下载:
-
开放科学(资源服务)标识码(OSID):
-
岩溶石漠化是指在喀斯特脆弱生态环境条件下，由自然或人为因素而导致的地表植被破坏、土壤极度侵蚀、基岩大面积裸露和土壤生产力急剧下降的过程[1]. 据《中国·岩溶地区石漠化状况公报》显示，截至2016年底，中国岩溶石漠化面积达1 007万hm2，涉及贵州、云南、广西、湖南、湖北、重庆、四川和广东8省(区、市)463个县，占区域国土面积的9.4%. 石漠化的危害主要表现为土地退化，植被种类减少并逆向演替，植被涵养水源、截蓄降水和调节径流的功能下降，导致地区干旱、洪涝等自然灾害频发，耕地资源减少，农民贫困加重等[2]. 因此，石漠化是中国西南亚热带喀斯特地区面临的重大生态问题之一，严重制约当地经济的可持续发展[3]. 从20世纪80年代开始，我国先后开展了许多石漠化修复项目，其中最重要的措施之一是在当地发展生态农业，既有利于恢复植被，也能增加当地居民的经济收入[4].
桑树作为一种多年生的速生乔木，发达的根系、强大的保水固土和耐修剪等特点赋予其极强的生命力和抗逆特性，使其在防风固沙、石漠化治理、水土保持、盐碱地治理、城市绿化、消落带生态恢复、重金属污染土壤生态修复等方面均有广泛的利用价值[5-6]. 除了作为家蚕唯一的天然饲料来源外，桑树的多元化利用也方兴未艾. 桑叶为“药食同源”植物，桑叶中的蛋白质、碳水化合物、无机盐和维生素质量分数高，适合食用，可以制茶和桑叶面[7]. 桑叶干物质中粗蛋白质量分数达15%~30%，可以作为饲料原料喂养猪、鸡、鱼等[8]. 桑枝、桑白皮、桑椹富含黄酮、生物碱、多糖类化合物，是传统的中药材[9]. 同时，桑枝也是食用菌培养基、纸张和人工纤维的原材料. 桑椹味甜汁多，可作为水果，也可加工成果汁和果酒等产品. 随着2006年“东桑西移”国家战略的实施，中国栽桑养蚕的重心逐步从东部地区向西部地区转移. 据2020年全国桑园面积统计结果显示，西部地区桑园面积为54.76万hm2，占比为71.6%，其中广西、四川、云南位居前3，桑园面积均超过6.67万hm2. 而石漠化涉及的8个省(自治区、直辖市)的桑园面积合计占全国桑园总面积的71.3%，蚕茧产量占全国蚕茧总产量的83.3%. 因此，蚕桑产业在中国石漠化地区的生态修复和经济发展中具有巨大的潜力.
石漠化地区土壤主要由碳酸盐岩石(CaCO3，MgCO3)组成，其特征主要为土壤高钙、持水能力差、干旱频发等[10]. 土壤高钙是影响石漠化地区植被类型、植物生理特征和分布最重要的环境因素之一[11-12]，当土壤中Ca2+过高时，会损害植物细胞壁和细胞膜，干扰植物磷酸代谢系统，抑制光合作用和蒸腾速率[13]. 由于桑树分布地域广、生长环境多样、受自然和人工选择时间长等特点，造就了其丰富的种质资源. 然而，目前对于不同桑树或桑树砧木种质以及品种资源在高钙环境下的生理生化分析和特性评价未见报道. 本研究选取7个在中国亚热带广泛种植和在良桑扩繁中作为砧木广泛使用的桑品种为试验材料，完成了钙处理浓度的筛选和桑苗根长、叶绿素质量分数、抗氧化酶活性、脯氨酸质量分数等生理指标的测定与分析，以及不同品种桑苗抗高钙胁迫能力的综合评价，以期有助于揭示桑树在响应高钙胁迫时的生理现象，也为获得适合在石漠化地区直接推广桑树品种和良桑繁育的砧木奠定基础.
全文HTML
-
本研究使用7个杂交桑品种的种子，包括桂特优2(M. atropurpurea cv. Guiteyou2，G2)，桂桑6(M. atropurpurea cv. Guisang6，G6)，桂桑优12(M. atropurpurea cv. Guisangyou12，G12)，桂桑优62(M. atropurpurea cv. Guisangyou62，G62)，粤桑11(M. atropurpurea cv. Yuesang11，Y11)，塘10×伦109(M. atropurpurea cv. Tang10×Lun109，TL)，丰驰(M. albacv. Fengchi，FC). 这7个品种在全国范围内被推广种植，同时也是其他桑树品种嫁接繁殖的常用砧木品种. 各品种的种子经消毒后，置于MS固体培养基上，萌发至10 d苗龄大小，选取大小一致的幼苗进行后续试验.
-
选取10 d苗龄大小的G12，G62和FC无菌苗筛选合适的钙处理浓度. 将苗置于含0(对照)，50，100，150，200 mmol/L CaCl2的MS固体培养基上. 将固体平板竖直放置在培养箱中，培养条件为23 ℃下光照16 h/黑暗8 h. 主根长通过WinRHIZO根系分析系统观测. 随后将10 d苗龄大小的7个品种无菌苗分别置于含0(对照)和100 mmol/L CaCl2的MS固体培养基上. 14 d后测定主根长，并收集新鲜植物体进行后续指标的测定.
-
称取叶片0.1 g，用剪刀尽量剪碎，10 mL 80%丙酮浸提12 h，期间摇动2~3次至样品完全变白，然后离心除去残渣；再用80%丙酮定容至25 mL，即得到叶绿素提取液. 用酶标仪分别在646，663 nm处进行吸光度的测量. 叶绿素质量分数的计算公式为：
SChla为叶绿素a质量浓度(mg/L)，SChlb为叶绿素b质量浓度(mg/L)，SChl为叶绿素质量分数(mg/g)，V为提取液体积(L)，fw为组织湿质量(g).
-
以研磨后的植株为样品，参照BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，TJD20S)说明书，制作标准曲线，检测并计算样品中总蛋白浓度. 参考茚三酮法脯氨酸(Pro)质量分数测试盒(南京建成，A107-1-1)说明书，检测并计算样品中Pro质量分数. 参考钼酸铵法过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(南京建成，A007-1-1)说明书，检测并计算样品中CAT活性. 参考黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(南京建成，A001-1-1)说明书，检测并计算样品中SOD活性. 参考过氧化物酶(POD)测定试剂盒(南京建成，A084-3-1)说明书，检测并计算样品中POD活性.
-
采用模糊数学的隶属函数法分析评价7个桑树品种幼苗的高钙耐受性[14]. 隶属函数值(Membership Function Value，MFV)基于钙耐受系数(CalciumTolerance Coefficients，CTC)计算. CTC的计算公式为
CK为对照组某一指标的平均值，CT为处理组对应指标的平均值，CCT包括各形态、生理生化指标.
钙耐受性的MFV计算公式为：
与钙耐受性正相关的指标用公式MFV1计算，与钙耐受性负相关的指标用公式MFV2计算. CTCi表示第i个指标，CTCmax为第i个指标的7个品种中最大的CTC值，CTCmin为第i个指标的7个品种中最小的CTC值.
为了对7个桑树品种的钙耐受性进行排序，计算各品种的MFV平均值. 同时，基于每个品种各指标的MFV进行聚类分析，采用欧式距离(Euclidean Distance)进行计算.
-
本研究数据中，各形态、生理生化指标结果用平均值±标准差表示，使用SPSS 20.0进行统计分析，使用GraphPadPrism 7.0作图. 两组间比较，使用独立样品T-test分析，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，差异有统计学意义.
1.1. 供试材料
1.2. 钙胁迫处理
1.3. 叶绿素质量分数测定
1.4. 抗氧化酶活力、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)测定
1.5. 钙耐受综合评价
1.6. 统计分析
-
为了筛选到适用于桑树幼苗的钙处理浓度，选取10 d大小的桑树品种桂桑优12(G12)、桂桑优62(G62)和丰驰(FC)幼苗作为试验材料，置于含不同CaCl2浓度的MS培养基中，14 d后测量其主根生长量(图 1). 与对照组相比，在50 mmol/L Ca2+浓度条件下，3个品种的桑树幼苗表型和主根伸长量无显著变化，主根平均伸长量为对照组的86.6%(G12)，80.2%(G62)，80.2%(FC)；在100 mmol/L Ca2+浓度条件下，3个品种的桑树幼苗主根生长受到显著抑制，叶片有失绿、焦枯的现象，主根平均伸长量为对照组的24.3%(G12)，16.6%(G62)，20.0%(FC)；在150 mmol/L和200 mmol/L Ca2+浓度条件下，3个品种的桑树幼苗表现为严重的生长不良，植株整体生长缓慢，小而卷曲，脆弱易折，主根的生长受到严重抑制，几乎停止发育.
在本试验选取的4个Ca2+胁迫浓度中，与其他处理浓度相比，100 mmol/L Ca2+浓度下的桑树幼苗表型与对照组差异显著，表明受到了比较严重的钙离子胁迫，但植株整体生长状态尚可，因此选定100 mmol/L为后续耐高钙品种筛选的钙胁迫处理浓度.
-
为了研究7个桑树品种对高钙胁迫的生理生化反应，以100 mmol/L Ca2+为处理浓度对这些品种的10 d大小幼苗进行胁迫处理，14 d后测定主根伸长量、叶绿素质量分数、脯氨酸(Pro)质量分数和抗氧化酶活性等生理生化指标(图 2). 同对照组相比，100 mmol/L Ca2+浓度处理下，7个桑树品种的幼苗主根伸长量和叶片叶绿素质量分数均受到显著抑制(图 2a，2b). 在幼苗主根伸长量指标上，粤桑11(Y11)受到的抑制效果最轻，主根的相对伸长量为41.1%；塘10×伦109(TL)受到的抑制效果最显著，主根的相对伸长量为15.3%(表 1). 在幼苗叶片叶绿素质量分数指标上，Y11受到的抑制效果最轻，叶绿素的相对质量分数为44.1%；桂特优2(G2)受到的抑制效果最显著，叶绿素的相对质量分数为22.5%(表 1). 同对照相比，100 mmol/L Ca2+浓度处理下，7个桑树品种的幼苗植株脯氨酸(Pro)质量分数显著上升(图 2c). 其中，丰驰(FC)的Pro质量分数最高(835.7%)，而桂桑6(G6)的Pro质量分数最低(133.8%)(表 1).
当植物受到胁迫时，促进细胞内的活性氧基团(ROS)生成，引起植物的氧化应激反应[15]. 植物通常通过增强一些抗氧化酶活性来减少细胞中过量的ROS[16]. 同对照组相比，7个桑树品种高钙处理下的幼苗过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性存在差异(图 2d-2f). 其中，FC与G62的CAT活性显著高于对照组，而其余5个品种的CAT活性均显著低于对照组. 该结果表明100 mmol/L Ca2+可能超出了这5个品种的相对耐受阈值，使响应胁迫的CAT活性低于正常水平. 桂桑优62(G62)、粤桑11(Y11)和丰驰(FC)的SOD活性与对照组相比无显著差异，其余4个品种的SOD活性均显著低于对照组. 该结果表明100 mmol/L Ca2+可能超出了这4个品种的相对耐受阈值，使响应胁迫的SOD活性低于正常水平. 在处理组中，除塘10×伦109(TL)的POD活性低于对照组外，其余6个品种的POD活性均显著高于对照组.
-
基于隶属函数值(MFV)的综合评价方法在油菜、玉米、葡萄等不同品种的抗盐、抗旱性评价中有诸多报道[14, 17-19]. 为了系统评价桑树品种间耐高钙性的强弱，采用钙耐受系数(CTC)对所有指标进行标准化分析(表 1)，随后利用CTC计算桑树品种的MFV. 基于每个品种各项指标的MFV均值，对桑树品种的耐高钙能力进行排序. MFV均值越高，表示推测的耐高钙性越高. 7个品种MFV均值由高到低依次为FC，Y11，G62，G12，TL，G2，G6. 其中，FC的MFV均值最高为0.738，而G6的MFV均值最低为0.119. 在MFV计算的基础上，采用欧氏距离法聚类分析对桑树品种进行分类(图 3). 根据聚类结果，FC，G62聚为一组(高钙耐受较强组)，TL，G6和G2聚为一组(高钙耐受较弱组)，而Y11和G12居于中间(高钙耐受中等组).
2.1. 不同Ca2+浓度对桑树幼苗生长的影响
2.2. 高钙胁迫对不同桑树品种幼苗生长的影响
2.3. 不同桑树品种幼苗的耐高钙性排序和分组
-
钙是植物必需的大量元素之一，在植物生长发育中发挥着重要的生物学作用. 而当过量的Ca2+进入细胞质中，可与磷酸盐形成沉淀物，导致磷酸代谢途径紊乱，破坏细胞膜结构，降低光合作用和蒸腾速率减缓植物生长[20]. 高钙是石漠化地区土壤的典型特征之一，影响植物群落的类型和分布[21]. 当外源Ca2+处理浓度大于20 mmol/L时，千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)幼苗发育不良[22]. 30 mmol/L Ca2+处理浓度下，拟南芥(Wassilewskija)幼苗生长受到严重抑制[23]. 吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)和旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)是中国西南喀斯特地区的当地物种，能够耐受的根际可溶性钙浓度最高阈值分别为200 mmol/L和20 mmol/L[24]. 在本试验中，3个品种的桑树幼苗在50 mmol/L Ca2+条件下均能够正常生长，说明桑树幼苗具有较强的高钙耐受性.
本研究选取100 mmol/L Ca2+(约4 g/kg)作为品种筛选浓度，略高于已报道的湖南、贵州石漠化地区土壤平均交换性钙质量分数1.46~3.61 g/kg[12, 25]. 同对照组相比，100 mmol/L Ca2+处理条件下，7个桑树品种幼苗的主根伸长量和叶片叶绿素质量分数均显著下降，而Pro质量分数均显著上升. Pro作为一种渗透调节物质，具有清除活性氧、保护酶活性、调节渗透平衡、提供能量来源等作用，在干旱、盐胁迫等条件下会在植物体内大量积累[26]. 因此，Pro在植物响应高钙胁迫中也发挥着重要的功能.
SOD，CAT和POD作为植物抗氧化酶系统的重要组成部分，SOD在细胞内参与将超氧自由基转换为H2O2，CAT和POD在细胞内参与清除H2O2[16]. 在本试验中，7个桑树品种间的CAT，SOD和POD活性在高钙胁迫条件下存在差异，有的同对照组相比活性下降，有的同对照组相比活性上升. 据报道，50 mmol/L Ca2+处理60 d条件下会导致金银花根系活力下降，叶片MDA质量分数和SOD，CAT和POD活性上升[27]. 彭博等[28]报道了狭叶香蒲在不同钙浓度梯度下30 d后的生长状况和生理特性，同对照组相比，0.9~1.5 g/kg钙处理组中SOD活性显著上升，而1.8 g/kg钙处理组中SOD活性显著降低[28]. 100 mmol/L Ca2+浓度下，G62，Y11和FC的SOD活性与对照组相比无显著差异，其余4个品种的SOD活性均显著低于对照组；而CAT和POD活性方面，仅FC与G62的CAT活性显著高于对照组，除TL外，其余6个品种的POD活性均显著高于对照组. 综合相关报道，说明当胁迫达到一定阈值时，一些抗氧化酶活性会从促进转为受到抑制. 并且在长时间(14 d)的高钙胁迫后，抗氧化酶之一的POD可能在大多数桑树品种中发挥着重要作用.
除了高钙，石漠化地区的特征还包括干旱、高温、强光、高pH值等[29]，而桑树耐旱、耐盐碱等特性让其在陕西、新疆等地的水土保持、防风固沙和生态防护中发挥着重要的作用. 通过本试验筛选获得高钙耐受性前三的品种为FC，G62和Y11，这些品种具有在石漠化地区推广种植的潜力，可作为该地区桑树苗木繁育的优良砧木候选品种. 今后，相关研究工作的重点将是在石漠化地区开展上述几个品种的田间试验，以便进一步研究这些地区桑树的适应性、桑叶产量、土壤改良和水土保持等方面的经济和生态效益. 同时，开发适用于石漠化地区的桑树高产栽培技术和标准同样非常重要.