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鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳属(Eimeria)的一种或多种球虫寄生于鸡肠道中而引起的一种原虫病，该病呈全球分布，发病率为50%~70%，死亡率最高可达到80%[1-2]。目前报道的鸡球虫有7种，其中柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)是致病力最强的虫种，由此虫种导致的原虫病使鸡盲肠显著出血肿胀，肠内出现黄白色干酪样坏死物，引起鸡贫血、消瘦、生长发育不良和产蛋性能下降等症状[3]。据统计，该病每年会对全球家禽养殖业造成约30亿美元的损失[4]。目前对于球虫病的防治主要依赖于药物和弱毒苗。然而过度使用药物，会导致虫株产生耐药性，并出现药物残留、环境污染等问题。尽管弱毒苗有良好的抗球虫效果，但同时也存在毒力恢复的风险[5]。重组亚单位疫苗是通过抗原蛋白与佐剂混合形成的具有免疫效果的疫苗，与弱毒苗相比不仅安全稳定，而且具有生产时间短和经济效益好的优点，因此筛选出有良好免疫保护性的抗原是制备出优秀亚单位疫苗的关键[6]。
表面抗原SAG(Surface antigen)是顶复门原虫中一类富含半胱氨酸的蛋白质，该蛋白均在N段末端有一疏水的信号肽，且在C段末端含有糖基化磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)的结构区域[7]。SAG利用自身的GPI结构锚定在宿主细胞膜表面，主要在虫体的入侵和存活、免疫调节、诱导炎症反应等过程中发挥重要作用。弓形虫(Toxoplasma gondii)SAG1与宿主细胞表面硫化肝素发生特异性结合，促进虫体入侵[8]；恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)分泌的SAG蛋白与裂殖子发生交联，进而有效阻断裂殖子黏附和入侵红细胞，从而保证虫体存活[9]；犬新孢子虫(Neospora caninum)SAG1可以促进细胞因子IFN-γ和IL-4上调，激发机体的Th1和Th2型免疫反应[10]；E. tenella SAG4和SAG5可促进巨噬细胞产生白介素-1β并分泌NO，诱导宿主发生炎症反应[11]。
目前关于EtSAG12的免疫原性和免疫保护作用尚无报道，本研究构建EtSAT12/pET-32a原核表达载体，制备多克隆抗体，通过动物试验评价EtSAG12重组蛋白的免疫保护效果，为E. tenella重组亚单位疫苗的研制提供参考。
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试验虫株为西南大学动物医学院寄生虫实验室保存的E. tenella上海株，试验前经感染无球虫鸡传代增殖得到大量柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊。新西兰大白兔购自西南医科大学实验动物中心。1日龄海兰灰雏公鸡购自重庆华裕畜禽有限公司。
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HRP标记的山羊抗兔IgG购自Sangon Biotech公司，Ni-NTA纯化树脂预装柱、EasyPure©胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京TransGen Biotech(全式金)公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和TMB显色液均购自北京索莱宝科技有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自碧云天生物技术(上海)有限公司。
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取10只1日龄海兰灰雏公鸡饲养于经甲醛蒸熏消毒无鸡球虫的房间内，并且饲养所用鸡笼、水盘和饲料盘等用具都经过高温消毒处理，试验期间全程使用未添加抗球虫药物的饲料。待雏鸡长至14日龄后，每只雏鸡经口感染E. tenella孢子化卵囊按5×104个，并在感染后120 h剖杀试验鸡只收集盲肠。按照文献[12]的方法提取E.tenella裂殖子，最后将提取的裂殖子放入液氮保存。
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根据柔嫩艾美耳球虫EtSAG12基因组数据(GenBank：XM_013375898)，利用Primer-Premier 6.0对EtSAG12进行引物设计。原核表达引物(F2：5′-CCCCGAATTCATGAGCGACGGAACGCCTG-3′，引入酶切位点EcoRI；R2：5′-CCCCCTCGAGTTACAGTGCTGTAATTCCGAATGCG-3′，引入酶切位点XhoⅠ)送至重庆擎科兴业生物科技有限公司进行合成。
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采用TRIzol法提取第二代裂殖子总RNA，再反转录合成cDNA，由cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用胶回收试剂盒回收PCR产物。回收产物与pMD19-T (simple)Vector载体进行连接，再将连接产物转化至大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞中，将菌液PCR鉴定为阳性的重组菌液送至重庆擎科兴业生物技术有限公司测序。然后按质粒提取试剂盒说明书提取阳性重组质粒EtSAT12/pMD19-T和pET-32a质粒，经限制性内切酶EcoRI和XhoⅠ双酶切，将切胶回收的目的基因EtSAT12与pET-32a质粒连接，再将重组表达质粒转化至DH5α感受态细胞；最后提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定。
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挑选阳性菌，经PCR鉴定后提取质粒，并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑单菌落接种于LB/Amp+液体培养基中，振荡培养4 h，加入0.4 mmol/L的IPTG 37 ℃诱导8 h；离心收集菌体，加入缓冲液重悬菌体，并进行超声破碎、离心，取破碎后上清液和破碎后沉淀进行SDS-PAGE电泳检测；用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，并选择20、50、100、150、250 mmol/L的咪唑洗脱液对目的蛋白进行洗脱，最后用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化结果。
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按照文献[13]的方法进行多克隆抗体的制备，将EtSAG12重组蛋白与佐剂混合，对新西兰大白兔进行免疫，共计免疫4次，并在末次免疫7 d后采血，离心取血清。再利用间接ELISA法检测抗体效价，酶标仪检测OD450值，检测孔与阴性孔的比值大于或等于2.1时的最大稀释倍数为该血清最高的抗体效价。达到所需效价后采血制备，纯化多克隆抗体，进行Western Blot检测。
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试验共分为5个组，即感染对照组(PC)、空白对照组(NC)、EtSAG12重组蛋白50 μg组、EtSAG12重组蛋白100 μg组、EtSAG12重组蛋白150 μg组，每组20只1日龄海兰灰雏公鸡。各组的免疫程序见表 1。其中雏鸡饲养环境要求与1.3相同。
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用无菌的PBS稀释EtSAG12重组蛋白至各个免疫组所需的浓度，再将重组蛋白与佐剂以1:1的比例进行混合(首次免疫选用弗式完全佐剂，第二次免疫选用弗式不完全佐剂)，混合液经超声乳化后，用于免疫接种。
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参照文献[14]的方法，以存活率、平均增质量、相对增质量率、卵囊减少率、卵囊值、盲肠病变计分和抗球虫指数(Anti-coccidial index，ACI)作为免疫保护效果的评价指标。
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分别在7 d、14 d、21 d，各个试验组随机选取4只鸡心脏采血1ml并分离血清。参考文献[15]，运用ELISA法检测血清中特异性IgG抗体变化水平。
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用SPSS 27.0将得到的数据进行一维方差描述性统计分析，并用Duncan氏新复极差法对组间平均值进行多重比较，p＜0.05表示差异有统计学意义，p＞0.05表示差异无统计学意义。
1.1. 虫株与实验动物
1.2. 材料
1.3. 裂殖子的提取
1.4. 引物的设计与合成
1.5. EtSAT12/pET-32a原核表达载体的构建
1.6. EtSAG12重组蛋白的诱导表达和纯化
1.7. 多克隆抗体的制备
1.8. 免疫保护效果的评价
1.8.1. 试验设计及免疫程序
1.8.2. 亚单位疫苗的制备
1.8.3. 免疫保护效果评价指标
1.8.4. 血清中特异性IgG抗体检测
1.8.5. 统计学分析
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EtSAG12基因通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示目的条带大小约为780 bp，与预期大小相符(图 1a)。将测序成功的EtSAG12基因亚克隆至pET-32a，经菌液PCR检测，可见1%琼脂糖凝胶电泳结果具有清晰明亮的条带，且大小与预期相符(图 1c)。通过双酶切鉴定，表明EtSAG12已成功连接至pET-32a(图 1d)。
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SDS-PAGE结果显示EtSAG12重组蛋白大小约为43 Ku，表达产物大多数都是以可溶性蛋白的形式存在于上清液中，只有少量存在于沉淀中(图 2a)。纯化后的蛋白无明显杂带，且在筛选纯化条件时，选择50 mmol/L咪唑洗脱液进行洗脱的蛋白浓度更高，效果更好(图 2b)。
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利用间接ELISA法测定兔抗EtSAG12多克隆抗体的效价，结果显示抗体滴度大于1:640 000。Western Blot检测结果显示兔抗EtSAG12多克隆抗体能和EtSAG12重组蛋白特异性结合(图 3b)，表明其具有较好的特异性。
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在攻虫后第4天，除了NC组其它试验组鸡均开始出现精神沉郁、食欲减退、饮水减少、羽毛凌乱等症状。在第5天各个试验组鸡开始出现血便，第6天血便症状最严重。在第6天PC组死亡1只鸡，其他组均无鸡死亡。
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由表 2可知，各免疫组的平均增质量均显著高于PC组(p＜0.05)，其中150 μg组的增质量效果最好，相对增质量率为97.34%；各个免疫组均能有效降低卵囊产量，卵囊减少率在21.66%~52.51%，并且各免疫组的病变计分均显著小于未免疫攻虫组(p＜0.05)。
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根据存活率、平均增质量率、病变计分和卵囊值这些参数综合进行ACI分析。由表 3可知，EtSAG12重组蛋白150 μg组的ACI值为165.34，具有中效抗球虫水平；50 μg和100 μg EtSAG重组蛋白组的ACI值介于120到160之间，属于低效抗球虫水平。
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利用间接ELISA法检测血清中IgG抗体的变化水平，结果显示免疫前各试验组血清中特异性IgG抗体水平差异无统计学意义(p＞0.05)。首免和二免后3个免疫组血清中特异性IgG抗体均显著提高(p＜0.05)，其中二免后血清中特异性IgG抗体迅速产生，且EtSAG12重组蛋白150 μg组产生IgG抗体效果最好(表 4)。
2.1. EtSAT12/pET-32a原核表达载体的构建
2.2. EtSAG12重组蛋白的诱导表达及纯化
2.3. 多克隆抗体的鉴定
2.4. EtSAG12的免疫保护效果观察
2.4.1. 临床观察
2.4.2. 各试验组鸡增质量情况、盲肠病变计分、卵囊产量和卵囊减少率
2.4.3. ACI检测
2.4.4. 血清中特异性IgG抗体水平变化
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SAG具有维持细胞活力、增强虫体感染力、促进虫体入侵和免疫逃避等多种生物学功能。Toxoplasma gondii SAG1蛋白与蛋白激酶C1受体(Receptor of activated protein kinase C1，RACK1)相互作用，调控RACK1发生自噬，进而维持宿主细胞的活力[16]。堆型艾美尔球虫(E.acervulina)SAG能减少宿主体内黏蛋白2(mucoprotein2，MUC2)基因的表达量，间接增强虫体的感染力[17]。E. tenella SAG1蛋白外表面的正电荷区域与宿主细胞表面带负电荷的硫酸化多糖区域相互结合，能促进虫体入侵宿主细胞[18]。此外，E. tenella SAG10能够促进纳虫空泡的形成，使虫体不能被淋巴细胞识别，从而逃避宿主免疫反应[19]。
SAG对球虫具有一定的免疫保护效果，有利于减少宿主因感染球虫而造成的体重损失、卵囊产量降低和肠道病变等作用。大型艾美耳球虫(E. magna)SAG11能减少球虫感染造成的体重损失，并且提高饲料利用率[20]；斯氏艾美耳球虫(E. stiedae)SAG13可以减缓球虫入侵机体，并有效抑制其在肠道内的发育，从而显著降低卵囊产量[21]；E. tenella SAG16和SAG22能显著降低肠道病变计分，缓解因球虫感染造成的盲肠出血、盲肠肿大、盲肠壁增厚等症状[22]。本试验利用EtSAG12重组蛋白制备亚单位疫苗免疫雏鸡，结果显示3个免疫组均能有效减少因球虫感染而导致的增质量损失，卵囊排出量减少和盲肠病变。其中EtSAG12重组蛋白150 μg组抗球虫效果最好，相对增质量率为97.34%，卵囊减少率为52.54%，病变计分最低，ACI值达到165.34，具有中效抗球虫效果。证明EtSAG12重组蛋白对球虫感染具有一定的保护性。
血清中的IgG抗体可与球虫表皮膜抗原结合，激活补体溶解球虫的裂殖子，从而抑制球虫的生长发育[23]，因此血清中特异性IgG抗体水平和抗球虫效果呈现一定相关性。文献[24]发现母源抗体越高的雏鸡其抗球虫能力越强；文献[25]用E.acervulina MIC3、MAR3和MAR6制备亚单位疫苗免疫雏鸡，结果显示EaMIC3免疫组产生特异性IgG抗体最高，并且其ACI值也最高。本试验通过间接ELISA法检测血清中IgG抗体水平，结果显示免疫后的3个免疫组IgG抗体水平较PC组和NC组显著上升(p＜0.05)，在二免后7天抗体水平达到最高，并且IgG抗体水平随免疫剂量的增加而升高。说明EtSAG12重组蛋白诱导机体产生了体液免疫反应。通过比较各个免疫组IgG抗体水平和ACI值发现，150 μg组血清中的IgG特异性抗体水平最高，其ACI值也最高。然而血清中的IgG抗体水平与抗球虫效果并非均呈正相关关系。文献[26]用毒害艾美耳球虫(E.necatrix)ApiAP2重组蛋白制备3个浓度梯度(低、中、高浓度)的亚单位疫苗免疫雏鸡，结果显示高剂量组产生的IgG抗体水平最高，而低剂量组的抗球虫效果最好，即此处IgG抗体水平与抗球虫效果有负相关性。但在本试验中并未出现类似现象，因此其具体的作用机制还有待进一步研究。
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本试验成功表达并纯化了EtSAG12重组蛋白，动物试验结果显示该重组蛋白能有效减少卵囊排出和减轻肠道病变程度，并激发机体自身的体液免疫，对E. tenella感染有一定的免疫保护效果。