(表 2).从整个MeJA处理时期来看,随着处理时间的延长,各MeJA处理组的颠茄鲜质量呈缓慢增长的趋势;但与同时期T1对照组相比,T1对照组颠茄鲜质量明显高于其他MeJA处理组,说明MeJA对颠茄幼苗的生长具有一定的抑制作用.在MeJA处理7 d时,T5处理组颠茄幼苗的鲜质量达到最低值,比T1对照组降低了29.05%;而T3,T4,T5处理组间差异无统计学意义(p<0.05).在MeJA处理14 d,21 d和28 d时,T3,T4和T5处理组随着天数的增加,处理组间差异无统计学意义(p<0.05),但鲜质量显著低于T2处理组和同时期T1对照组(p<0.05).由此可见,MeJA不仅抑制颠茄幼苗的生长,还随处理天数和MeJA质量浓度的增加而抑制作用增强,其中低质量浓度(100 μmol/L)MeJA对颠茄生长影响最小.

    表 2 不同质量浓度MeJA对颠茄鲜质量的影响
    2.2 不同质量浓度MeJA对颠茄叶片光合色素质量分数的影响

    不同处理时期不同质量浓度MeJA处理下颠茄叶片光合色素质量分数变化情况不同(图 1).在MeJA处理颠茄幼苗7 d时,除叶绿素b质量分数与T1对照组差异无统计学意义(p<0.05)外,颠茄叶片中叶绿素a质量分数和总叶绿素质量分数均呈下降的趋势.在MeJA处理14 d,21 d时,颠茄叶绿素a质量分数、叶绿素b质量分数和总叶绿素质量分数随之显著低于同时期T1对照组(p<0.05);其中总叶绿素质量分数与叶绿素a质量分数的变化趋于一致.在MeJA处理28 d时,T5组颠茄叶绿素a质量分数、叶绿素b质量分数和总叶绿素质量分数均达到最低值,较同时期T1对照组分别显著降低了30.04%,30.68%和30.22%,说明MeJA对颠茄光合色素的合成有一定的抑制作用,并随着MeJA质量浓度的增加而抑制作用增强.

    图 1 不同质量浓度MeJA对颠茄叶片光合色素质量分数的影响 小写字母不同表示相同处理时间不同质量浓度MeJA处理组间差异有统计学意义(p<0.05).
    2.3 不同质量浓度MeJA对颠茄主要含氮化合物的影响

    可溶性蛋白是植物体内主要的含氮化合物之一,它的质量分数对研究植物氮代谢水平具有一定的参考价值.不同质量浓度MeJA处理对颠茄叶片可溶性蛋白质量分数有不同程度的影响(图 2).在MeJA处理7 d时,T4,T5处理组中颠茄可溶性蛋白质量分数达到最高值,较同时期T1对照组明显增加了89%,88%;而T2,T3处理组与T1对照组相比,颠茄叶片可溶性蛋白质量分数差异无统计学意义(p<0.05).随着处理时间的延长,T3,T4,T5处理组中颠茄可溶性蛋白质量分数呈逐渐上升趋势,其中T3处理组中可溶性蛋白质量分数比T1对照组以及高质量浓度MeJA处理组(T4,T5组)显著增加.在MeJA处理14,21 d时,T2处理组中颠茄可溶性蛋白质量分数较同时期T1对照组相比呈增加的趋势;但在MeJA处理28 d时,T2处理组颠茄可溶性蛋白质量分数呈下降的趋势,而其他MeJA处理组中可溶性蛋白的质量分数在整个处理时期仍呈增加的趋势.由此可见,一定质量浓度范围内的MeJA能够促进颠茄叶片中可溶性蛋白质量分数的积累,其中200 μmol/L MeJA处理效果最明显.

    图 2 不同质量浓度MeJA对颠茄叶片可溶性蛋白的影响

    游离脯氨酸对植物有多种保护功能,在调节植物生长发育和代谢中起着重要的作用.不同处理时期不同质量浓度MeJA处理下,颠茄叶片游离脯氨酸质量分数变化不同(图 3).在MeJA处理7 d时,T2,T3处理组中游离脯氨酸质量分数显著高于T4,T5处理组和T1对照组(p<0.05),分别是对照组的1.138,1.106倍.在MeJA处理14,21 d时,颠茄叶片中游离脯氨酸质量分数随着处理天数的增加均呈逐渐增加的趋势,并显著高于同时期T1对照组(p<0.05).在MeJA处理28 d时,T2处理组中颠茄游离脯氨酸质量分数明显增加,并达到最大值,是T1对照组的2.861倍.在整个质量浓度MeJA处理期间,随着时间的延长,对照和低质量浓度(T2,T3组)MeJA处理组中游离脯氨酸质量分数均逐渐增加,同时MeJA处理组中游离脯氨酸质量分数显著高于对照组;不同的是高质量浓度MeJA处理组(T4,T5组)随天数的增加,颠茄中游离脯氨酸质量分数呈先上升后下降的趋势,并都在处理28 d时与对照相比游离脯氨酸质量分数差异无统计学意义(p<0.05),说明低质量浓度(100,200 μmol/L)MeJA处理可促进游离脯氨酸的积累.

    图 3 不同质量浓度MeJA对颠茄叶片游离脯氨酸质量分数的影响
    2.4 不同质量浓度MeJA对颠茄氮代谢的影响

    硝态氮是植物重要的氮源之一,对研究植物的氮代谢具有重要的作用.在MeJA处理28 d时,与T1对照组相比,MeJA处理组中颠茄硝态氮质量分数均显著降低(图 4),说明MeJA对颠茄硝态氮质量分数有显著影响(p<0.05).在整个MeJA处理组中,随着MeJA质量浓度的增加,颠茄叶片中硝态氮质量分数呈先下降后上升的趋势;其中T3处理组中颠茄硝态氮质量分数达到最低值,较T1对照组降低了35%;而在T5处理组中颠茄硝态氮质量分数与对照组差异较小,较T1对照组降低了9%.因此,MeJA对颠茄叶片中硝态氮质量分数有抑制作用,而200 μmol/L MeJA处理对颠茄叶片硝态氮质量分数的影响较大.

    图 4 不同质量浓度MeJA处理28 d对颠茄叶片硝态氮质量分数的影响

    硝酸还原酶(NR)与谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代谢过程中的关键酶.不同质量浓度MeJA处理对颠茄叶片中NR活性影响不同(图 5).在MeJA处理28 d时,MeJA处理组的NR活性显著高于T1对照组(p<0.05).在整个MeJA处理期间,颠茄NR活性的变化随着MeJA质量浓度的增加呈先升高后降低的趋势;在MeJA处理28 d时,T3处理组中颠茄NR活性较T1对照组显著增加了67.2%.由此可见,MeJA处理有助于提高颠茄氮代谢关键酶NR活性,其中在低质量浓度(200 μmol/L)MeJA处理下更能增加颠茄叶片中NR活性.

    图 5 不同质量浓度MeJA处理28 d对颠茄叶片NR活性的影响

    NR活性相比,不同质量浓度MeJA处理下颠茄叶片中GS活性影响不同(图 6).在MeJA处理期间(28 d)内,随着MeJA质量浓度的增加,颠茄叶片中GSNR活性的变化一样呈先升高后降低趋势.在T3处理组中颠茄GS活性达到最高值,是T1对照组的1.35倍;在T5处理组中其活性达到最低值,较T1对照组显著降低了15%.由此可见,低质量浓度(100,200 μmol/L)MeJA处理能够促进颠茄氮代谢关键酶GS活性,高质量浓度(400 μmol/L)MeJA处理则能够抑制颠茄叶片中GS活性.

    图 6 不同质量浓度MeJA处理28 d对颠茄叶片GS活性的影响
    3 讨论与结论 3.1 MeJA对颠茄生长及光合色素的影响

    MeJA作为植物一种天然化学物质,调控着植物的生长发育、抗逆性反应和次生代谢产物的合成[17].植株生长能直接反映出植株的生理状态.程玉鹏等[18]研究发现通过调节茉莉酸甲酯质量浓度,可有效地促进狭叶柴胡悬浮细胞的生长;当茉莉酸甲酯在低质量浓度条件时,狭叶柴胡悬浮细胞细胞鲜质量会随着茉莉酸甲酯使用质量浓度的增加而增加,而随着茉莉酸甲酯质量浓度的不断增加,悬浮细胞的生长受到轻微抑制.侯赛男等[19]研究显示200 μmol/L MeJA对坛紫菜生长产生抑制作用.本实验中,一定质量浓度范围内的MeJA抑制了颠茄的生长,还随着处理时间的延长和MeJA质量浓度的增加抑制作用更强.

    MeJA作为广泛存在于植物体内的一类内源生长物质,能抑制叶绿素的合成和光合作用,促进叶片的衰老和果实的成熟[20].光合色素是衡量植物生理状态的重要指标之一.李小玲等[21]研究表明茉莉酸甲酯可显著提高黄芩种子的发芽势、发芽率,提高叶片叶绿素质量分数.本研究发现外源MeJA处理使颠茄叶片叶绿素质量分数降低,这与魏燕霞等[22]研究结果相同,这表明外源MeJA能够抑制叶绿素的合成,降低光合速率.

    3.2 MeJA对颠茄氮代谢的影响

    硝态氮(NO3--N)是植物吸收的主要氮源,绝大多数在植物茎叶以NO3-形式被同化,而另一部分则在根系中被同化为氨基酸等含氮有机物质[23-24].酶在植物的代谢过程中尤为重要,氮代谢关键酶包括硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)[25]. NR是NO3--N同化过程中的一个关键调节酶和限速酶,NR作用的底物是硝态氮,它能催化硝酸盐还原成亚硝酸盐,是植物氮素同化的第一步,它的活性大小在一定程度上能够反映植物的氮代谢水平[26]. GS是氮代谢中心的多功能酶,能在ATP和Mg2+存在的条件下,催化植物体内的谷氨酸形成谷氨酰胺[27-28].本实验结果中,不同质量浓度MeJA(100,200,300和400 μmol/L)处理28 d时,MeJA提高了颠茄叶片中游离脯氨酸及可溶性蛋白质量分数,但降低了硝态氮质量分数;除400 μmol/L处理降低了GS活性外,NRGS活性均显著提高,且变化趋势一致.由此可见,硝态氮质量分数的降低,游离脯氨酸、可溶性蛋白质量分数以及NRGS活性的提高,说明MeJA处理后颠茄在氮代谢过程中,为加速颠茄的氮素同化而消耗了更多的底物硝态氮,生成更多的含氮有机物,也为颠茄含氮生物碱提供更多的前提物质,从而有利于次生代谢产物的积累,但其中的机制有待进一步探究.

    3.3 结论

    综上所述,外源添加MeJA能够抑制颠茄生长,降低叶绿素、硝态氮质量分数,但能提高可溶性蛋白、游离脯氨酸质量分数以及NRGS活性.低质量浓度(100,200 μmol/L)MeJA处理对颠茄的生长影响最小,同时对氮代谢关键酶影响显著,因而在种植颠茄过程中喷施低质量浓度MeJA更有助于颠茄的生长和氮代谢.此外,这些生理生化特性也会直接或间接地影响颠茄的次生代谢,特别是颠茄托品烷类生物碱(TAs)的合成,而这也会改变颠茄药用成分的质量分数.因此,在人工种植中,应综合考虑在不同时期喷施不同质量浓度MeJA以促进颠茄生长和氮代谢,从而获得高质量和高产量颠茄.

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    Effect of Methyl Jasmonate on the Growth of Atropa belladonna and Its Nnitrogen Metabolism
    LIU Xing1,2, ZHANG Cui-ping2, YANG Yi1,2, WEI Yue3, WU Neng-biao1     
    1. School of Life Science, Southwest University/Key Laboratory of Eco-Environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing 400715, China;
    2. No.1 Middle School of Yishui, Yishui Shandong 276400, China;
    3. Cotton Research Institute, CAAS, Changji Xinjiang 831100, China
    Abstract: To offer a theoretical support for improving the yield of Atropa belladonna, we investigated the effects of different concentrations of methyl jasmonate (0, 100, 200, 300 and 400 μmol/L) over different time periods (7, 14, 21 and 28 d) on the fresh weight, chlorophyll, main nitrogenous compound contents and key enzyme activities in nitrogen metabolism of this Chinese traditional medicine crop. With the prolongation of treatment time, the fresh weight and the content of chlorophyll showed a descending trend in all MeJA treatment groups, which was significantly lower than those of the control group (0 μmol/L). In contrast, the content of soluble protein (SP) and proline (Pro) tended to increase, and the low concentration of MeJA (100 and 200 μmol/L) could promote the accumulation of SP and Pro. When treated with MeJA for 28 days, the nitrate content significantly decreased (p < 0.05), and the activities of nitrate reductase (NR) and glutamine synthetase (GS) tended to decrease, which was the highest at 200 μmol/L MeJA, being 1.35 and 1.672 times that of the control group, respectively. In conclusion, MeJA can inhibit the growth of A. belladonna and reduce the content of chlorophyll and nitrate in it, and the low mass concentration of MeJA can increase the content of SP and Pro as well as the activities of GS and NR. Therefore, a low concentration of MeJA appears to be more beneficial to the growth and nitrogen metabolism in A. belladonna.
    Key words: Atropa belladonna    methyl jasmonate    growth    nitrogen metabolism    nitrate reductase    glutamine synthetase    
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