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胖袋榨菜中1株产气微生物的分离和鉴定

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IQRA, 李静, 刘玉凌, 等. 胖袋榨菜中1株产气微生物的分离和鉴定[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2024, 46(9): 97-104. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.09.009
引用本文: IQRA, 李静, 刘玉凌, 等. 胖袋榨菜中1株产气微生物的分离和鉴定[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2024, 46(9): 97-104. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.09.009
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IQRA, LI Jing, LIU Yuling, et al. Isolation and Identification of A Gas-Producing Bacterial Strain from Gassy Pouch Zhacai[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2024, 46(9): 97-104. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.09.009
Citation: IQRA, LI Jing, LIU Yuling, et al. Isolation and Identification of A Gas-Producing Bacterial Strain from Gassy Pouch Zhacai[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2024, 46(9): 97-104. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2024.09.009
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胖袋榨菜中1株产气微生物的分离和鉴定

  • 1.

    西南大学 食品科学学院/川渝共建特色食品重庆市重点实验室，重庆 400715

  • 2.

    重庆市渝东南农业科学院，重庆 涪陵 408000

  • 基金项目: 国家自然科学基金青年项目(31801529)；重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2023NSCQ-MSX0521)；涪陵区科技局计划项目(FLKJ2023AAN1002)；重庆市现代农业产业技术体系资助项目(CQMAITS202307)；四川省教育厅川菜发展研究中心科研项目(CC21Z30)
详细信息
    作者简介:

    IQRA，硕士研究生，主要从事传统发酵食品研究 .

    通讯作者: 杨吉霞，博士，副教授

  • 中图分类号: TS255.5

Isolation and Identification of A Gas-Producing Bacterial Strain from Gassy Pouch Zhacai

  • 1.

    College of Food Science, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Specialty Food Co-Built by Sichuan and Chongqing, Chongqing 400715, China

  • 2.

    Chongqing Southeast Agricultural Science Research Institute, Fuling Chongqing 408000, China

  • 摘要:

    胖袋是榨菜货架期常见的质量问题，为了获得引起胖袋的微生物种类和生理生化性质数据，从胖袋榨菜中分离纯化微生物，经过三糖铁、煌绿胆盐肉汤实验筛选出产气菌株，用榨菜污染实验验证，进一步分析菌株的生理生化性质.通过研究确定1株菌株cq8，在煌绿胆盐肉汤培养基中产气，污染袋装榨菜并且抽真空封袋，引起胖袋，经检测气体为CO2，H2，NH3，用16S rRNA基因测序鉴定为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburia)，它可以代谢精氨酸产气，利用山梨醇，产生蛋白酶使明胶液化，产生过氧化氢酶.

    Abstract:

    Gassy pouch is a common quality issue in the shelf life of bag-packaged Zhacai.In order to obtain data of species, physiological and biochemical properties of microorganisms causing gassy pouch, this study isolated and purified the bacterial strains from swollen bag of packaged Zhacai samples, and the strains were subjected to the trisaccharide iron agar slant and brilliant green lactose bile broth (BGLB, with inverted tubes) test to screen the gas-producing strains.The strains were verified through contamination experiments of Zhacai, and detailed physiological and biochemical characteristics were analyzed to get the basic knowledge of the strains.Through the experiments, a strain cq8 was identified to produce gas in BGLB medium.A contamination experiment was conducted by artificially adding the bacterial culture of the strain cq8 to the bags of Zhacai and sealed the bags with a vacuum packaging machine.The strain caused swollen bag phenomenon, and the gas components inside the package were determined to be CO2, H2, NH3 with the gas tube method.The species of cq8 was identified by 16S rRNA gene sequencing as Enterobacter asburia.It can metabolize arginine to produce gas, metabolize sorbitol, produce protease to liquefy gelatin, and produce catalase.This study can provide reference data for controlling gassy pouch issue of Zhacai through the actions on microorganisms more precisely.

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  • 图 1  产气微生物的筛选和污染验证实验结果

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    图 2  产气菌株cq8的菌落形态和革兰氏染色显微形态

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    图 3  产气菌株cq8的16S rRNA基因序列系统进化树

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    图 4  精氨酸脱亚氨酶途径[22]

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    表 1  污染验证实验中胖袋气体成分检测结果(气体管法)

    污染的菌株 气体成分
    CO2 H2 NH3 H2S CO NO2 CH3OH
    cq8 + + + - - - -
    注：+为阳性；-为阴性.
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    表 2  产气菌株cq8的生理生化实验结果

    生化项目 实验结果 生化项目 实验结果
    动力 + 山梨醇 +
    赖氨酸 - 蜜二糖 -
    鸟氨酸 + 侧金盏花醇 -
    柠檬酸盐 + 棉子糖 -
    硫化氢 - 革兰氏染色 -
    尿素 - 过氧化氢酶 +
    吲哚 - 明胶液化 +
    V-P + 甲基红 -
    苯丙氨酸 - 精氨酸产氨 +
    甘露醇 - 氧化酶 -
    肌醇 -
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    表 3  胖袋和正常榨菜中主要挥发性气体成分(n=5)

    挥发性气体成分 正常榨菜/% 胖袋榨菜/%
    十五烷酸 1.21±0.12 1.62±0.10**
    十八碳三烯酸(亚麻酸) 3.37±0.34 3.78±0.26
    二十碳烯酸 1.09±0.24 1.87±0.25*
    十八烯酸 0.46±0.14 2.56±0.23***
    十九烷 2.56±0.13 3.00±0.64
    雪松醇 1.32±0.25 1.78±0.24
    2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二异丁酸酯 0.85±0.34 1.12±0.15
    茴香烯 1.82±0.13 2.60±0.35*
    氢气 2.33±0.74 3.54±0.53*
    三甲基十三烷 0.98±0.15 1.12±0.26
    注：***为p＜0.001，**为p＜0.01，*为p＜0.05，差异有统计学意义.
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-03-18
  • 刊出日期:  2024-09-20

胖袋榨菜中1株产气微生物的分离和鉴定

    通讯作者: 杨吉霞，博士，副教授
    作者简介: IQRA，硕士研究生，主要从事传统发酵食品研究
  • 1. 西南大学 食品科学学院/川渝共建特色食品重庆市重点实验室，重庆 400715
  • 2. 重庆市渝东南农业科学院，重庆 涪陵 408000
  • 收稿日期:  2024-03-18
基金项目:  国家自然科学基金青年项目(31801529)；重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2023NSCQ-MSX0521)；涪陵区科技局计划项目(FLKJ2023AAN1002)；重庆市现代农业产业技术体系资助项目(CQMAITS202307)；四川省教育厅川菜发展研究中心科研项目(CC21Z30)

摘要: 

胖袋是榨菜货架期常见的质量问题，为了获得引起胖袋的微生物种类和生理生化性质数据，从胖袋榨菜中分离纯化微生物，经过三糖铁、煌绿胆盐肉汤实验筛选出产气菌株，用榨菜污染实验验证，进一步分析菌株的生理生化性质.通过研究确定1株菌株cq8，在煌绿胆盐肉汤培养基中产气，污染袋装榨菜并且抽真空封袋，引起胖袋，经检测气体为CO2，H2，NH3，用16S rRNA基因测序鉴定为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburia)，它可以代谢精氨酸产气，利用山梨醇，产生蛋白酶使明胶液化，产生过氧化氢酶.

English Abstract

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  • 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

  • 重庆市涪陵区有“榨菜之乡”的美誉，涪陵榨菜与德国的甜酸甘蓝、欧洲的酸黄瓜并称世界3大名腌菜[1]，它由茎瘤芥(Brassica juncea)经过“3腌3榨”加工而成[2].第1次腌制向茎瘤芥中加入5%的盐，去除其中水分；第2次腌制再添加6%~8%的盐，这是榨菜风味形成的主要阶段；第3次加入10%左右的食盐腌制4~6个月，使榨菜风味进一步完善，同时高盐能抑制大部分微生物的生长[3].腌制完成的茎瘤芥通过切割、脱盐、真空拌料、装袋、灭菌等步骤加工成榨菜成品.

    榨菜主要经天然微生物发酵，腌制时间较长，涉及到的微生物种类繁多，环境和青菜头原料表面可能存在腐败微生物，尽管腌制结束后有脱盐、包装(抽真空)、杀菌等步骤，但某些腐败微生物能耐受较高的盐浓度、高温、厌氧等逆境，在抽真空、杀菌后的包装中仍可能存活并生长繁殖，最终引起榨菜腐败变质[4-5].如果腐败微生物产生气体，则会出现胖袋现象，它是一种常见的榨菜变质现象[6].目前已有文献进行了榨菜胖袋的研究，如采用辐照处理[6]、大蒜[7]、超高压杀菌[8-9]等方法抑制腐败微生物的生长，以控制胖袋现象，然而至今获得的引起胖袋现象的微生物种类的信息仍然很少.吴丹等[10]鉴定了2株菌株分别为坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌，除此之外鲜有报道.获得更多的微生物种类和生物学信息，可有针对性、高效地控制胖袋微生物，减少货架期内榨菜的变质现象.本研究从胖袋榨菜中分离纯化微生物，通过产气实验筛选出产气菌株，用污染实验验证胖袋现象，再进一步分析菌株的生理生化性质.此外，采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱质谱(GC-MS)联用检测正常榨菜和胖袋榨菜的挥发性成分，对比分析成分的差异显著性.

1.   材料与方法

    1.1.   主要材料和试剂

    1.1.1.   主要材料

  • 从市场上采集袋装正常榨菜和胖袋榨菜样品各5件.

    • 1.1.2.   主要试剂

  • 营养肉汤(NB)，北京奥博星生物技术有限公司；YM培养基(霉菌和酵母菌增菌培养基)，青岛海博生物技术有限公司；厌氧产气袋(2.5 L)，日本三菱公司；三糖铁琼脂培养基(TSI)，北京陆桥技术有限公司；煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)，青岛海博生物有限公司；2×Hieff Canace© PCR Master Mix (No Dye)，翌圣生物科技(上海)股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生物科技(北京)有限公司；气体检测管，北京华瑞博远科技发展有限公司；明胶液化生化管(军团菌)，青岛海博生物技术有限公司；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管，北京陆桥技术有限公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司.

    • 1.2.   主要仪器

  • 凝胶成像系统，英国Syngene公司；PCR仪(T100梯度)，美国伯乐Bio-Rad公司；气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP2010Plus型)，日本SHIMADZU公司；75 μm萃取纤维头(CAR/PDMS型)，美国Supelco公司.

    • 1.3.   实验方法

    1.3.1.   胖袋榨菜中微生物的分离

  • 取25 g胖袋榨菜样品，在无菌条件下用搅拌机打碎，转移至带滤网的无菌均质袋中，加入225 mL无菌生理盐水稀释，拍打均质5 min，滤液即为10-1倍稀释液，继续用无菌生理盐水做10倍梯度稀释至10-5.取100 μL 10-2，10-3，10-4，10-5梯度稀释液涂布于YM培养基、NB固体平板中，放入厌氧罐中加入厌氧产气袋，倒置放入37 ℃的恒温培养箱中培养48 h[4].选取菌落数在30~300的平板，根据菌落形态特征挑取单菌落，划线分离3次以上，直至纯化，观察并描述菌株的菌落形态和显微形态(革兰氏染色).

    • 1.3.2.   产气微生物的筛选和验证实验

  • 将纯化后的菌株接种于三糖铁琼脂培养基斜面、煌绿乳糖胆盐肉汤(含倒管)中，30 ℃培养48 h后观察，如果菌株出现产气现象，则进一步用污染实验验证.预先将榨菜分装20 g /袋，于121 ℃下灭菌15 min，制备无菌榨菜.将产气菌株接种于NB培养基中培养至对数期，于5 000 r/min离心5 min沉淀菌细胞，用无菌PBS缓冲液清洗菌细胞，再加入PBS悬浮菌细胞至OD540为1.0，取20 μL上述菌液加入无菌榨菜中(20 g/袋)，抽真空密封，于30 ℃培养箱中培养，重复5次，如果出现胖袋现象，则可验证该菌株为引起胖袋的菌株.采用气体检测管检测所产生的气体种类，包括CO2，H2，NH3，H2S，CO，NO2，CH3OH等7种气体.

    • 1.3.3.   微生物的种类鉴定

  • 按照细菌基因组DNA提取试剂盒中的方法提取胖袋菌株的DNA，用通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1 541 R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)扩增16S rRNA基因.PCR反应体系为：12.5 μL预混缓冲液(2×Hieff Canace©)，0.5 μL引物(10 mmol/L)，2 μL DNA，10 μL ddH2O.PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s；55 ℃复性45 s，72 ℃延伸90 s，共30次循环；72 ℃延伸10 min.用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化后，送至生工生物工程(上海)有限公司做双向测序.

    • 1.3.4.   微生物的生化性质分析

  • 采用E75/15肠杆菌科细菌生化编码鉴定管检测菌株的15个生化项目，参照文献[11-14]的方法检测过氧化氢酶、氧化酶、明胶液化、甲基红等.

    • 1.3.5.   袋装榨菜中挥发性气体成分分析

  • 采用顶空固相微萃取和气相色谱质谱联用分析榨菜样品中的挥发性成分.参照李莹等[15]的方法并稍做修改，取5 g榨菜样品，搅碎后置于20 mL的顶空瓶中，加入10 μL癸酸乙酯(5 μg/mL，溶于乙醇)作为内标，顶空瓶在80 ℃恒温水浴中平衡5 min后，推出纤维头吸附35 min，插入GC进样口在250 ℃下解析5 min.GC条件：初温40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速度上升至10 ℃，保持2 min，以10 ℃/min上升至250 ℃，保持1 min；载气为高纯度氦气，柱流量为1.0 mL/min，不分流.MS条件：接口温度250 ℃，离子源温度250 ℃，质子扫描范围35~200 m/z.通过NIST 17谱库进行自动检索以对挥发性成分进行定性.胖袋/正常榨菜样品分别有5件，每个样品重复检测3次，结果以x±s表示，使用SPSS 25软件对数据进行独立样本t检验，p＜0.05表示差异有统计学意义.

2.   结果与分析

    2.1.   产气微生物的筛选和污染验证实验结果

  • 将胖袋榨菜中微生物进行培养、划线分离纯化，获得45株菌株.经过三糖铁琼脂培养基和煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)(含倒管)实验，筛选出产气菌株1株(cq8)，用污染实验验证cq8能够引起胖袋现象.

    三糖铁琼脂培养基实验结果如图 1a，琼脂斜面部分呈红色，底部柱状部分呈黄色，说明菌株cq8只能代谢葡萄糖，不能代谢乳糖和蔗糖，因为葡萄糖的浓度为乳糖、蔗糖的1/10，菌株只能利用葡萄糖产生少量的酸使培养基变黄，斜面部分因与空气接触氧化，与细菌代谢生成的碱性产物中和而呈红色，底部因缺氧不能被氧化而保持黄色.琼脂没有变黑现象说明菌株不产生H2S气体.煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)实验结果如图 1b，液体由蓝色变为黄色并且混浊，液面有菌膜，倒管中出现气泡，说明菌株cq8能够代谢乳糖产酸，有产气现象，能形成生物膜.

    在20 g榨菜中人为添加cq8菌液(对数期，OD540=1.0)，装袋抽真空密封，在30 ℃培养箱中培养14 d，出现胖袋，证实该菌株能引起胖袋现象(图 1c).采用气体检测管检测，CO2，H2，NH3的检测结果为阳性，而H2S，CO，NO2，CH3OH的检测结果为阴性，如表 1.

    • 2.2.   产气菌株的形态学和生理生化特征

  • cq8的菌落形态特征(图 2a)：菌落直径在0.5~2.5 mm，圆形、表面光滑、白灰色、中间凸起.cq8的显微形态特征(图 2b)：革兰氏染色阴性，短杆状.表 2列出了cq8的生理生化实验结果，它不能利用赖氨酸和苯丙氨酸，可以利用鸟氨酸，并且可以利用精氨酸产生氨气；在糖代谢特性上，能利用山梨醇，不能利用蜜二糖、侧金盏花醇、棉子糖；在产酶特性上，可以产生蛋白酶使明胶液化，能产生过氧化氢酶，不能产生氧化酶.

    • 2.3.   产气菌株的菌种鉴定

  • 对cq8菌株的16S rRNA基因扩增、测序，得到序列1 342 bp，将序列信息输入NCBI的Blast中，与GenBank数据库中的标准菌株序列进行比对，获得菌种鉴定结果为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburia)，覆盖度为99.99%，相似度为99.78%.采用MEGA 6.0软件对cq8菌株和标准菌株的16S rRNA基因序列构建系统进化树(图 3)，采用邻位连接(Neighbor-Joining，NJ)方法，Kimura的双参数模型法计算进化距离矩阵，1 000个bootstrap重复数据评价树拓扑结构的稳定性[16].

    • 2.4.   胖袋榨菜中主要挥发性气体成分检测

  • 采用GC-MS检测胖袋、正常榨菜中的主要挥发性气体成分，结果如表 3.共鉴定出10种物质，其中醇类、酯类、酸类、其他成分分别有1，1，4，4种.对比正常榨菜和胖袋榨菜，挥发性成分的差异主要体现在酸性挥发物上，如十五烷酸、十八烯酸、二十碳烯酸在胖袋榨菜中的相对含量明显高于正常榨菜，可能是微生物在胖袋榨菜中利用营养物质产生酸性物质.此外氢气在胖袋榨菜中的含量也明显升高，这与污染实验产生了氢气的结果一致.

3.   讨论与结论

  • 本研究从胖袋榨菜中分离纯化微生物，通过产气实验、污染验证实验鉴定出1株(cq8)能引起抽真空包装的榨菜胖袋，并且分析了它的生理生化性质.菌株cq8在三糖铁琼脂培养基(斜面)中可以代谢葡萄糖，不能代谢乳糖和蔗糖，不产气，然而它在煌绿胆盐肉汤培养基中能够代谢乳糖产气.在榨菜污染实验中产生的气体为CO2，H2，NH3.经过16S rRNA基因测序分析将cq8的菌种鉴定为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburia).

    阿氏肠杆菌属于肠杆菌科肠杆菌属，革兰氏阴性杆菌，厌氧发酵，广泛分布在植物、土壤和水中，是一种条件致病菌，在血琼脂平板上呈灰白色菌落，不溶血；在麦康凯培养基上呈圆形灰色、轻度隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为0.2~0.3 mm的针尖状小菌落[17].肠杆菌属是食品中常见的引起腐败的菌属，李娜[18]从胀罐酱油中分离出2株具有强产气能力的菌株，分别为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和粪肠球菌(Enterococcus faecium)；张巧等[19]通过培养法分离出1株产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，污染实验中能引起荸荠腐烂；王洋等[20]也在一批胀罐变质的茶饮料中分离出肠杆菌属(Enterobacter sp.)的菌株.肠杆菌属菌株能够从原料、加工环境、加工人员等多个途径进入榨菜生产中，进而在榨菜储存、售卖中引起榨菜的胀袋变质.

    菌株cq8可以利用精氨酸产生NH3.微生物对精氨酸的降解存在多种途径，其中精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，ADI)途径是最广泛的厌氧途径[21].精氨酸在精氨酸脱亚胺酶的催化下转化成瓜氨酸，释放出氨气，再转化为鸟氨酸，并且生成氨甲酰磷酸，后者在氨基甲酸酯激酶催化下生成氨气和二氧化碳，通过此途径在厌氧条件下产生CO2和NH3(图 4)，这与菌株在抽真空包装的榨菜污染实验中能产生CO2和NH3相吻合.

    肠杆菌属(Enterobacter)的菌株常见于发酵制品中，其繁殖速度快，生长迅速，有很强的制氢能力，并同时产生CO2，从而造成产气胀袋现象[23].肠杆菌属发酵产氢主要包括甲酸裂解途径和NADH途径[24].甲酸裂解途径即葡萄糖经过EMP途径产生丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸甲酸裂解酶的作用下生成甲酸和乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，甲酸在甲酸氢裂解酶系的催化下完成裂解生成CO2和H2.另一条途径为NADH产氢途径，它在严格厌氧菌中起着重要作用，至今对此条途径的认识不多，获得的相关氢酶的类型、基因、电子传递链等信息非常有限[24-26].

    肠杆菌属的菌株广泛存在于自然环境中，在厌氧条件下能够生存，繁殖活性强，能够产生多种气体，引起胖袋现象.针对肠杆菌属菌株的生物学特性，根据其耐热性不强的特点，榨菜加工中可采用较高的温度杀菌，以控制肠杆菌属的菌株.

参考文献 (26)

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