高级搜索

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

利用BSA-Seq筛选甘蓝型油菜菌核病抗性候选基因

,  ,  ,  ,  , 

上一篇

下一篇

夏吉春, 彭于洲, 王东, 等. 利用BSA-Seq筛选甘蓝型油菜菌核病抗性候选基因[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2023, 45(6): 85-96. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.06.009
引用本文: 夏吉春, 彭于洲, 王东, 等. 利用BSA-Seq筛选甘蓝型油菜菌核病抗性候选基因[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2023, 45(6): 85-96. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.06.009
shu
XIA Jichun, PENG Yuzhou, WANG Dong, et al. Identification of Major Sclerotinia Resistance Genes by BSA-Seq of Brassica napus[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2023, 45(6): 85-96. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.06.009
Citation: XIA Jichun, PENG Yuzhou, WANG Dong, et al. Identification of Major Sclerotinia Resistance Genes by BSA-Seq of Brassica napus[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2023, 45(6): 85-96. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.06.009
shu

利用BSA-Seq筛选甘蓝型油菜菌核病抗性候选基因

  • 西南大学 农学与生物科技学院，重庆 400715

  • 基金项目: 国家现代农业产业技术体系资助项目(CARS-12)
详细信息
    作者简介:

    夏吉春，博士研究生，主要从事油菜和棉花育种研究 .

    通讯作者: 徐新福，副研究员，硕士研究生导师

  • 中图分类号: S634.3

Identification of Major Sclerotinia Resistance Genes by BSA-Seq of Brassica napus

  • School of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 摘要: 油菜菌核病居油菜3大病害之首，它所引起的茎腐烂是导致油菜减产的重要原因之一，因此筛选出调控菌核病的主效基因，对利用分子辅助育种手段提高油菜产量具有重要意义. 该研究以甘蓝型油菜高抗材料21Y490为父本与高感材料21Y689杂交，在F2分离群体终花期截取油菜茎秆进行核盘菌室内接种，培养3 d后测量菌斑大小鉴定菌核病抗性. 筛选抗性极端表型个体构建DNA混池，与亲本一起重测序提取差异SNP，InDel信息，利用BSA-seq技术、ED算法和Δ-index算法获得两个显著的关联区域，分别位于C09号染色体的17.8~21.2 Mb和31.6~39.1 Mb区间，区间内共有399个基因. 最后，利用拟南芥和甘蓝型油菜基因组注释信息对关联候选区间对应的基因功能进行分析，共筛选出与油菜菌核病抗性相关的8个候选基因(BnaC05g50540D，BnaC09g33900D，BnaA04g09130D，BnaA01g29170D，BnaC09g15640D，BnaC09g35310D，BnaA03g09220D，BnaCnng15460D)，通过候选基因同源分析、代谢通路分析及共表达基因分析发现，这些基因主要参与植物激素生长调控及免疫系统的信号转导，为下一步抗性基因的克隆及功能研究奠定了基础.
    Abstract: Sclerotinia sclerotiorum is ranked the first among the three major diseases of rapeseed, and stem rot caused by it is one of the important reasons for the reduction of rapeseed yield. Therefore, screening out the major genes regulating sclerotinia is very important for improving rapeseed yield with molecular assisted breeding. In this study, the high-resistant material 21Y490 was crossed with the high-susceptible material 21Y689. The rape stalks of F2 population were cut at the final flowering stage for indoor inoculation of Sclerotinia sclerotiorum. After culturing for 3 days, the size of the plaque was measured to identify the resistance to Sclerotinia sclerotiorum. DNA mixing pools were constructed with screened extreme resistant and susceptible individuals, respectively, and sequenced with parents to extract differential SNP and InDel information. Using BSA-seq, ED algorithm and Δ-Index algorithm, two significant association regions were identified in the 17.8-21.2 Mb and 31.6-39.1 Mb regions of chromosome C09, respectively. There were 399 genes in the region. Combined with gene annotation, 8 candidate genes related to Sclerotinia sclerotiorum resistance were screened out (BnaC05g50540D, BnaC09g33900D, BnaA04g09130D, BnaA01g29170D, BnaC09g15640D, BnaC09g35310D, BnaA03g09220D, BnaCnng15460D). The results of candidate genes homology analysis, metabolic pathway analysis and co-expression analysis showed that these 8 candidate genes are mainly involved in plant hormone growth regulation and signal transduction of the immune system, which laid a foundation for the cloning and functional research of resistance genes in the further work.
  • 加载中

  • 图 1  菌核病表型数据统计

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    图 2  极端材料对比

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    图 3  ED关联值在染色体上的分布

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    图 4  SNP(InDel)-index关联值在染色体上的分布

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    图 5  候选区域内基因的通路分布图

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    表 1  样品数据评估

    样品 Clean-Reads Clean-Base Q20/% Q30/% GC/%
    R01 72 504 684 21 664 185 030 97.55 93.47 37.68
    R02 62 044 117 18 544 946 240 98.17 94.58 37.60
    R03 161 077 257 47 777 216 246 97.78 93.60 37.62
    R04 181 245 825 53 770 695 790 97.90 93.88 38.12
    注：R01为父本池，R02为母本池，R03为高感池，R04为高抗池；Clean_Reads：过滤后的Reads对数，即Read1和Read2记为1条Reads；Clean_Base：过滤后的碱基数，Clean Reads数乘以序列长度；Q20/%：质量值大于等于20的碱基占总碱基数的百分比；Q30/%：质量值大于等于30的碱基占总碱基数的百分比；GC/%：样品GC含量，即G和C类型的碱基占总碱基的百分比.
    下载: 导出CSV

    表 2  比对结果统计

    样品 Total_Reads Mapped/% Properly_Mapped/%
    R01 145 009 368 98.61 92.20
    R02 124 088 234 98.82 93.01
    R03 322 154 514 99.43 90.63
    R04 362 491 650 99.47 89.40
    注：R01为父本池，R02为母本池，R03为高感池，R04为高抗池；Total_Reads：该样本总的Clean Reads数，双端分别统计，即Read1和Read2记为2条Reads；Mapped/%：定位到参考基因组的Clean Reads数占所有Clean Reads数的百分比；Properly_mapped/%：双端测序序列均定位到参考基因组上且距离符合测序片段的长度分布.
    下载: 导出CSV

    表 3  SNP注释统计

    类型 R01 vs R02 R03 vs R04
    INTERGENIC 531 100 160 720
    INTRAGENIC 627 149
    INTRON 173 845 30 477
    UPSTREAM 459 104 105 669
    DOWNSTREAM 358 928 84 138
    UTR_5_PRIME 26 014 3 930
    UTR_3_PRIME 36 073 5 588
    SPLICE_SITE_ACCEPTOR 343 48
    SPLICE_SITE_DONOR 270 55
    SPLICE_SITE_REGION 12 687 2 056
    START_GAINED 772 138
    START_LOST 163 26
    SYNONYMOUS_CODING 176 798 30 242
    NON_SYNONYMOUS_CODING 101 340 16 850
    SYNONYMOUS_STOP 177 31
    STOP_GAINED 1 188 305
    STOP_LOST 313 56
    其他 0 0
    总计 1 879 742 440 478
    下载: 导出CSV

    表 4  InDel注释统计

    类型 R01 vs R02 R03 vs R04
    INTERGENIC 95 392 32 569
    INTRAGENIC 601 127
    INTRON 95 725 19 831
    UPSTREAM 144 439 37 495
    DOWNSTREAM 104 466 27 173
    UTR_5_PRIME 17 575 3 218
    UTR_5_DELETED 2 1
    UTR_3_PRIME 20 415 3 931
    SPLICE_SITE_ACCEPTOR 421 98
    SPLICE_SITE_DONOR 684 180
    SPLICE_SITE_REGION 7 389 1 470
    START_LOST 146 23
    FRAME_SHIFT 6 768 1 958
    EXON_DELETED 1 1
    CODON_INSERTION 2 942 627
    CODON_DELETION 2 520 487
    CODON_CHANGE_PLUS_CODON_INSERTION 1 071 255
    CODON_CHANGE_PLUS_CODON_DELETION 1 787 358
    STOP_GAINED 190 93
    STOP_LOST 118 20
    其他 0 0
    总计 502 652 129 915
    下载: 导出CSV

    表 5  候选关联区域统计

    染色体编号 起始位置 终止位置 区域大小/Mb 基因数量
    BnaC09 17 840 000 17 870 000 0.03 1
    BnaC09 18 070 000 18 390 000 0.32 8
    BnaC09 18 410 000 18 450 000 0.04 1
    BnaC09 19 770 000 21 270 000 1.50 88
    BnaC09 31 640 000 31 720 000 0.08 7
    BnaC09 32 120 000 34 420 000 2.30 122
    BnaC09 35 200 000 36 910 000 1.71 104
    BnaC09 38 450 000 39 170 000 0.72 68
    总计 - - - 399
    下载: 导出CSV

    表 6  候选基因功能注释、同源分析及参与的调控途径

    基因 拟南芥同源基因 基因注释 代谢网络
    BnaC05g50540D AT3G28220(ATUBP12) MATH domain and coiled-coil domain-containing protein integral component of membrane
    BnaC09g33900D AT1G07150(ATMAPKKK17) mitogen-activated protein ATP binding
    BnaA04g09130D AT3G42170 F-box and leucine-rich repeat protein protein dimerization activity
    BnaA01g29170D AT3G42170 Zinc finger BED domain-containing protein protein dimerization activity
    BnaC09g15640D AT5G51470(ATGH3.12) auxin responsive GH3 gene family protein
    BnaC09g35310D AT5G59980(ATGAF1) ribonuclease P/MRP protein ribonuclease P activity
    BnaA03g09220D AT5G59845(ATGASA10) Gibberellin regulated protein
    BnaCnng15460D AT3G56780 Putative F-box/FBD/LRR-repeat protein
    下载: 导出CSV
  • [1] 刘成, 冯中朝, 肖唐华, 等. 我国油菜产业发展现状、潜力及对策[J]. 中国油料作物学报, 2019, 41(4): 485-489. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYW201904002.htm
    [2] 左叶信, 秦虎强, 聂峰杰, 等. 陕西省油菜菌核病调查初报[J]. 植物保护, 2011, 37(2): 116-119. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZWBH201102025.htm
    [3] ABAWI G S. Infection of Bean by Ascospores of Whetzelinia sclerotiorum[J]. Phytopathology, 1975, 65(6): 673-678. doi: 10.1094/Phyto-65-673
    [4] BOLTON M D, THOMMA B P H J, NELSON B D. Sclerotinia sclerotiorum (Lib. ) de Bary: Biology and Molecular Traits of a Cosmopolitan Pathogen[J]. Molecular Plant Pathology, 2006, 7(1): 1-16. doi: 10.1111/j.1364-3703.2005.00316.x
    [5] 冯韬. 油菜菌核病病理与防治研究进展[J]. 作物研究, 2014, 28(3): 316-320. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZWYJ201403025.htm
    [6] DE BARY A, GARNSEY H E F, BALFOUR I B. Comparative Morphology and Biology of the Fungi, Mycetozoa and Bacteria[M]. Oxford: Clarendon Press, 1887.
    [7] 毛玮, 侯英敏, 刘志文. 核盘菌和草酸诱导下的油菜几种酶活力的变化分析[J]. 大连工业大学学报, 2011, 30(1): 39-42. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-DLQG201101012.htm
    [8] DUTTON M V, EVANS C S. Oxalate Production by Fungi: Its Role in Pathogenicity and Ecology in the Soil Environment[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1996, 42(9): 881-895. doi: 10.1139/m96-114
    [9] 李玉芳, 官春云. 油菜菌核病菌侵染的组织病理学、致病及抗病机制的研究[J]. 作物研究, 2005, 19(S1): 327-331. doi: 10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2005.s1.014
    [10] GUIMARÃES R L, STOTZ H U. Oxalate Production by Sclerotinia sclerotiorum Deregulates Guard Cells during Infection[J]. Plant Physiology, 2004, 136(3): 3703-3711. doi: 10.1104/pp.104.049650
    [11] WILLIAMS B, KABBAGE M, KIM H J, et al. Tipping the Balance: Sclerotinia sclerotiorum Secreted Oxalic Acid Suppresses Host Defenses by Manipulating the Host Redox Environment[J]. PLoS Pathogens, 2011, 7(6): e1002107. doi: 10.1371/journal.ppat.1002107
    [12] WANG Z, TAN X L, ZHANG Z Y, et al. Defense to Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed Rape is Associated with the Sequential Activations of Salicylic Acid Signaling and Jasmonic Acid Signaling[J]. Plant Science, 2012, 184: 75-82. doi: 10.1016/j.plantsci.2011.12.013
    [13] WANG Z, MAO H, DONG C H, et al. Overexpression of Brassica Napus MPK4 Enhances Resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed Rape[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI, 2009, 22(3): 235-244. doi: 10.1094/MPMI-22-3-0235
    [14] 宋志荣, 官春云. 甘蓝型油菜硫苷特性与对菌核病抗性关系[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2008, 34(4): 462-465. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HNND200804026.htm
    [15] EYNCK C, KOOPMANN B, KARLOVSKY P, et al. Internal Resistance in Winter Oilseed Rape Inhibits Systemic Spread of the Vascular Pathogen Verticillium Longisporum[J]. Phytopathology, 2009, 99(7): 802-811. doi: 10.1094/PHYTO-99-7-0802
    [16] ZHAO J W, MENG J L. Genetic Analysis of Loci Associated with Partial Resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Rapeseed (Brassica napus L. )[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 106(4): 759-764. doi: 10.1007/s00122-002-1171-2
    [17] 马田田. 甘蓝型油菜抗菌核病QTL定位及相关基因表达分析[D]. 南京: 南京农业大学, 2012.
    [18] 梅家琴. 甘蓝与甘蓝型油菜C亚基因组遗传关系调查及甘蓝抗菌核病QTL定位[D]. 重庆: 西南大学, 2011.
    [19] WU J, CAI G Q, TU J Y, et al. Identification of QTLS for Resistance to Sclerotinia Stem Rot and BnaC. IGMT5. a as a Candidate Gene of the Major Resistant QTL SRC6 in Brassica napus[J]. PLoS One, 2013, 8(7): e67740. doi: 10.1371/journal.pone.0067740
    [20] 汪雷, 刘瑶, 丁一娟, 等. 油菜菌核病研究进展[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2015, 43(10): 85-93. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XBNY201510013.htm
    [21] 张卡. BnaA03. WRKY28和BnWRKY33参与油菜菌核病抗性的分子机理[D]. 武汉: 华中农业大学, 2021.
    [22] 许李明. 油菜菌核病抗性相关基因EIN3及3A06和6C02的功能研究[D]. 武汉: 中南民族大学, 2009.
    [23] 王汉中, 刘贵华, 郑元本, 等. 抗菌核病双低油菜新品种中双9号选育及其重要防御酶活性变化规律的研究[J]. 中国农业科学, 2004, 37(1): 23-28. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZNYK200401003.htm
    [24] WEN L, TAN T L, SHU J B, et al. Using Proteomic Analysis to Find the Proteins Involved in Resistance Against Sclerotinia sclerotiorum in Adult Brassica Napus[J]. European Journal of Plant Pathology, 2013, 137(3): 505-523. doi: 10.1007/s10658-013-0262-z
    [25] 石美娟, 左蓉, 刘杰, 等. 甘蓝型油菜BnTLP1基因的菌核病抗性研究[J]. 中国油料作物学报, 2021, 43(5): 752-761. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYW202105002.htm
    [26] 万华方, 刘瑶, 梅家琴, 等. 人工合成高抗菌核病甘蓝型油菜几种关键酶编码基因的表达与其抗性的关系[J]. 中国农业科学, 2012, 45(22): 4543-4551. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZNYK201222002.htm
    [27] LI H, DURBINR. Fast and Accurate Short Read Alignment with Burrows Wheeler Transform[J]. Bioinformatics, 2009, 25(14): 1754-1760.
    [28] MCKENNA A, HANNA M, BANKS E, et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce Framework for Analyzing Next-Generation DNA Sequencing Data[J]. Genome Research, 2010, 20(9): 1297-1303.
    [29] CINGOLANI P, PLATTS A, WANG L L, et al. A Program for Annotating and Predicting the Effects of Single Nucleotide Polymorphisms, SnpEff: SNPS in the Genome of Drosophila Melanogaster Strain W1118; Iso-2; Iso-3[J]. Fly, 2012, 6(2): 80-92.
    [30] HILL J T, DEMAREST B L, BISGROVE B W, et al. MMAPPR: Mutation Mapping Analysis Pipeline for Pooled RNA-Seq[J]. Genome Research, 2013, 23(4): 687-697.
    [31] DENG Y, LI J, WU S, et al. Integrated nr Database in Protein Annotation System and Its Localization[J]. Computer Engineering, 2006, 32(5): 71-74.
    [32] ASHBURNER M, BALL C, BLAKE J, et al. Gene Ontology: Tool for the Unification of Biology. The Gene Ontology Consortium[J]. Nature Genetics, 2000, 25(1): 25-29.
    [33] TATUSOV R L, GALPERIN M Y, NATALE D A, et al. The COG Database: a Tool for Genome_Scale Analysis of Protein Functions and Evolution[J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(1): 33-36.
    [34] KANEHISA M, GOTO S, KAWASHIMA S, et al. The KEGG Resource for Deciphering the Genome[J]. Nucleic Acids Research, 2004, 32: 277-280.
    [35] ALTSCHUL S F, MADDEN T L, SCHÄFFER A A, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a New Generation of Protein Database Search Programs[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(17): 3389-3402.
    [36] MEI J, QIAN L, DISI J O, et al. Identification of Resistant Sources Against Sclerotinia sclerotiorum in Brassica Species with Emphasis on B. Oleracea[J]. Euphytica, 2011, 177(3): 393-399.
    [37] 陈吉杨, 阮颖, 刘博宇. 甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnaM154过表达载体的构建与转化[J]. 分子植物育种, 2022, 20(13): 4377-4382. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-FZZW202213023.htm
    [38] JEONG J S, JUNG C, SEO J S, et al. The Deubiquitinating Enzymes UBP12 and UBP13 Positively Regulate MYC2 Levels in Jasmonate Responses[J]. The Plant Cell, 2017, 29(6): 1406-1424.
    [39] LIU G C, LIANG J X, LOU L J, et al. The Deubiquitinases UBP12 and UBP13 Integrate with the E3 Ubiquitin Ligase XBAT35. 2 to Modulate VPS23A Stability in ABA Signaling[J]. Science Advances, 2022, 8(14): eabl5765.
    [40] HUI S G, HAO M Y, LIU H B, et al. The Group Ⅰ GH3 Family Genes Encoding JA-Ile Synthetase Act as Positive Regulator in the Resistance of Rice to Xanthomonas Oryzae Pv. oryzae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2019, 508(4): 1062-1066.
    [41] CHEN C H, JOST M, CLARK B, et al. BED Domain-Containing NLR from Wild Barley Confers Resistance to Leaf Rust[J]. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(6): 1206-1215.
    [42] FUKAZAWA J, MORI M, WATANABE S, et al. DELLA-GAF1 Complex is a Main Component in Gibberellin Feedback Regulation of GA20 Oxidase 2[J]. Plant Physiology, 2017, 175(3): 1395-1406.
    [43] 左蓉, 吴姗, 刘杰, 等. 油菜F-box-LRR基因全基因组鉴定与核盘菌诱导应答分析[J]. 中国油料作物学报, 2022, 44(3): 503-514. doi: https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYW202203006.htm
  • 加载中
图( 5) 表( 6)
计量
  • 文章访问数:  10543
  • HTML全文浏览数:  10543
  • PDF下载数:  991
  • 施引文献:  0
出版历程
  • 收稿日期:  2022-06-17
  • 刊出日期:  2023-06-20

利用BSA-Seq筛选甘蓝型油菜菌核病抗性候选基因

    通讯作者: 徐新福，副研究员，硕士研究生导师
    作者简介: 夏吉春，博士研究生，主要从事油菜和棉花育种研究
  • 西南大学 农学与生物科技学院，重庆 400715
  • 收稿日期:  2022-06-17
基金项目:  国家现代农业产业技术体系资助项目(CARS-12)

摘要: 油菜菌核病居油菜3大病害之首，它所引起的茎腐烂是导致油菜减产的重要原因之一，因此筛选出调控菌核病的主效基因，对利用分子辅助育种手段提高油菜产量具有重要意义. 该研究以甘蓝型油菜高抗材料21Y490为父本与高感材料21Y689杂交，在F2分离群体终花期截取油菜茎秆进行核盘菌室内接种，培养3 d后测量菌斑大小鉴定菌核病抗性. 筛选抗性极端表型个体构建DNA混池，与亲本一起重测序提取差异SNP，InDel信息，利用BSA-seq技术、ED算法和Δ-index算法获得两个显著的关联区域，分别位于C09号染色体的17.8~21.2 Mb和31.6~39.1 Mb区间，区间内共有399个基因. 最后，利用拟南芥和甘蓝型油菜基因组注释信息对关联候选区间对应的基因功能进行分析，共筛选出与油菜菌核病抗性相关的8个候选基因(BnaC05g50540D，BnaC09g33900D，BnaA04g09130D，BnaA01g29170D，BnaC09g15640D，BnaC09g35310D，BnaA03g09220D，BnaCnng15460D)，通过候选基因同源分析、代谢通路分析及共表达基因分析发现，这些基因主要参与植物激素生长调控及免疫系统的信号转导，为下一步抗性基因的克隆及功能研究奠定了基础.

English Abstract

    全文HTML

  • 开放科学(资源服务)标志码(OSID):

  • 由核盘菌引发的油菜菌核病是油菜的第一大病害，近年来随着机械化和双低油菜的推广，该病害呈加重趋势. 油菜菌核病的致病机理较为复杂，尚未有此方面系统全面的报道[1-3].

    现有研究表明，多种水解酶及草酸等毒素在致病中起到了重要作用. 核盘菌通过分泌释放纤维素酶、果胶酶、水解酶等裂解植物细胞壁[4]，从而获得孢子萌发及菌丝生长、扩散所需的营养成分[5]. 早在19世纪就有学者发现草酸在核盘菌侵染中起重要作用[6]. 在后续研究中发现草酸会酸化、腐败寄主植物组织，主要作用机理：①降低pH值，促进核盘菌分泌水解酶，同时抑制寄主中起抗病作用的酶[7]. ②结合细胞中的二价金属离子，破坏细胞结构与功能，如损坏细胞壁与核糖体、阻塞导管、阻碍叶绿素合成、改变膜的通透性、影响细胞信号转导等，致使细胞正常生理功能受到影响[8-9]. ③刺激保卫细胞对K+的吸收，改变膜两侧的渗透压，使保卫细胞无法正常工作，致使气孔打开，叶片脱水，为核盘菌侵入创造有利条件[10]. ④调控寄主活性氧(ROS)代谢. 侵入前期，抑制活性氧生成，阻止植物自身的防御进程；侵染中后期，诱导氧爆反应，诱发细胞程序性死亡(PCD)，死亡细胞可作为营养源供病原菌生长、繁殖[11].

    油菜通过多种途径响应来应对核盘菌的侵染. Wang等[12-13]发现油菜依次激活水杨酸(SA)途径、茉莉酸/乙烯(JA/ET)途径来产生对核盘菌的抗性，通过表达丝裂原活化蛋白激酶BnMPK4，提高了油菜植株对菌核菌的抗性，说明MAPK途径参与油菜抗菌核病反应. 在次生代谢物方面，宋志荣等[14]发现高硫苷的油菜菌核病抗性更高. 另外，植保素、木质素、酚类化合物也参与了油菜的抗病响应[15].

    当前，对油菜菌核病抗病基因的发掘主要从中心法则的3个方面开展研究. 在DNA水平上，通常采用数量性状位点(QTL)定位进行研究. Zhao等[16]利用107个分子标记在甘蓝型油菜128-F2：3家系群体中检测到3个与苗期叶片抗性相关的QTL和3个与成株期茎秆抗性相关的QTL，马田田[17]在F2群体中使用复合区间作图法检测到3个叶片抗性的QTL和2个茎秆抗性的QTL. 在这些研究中，苗期与成株期抗病QTL未检测出重合区域，说明油菜菌核病的抗性具有特异性，在不同时期或不同器官中可能存在不同的抗性位点. 值得一提的是，梅家琴[18]在甘蓝抗感分离的F2无性系群体中检测到了一个叶片抗性与茎秆抗性重叠的QTL，这与之前的研究出现了差异. Wu等[19]2013年鉴定出一个与茎秆相关的重要QTL位点，具有较高的遗传效应，并选定BnaC.IGMT5.a为候选抗病基因.

    在RNA水平上，多数研究者利用cDNA芯片技术研究核盘菌侵染后诱导表达的基因，或不同抗性材料在接种核盘菌后的基因表达差异. 除去指导合成各种抗性相关的蛋白质外，相关研究主要集中于转录因子、信号转导及次生代谢物合成基因等[20]. 张卡[21]发现BnaA03.WRKY28和BnWRKY33两个转录因子均能结合BnWRKY33启动子，前者为抗性负调控因子，后者的大量表达可增强抗病反应. 许李明[22]的研究表明，BnEIN3是正向调控抗性的乙烯信号转导关键调节因子.

    在蛋白质水平上，早期学者们通过检测接种核盘菌前后植株体内防御酶的变化规律来研究抗性相关性，王汉中等[23]发现几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化物酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等与菌核病抗性有关，之后则采用蛋白组学的方法研究抗病基因. Wen等[24]采用蛋白组双向电泳技术，根据蛋白质表达谱差异得到了甘蓝型油菜20个抗性相关蛋白. 此外，对油菜菌核病病程蛋白(PR)的研究也具有广阔的发展前景，石美娟等[25]发现甘蓝型油菜类甜蛋白基因BnTLP1正调控菌核病抗性，且JA/ET途径可能早期参与其抗性响应.

    本研究是在极端抗性材料构建的F2分离群体基础上，利用高通量测序方法筛选鉴定可能的甘蓝型油菜菌核病抗性基因，为后续基因克隆、功能分析及油菜菌核病在分子机理层面的剖析奠定基础.

1.   材料与方法

    1.1.   试验材料

  • 本试验所有材料均来源于重庆市油菜工程技术研究中心. 高抗父本21Y490发病率在30%左右，相对于ZY821为中抗品种，病情严重度为1级(病斑长1~2 cm)；高感母本21Y689发病率高达100%，相对于ZY821为高感品种，病情严重度在3级以上(病斑长3 cm以上). 将高抗父本21Y490与高感母本21Y689杂交，杂种F1代自交后获得F2分离群体，于2021年在重庆市武隆区仙女山种植.

    将核盘菌在PAD培养基(20%马铃薯、2%葡萄糖及1.5% 琼脂)平板上复苏后，取平板边缘菌丝转接，对第二轮转接后的菌丝进行暗培养3 d，待菌丝刚布满平板时用灭菌后的打孔器(内径0.6 cm)沿平板边缘打孔，获得的带菌丝琼脂块作为接种体，用于接种[26].

    • 1.2.   试验方法

    1.2.1.   茎秆离体接种鉴定

  • 于终花期离地面10 cm处截取约30 cm长的茎段，去除多余枝叶并将两端敷上浸过水的棉花球，用保鲜膜封严保湿. 通过无菌打孔器(内径0.6 cm)在茎秆距两端约10 cm处破坏表皮，产生与接种体大小一致的伤口，将接种体带菌面紧贴创伤处，覆盖保鲜膜，接种后置于培养箱内72 h测量菌斑长度[26].

    • 1.2.2.   构建混池进行重测序

  • 根据侵染菌斑长度从F2分离群体中挑选30株高抗植株和30株高感植株使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法分别提取DNA，构建DNA混合池，两混池、两亲本池均送北京百迈克生物科技有限公司利用Illumina HiSeq平台建库并进行全基因组重测序.

    • 1.2.3.   混合分组分析法(BSA)分析

  • 由百迈克生物科技公司完成BSA分析，主要步骤如下：

    (1) 测序数据质控

    根据碱基质量、类型等数据确认测序质量，并删除原始测序序列中低质量Reads(带接头、N比例大于10%、质量值Q≤10)，过滤得到Clean Reads.

    (2) 参考基因组比对

    利用bwa软件将Clean Reads与甘蓝型油菜参考基因组(ZS11油菜参考基因组)比对[27]. 通过比较确定了Clean Reads在参考基因组上的位置，并统计测序深度和基因组覆盖度.

    (3) SNP和InDel的检测与注释：

    SNP和InDel检测使用GATK软件工具包，根据前面比对定位的结果，预处理后使用GATK进行SNP和Small InDel检测，过滤后得到最终结果[28]. 具体流程参考GATK官网：https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. 根据比对结果，将4个混池间所有差异的变异位点汇总，统计出样品间的SNP和InDel位点.

    SNP和InDel注释使用SnpEff软件，根据变异位点在参考基因组上的位置及信息，可以得到变异位点在基因组发生的区域，以及变异产生的影响[29].

    (4) 关联分析

    对过滤后的SNP和InDel，分别用欧式距离(Euclidean Distance，ED)算法和SNP-index方法分析关联区域. 根据公式计算各位点的ED值后，取ED值的5次方为关联值以消除背景噪音，采用DISTANCE方法对ED值进行拟合[30]. SNP-index算法同样采用DISTANCE方法对ΔSNP-index进行拟合，然后根据关联阈值，选择阈值以上的区域作为与性状相关的区域.

    式(1)中：Amut为A碱基在突变混池中的频率，Awt为A碱基在野生型混池中的频率；Cmut为C碱基在突变混池中的频率，Cwt为C碱基在野生型混池中的频率；Gmut为G碱基在突变混池中的频率，Gwt为G碱基在野生型混池中的频率；Tmut为T碱基在突变混池中的频率，Twt为T碱基在野生型混池中的频率.

    式(2)中：Maa表示aa池来源于母本的深度；Paa表示aa池来源于父本的深度；

    式(3)中：Mab表示ab池来源于母本的深度；Pab表示ab池来源于父本的深度；

    (5) 候选区域筛选与功能注释

    取两种算法的交集得到候选区域，参考NR[31]，GO[32]，KEGG[33]，COG[34]等数据库，通过BLAST[35]软件对候选区间内的编码基因进行注释.

    • 1.2.4.   菌核病抗性基因预测

  • 本研究主要通过基因注释文件，根据蛋白质结构域和同源基因等信息，结合油菜抗性机制进行抗性基因预测.

2.   结果与分析

    2.1.   甘蓝型油菜抗菌核病表型鉴定

  • 于2021年9月1日在重庆市武隆区仙女山收取F2分离群体材料，接种核盘菌培养后每个材料量得两个菌斑长度，取平均值. 由统计结果可得，F2分离群体菌核病抗性表型符合正态分布规律，也符合微效多基因控制的数量性状遗传规律(图 1). 其中，最大的菌斑长9.5 cm，最小为1 cm. 选取菌斑平均值最大和最小各30株材料构建混池. 图 2为极端材料表型对照图片.

    • 2.2.   BSA分析

    2.2.1.   测序数据质控

  • 测序得到的原始测序序列(Sequenced Reads)，里面含有带接头的、低质量的Reads，为了保证信息分析质量，对数据进行过滤，得到过滤后数据，用于后续信息分析(表 1).

    • 2.2.2.   与参考基因组比对统计

  • 参考基因组为Brassica_napus：Bra_napus_v2.0(基因组大小为979 Mb，GC%含量为36.47%). 4个样品同参考基因组的比对效率在98.82%以上，将Reads定位至参考基因组，统计碱基覆盖情况，亲本池覆盖深度为13 X，16 X，抗病池、感病池覆盖深度为31 X，34 X，平均覆盖深度约为23.50 X，基因组至少覆盖1 X的比率约为95.12%. 以上结果表明，测序正常且随机性好(表 2).

    • 2.2.3.   SNP和InDel的检测与注释

  • 亲本间获得基因间区SNP 531 100个，基因内SNP 627个，非同义突变SNP 101 340个，总计获得1 879 742个SNP. 混池间获得基因间区SNP 160 720个，基因内SNP 149个，非同义突变SNP 16 850个，总计获得440 478个SNP(表 3).

    亲本间获得移码突变Small InDel 6 768个，基因间区Small InDel 95 392个，基因内Small InDel 601个，总计获得502 652个Small InDel. 混池间获得移码突变Small InDel 1 958个，基因间区Small InDel 32 569个，基因内Small InDel 127个，总计129 915个Small InDel(表 4).

    • 2.2.4.   关联分析

  • SNP的ED法分析，关联阈值为0.06，共得到18个区域，位于A04，A06，C02，C03，C05，C07，C09共7条染色体上，总长度为28.64 Mb，其中最长区段大小为9.95 Mb，包含615个基因，最短区段大小为0.07 Mb，包含3个基因，具有非同义突变位点的基因550个. InDel的ED法分析，关联阈值为0.09，共得到13个区域，位于C02，C03，C05，C06，C09共5条染色体上，总长度为24.46 Mb，其中最长区段大小为9.05 Mb，包含616个基因，最短区段大小为0.1 Mb，包含1个基因，具有移码突变位点的基因87个(图 3).

    对于SNP(InDel)-index的计算结果，当置信度为0.99时，并没有关联到区域. 为了最大限度地利用这些数据，本文将阈值调整为0.24，共得到14个区域，全部位于C09染色体上，总长度为8.40 Mb，最长区段大小为2.33 Mb，包含123个基因，最短区段大小为0.03 Mb，包含1个基因，具有非同义突变位点的基因124个. InDel共得到8个区域，也同样全部位于C09染色体上，总长度为8.58 Mb，最长区段大小为2.30 Mb，包含122个基因，最短区段大小为0.02 Mb，包含1个基因，具有移码突变位点的基因25个(图 4).

    • 2.2.5.   候选区域筛选与功能注释

  • 取以上4个部分的交集得到8个候选关联区域，全部位于甘蓝型油菜C09染色体上，主要分布在该染色体上17.8~21.2 Mb及31.6~39.1 Mb两个区间内(表 5).

    参考NR，GO，KEGG，COG等数据库，注释结果表明候选基因主要集中在代谢及遗传信息进程，而富集分析表明在二萜生物合成、硫代谢、萜类骨架生物合成等通路中富集程度较高(图 5).

    • 2.3.   抗病基因预测

  • 在获得的C09染色体上8个关联区域中重点筛选111个非同义突变或移码突变基因，根据基因注释文件，结合油菜菌核病抗性机制，预测8个基因为油菜菌核病抗性候选基因(表 6)，分别是：BnaC05g50540D，BnaC09g33900D，BnaA04g09130D，BnaA01g29170D，BnaC09g15640D，BnaC09g35310D，BnaA03g09220D，BnaCnng15460D.

3.   讨论

  • 随着现代分子生物学技术的快速发展，以二代测序技术为背景衍生出的BSA-seq技术凭借其高效的优势成为目前基因定位的热门方法. 本研究利用BSA-seq技术定位油菜菌核病茎秆抗性基因，发现关联区域全部位于C09染色体上，而此前定位的油菜菌核病QTL大多出现在A基因组上，且与Mei等[36]的研究相互印证，证实了油菜C基因组对菌核病抗性研究的重要价值.

    本研究在候选区间共筛选出8个候选基因，其中BnaC05g50540D基因包含MATH结构，有研究表明该结构域与植物同真菌的共生效应、抵抗病毒有关，对信号转导也会产生影响[37]，其在拟南芥中的同源基因USP12也参与了茉莉酸反应及脱落酸信号转导. 已有研究表明，茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水杨酸(salicylic acid，SA)及活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)是植物体内抵杀病原菌的重要信号途径，其中JA为植物创伤反应调节子，能根据植物与病原菌相互作用的特异类型促使症状朝正或负的方向发展，以控制病害程度[38-39]. BnaC09g15640D的同源基因GH3.12也与茉莉酸调节有关，且其GH3基因家族被证实在水稻抗白叶枯病中起正向调节作用[40]. BnaC09g33900D是拟南芥MAPKKK17的同源基因，MAPK途径参与了油菜菌核病的抗性响应，超表达BnMAPK4能促进茉莉酸抗病信号转导途径中重要基因PDF1.2的表达[13]. BnaA04g09130D和BnaA01g29170D都含有植物NLR免疫受体具有的ZF-BED结构域，该结构域在水稻白叶枯病和小麦条锈病对抗性方面起重要作用，而在油菜中有关ZF-BED结构域还未有报道. 预测其可能在油菜对抗核盘菌入侵过程中发挥作用，并为油菜抗病育种提供新的方向[41]. BnaC09g35310D的同源基因GA1 [42]及BnaA03g09220D的同源基因GASA10都与赤霉素调节有关，说明赤霉素可能在油菜菌核病抗性方面发挥重要作用，值得更深入地研究. BnaCnng15460D含有FBD结构域，属于F-box基因家族，而该家族C端结构域能和许多蛋白特异性结合，导致其功能多样性. 左蓉等[43]已对油菜F-box-LLR基因家族进行了研究，表明该基因家族与植物抗病响应有紧密的联系，且极大可能具有菌核病抗性功能. 值得注意的是，BnaA04g09130D同样属于F-BOX蛋白，这可能暗示ZF-BED结构域和FBD/LLR结构域存在相互作用关系，且可能在植物抗病系统中起重要作用.

    油菜对于菌核病的抗性是一个复杂的过程，由多基因协同调控. 在对候选基因的挖掘中发现大多数基因都参与了茉莉酸信号转导，表明油菜在面对核盘菌侵染时，通过调节茉莉酸通路来获得植物对病原菌的抗性，从而形成自我保护. 同时，菌核病抗性基因还和其他植物激素及信号转导相关，也可能同植物自身免疫体系有着紧密的联系，往后在油菜菌核病的研究中可以更加关注植物激素和免疫体系两个方面. 后续对候选基因功能验证等研究值得期待，可能会对油菜抗菌核病育种起到极大的推动作用.

4.   结论

  • 将甘蓝型油菜高抗父本21Y490与高感母本21Y689杂交，对F2群体室内接种核盘菌并进行表型鉴定，筛选极端表型. 利用BSA-seq技术关联到两个显著区域，即C09染色体的17.8~21.2 Mb和31.6~39.1 Mb区域，共399个基因，包含111个非同义突变或移码突变基因，从中预测了8个候选基因，这些基因主要参与植物激素生长调控及免疫系统的信号转导.

参考文献 (43)

目录

版权所有：西南大学学报（自然科学版）

地址：重庆市北碚区西南大学 电话：023-68254576, 68252540, 68366165,68366917 电子邮箱：lkxb@swu.edu.cn

本系统由北京仁和汇智信息技术有限公司开发

/

返回文章
返回