“大五星”枇杷采自西南大学合川农场渭沱实验基地，当天运回实验室，挑选大小相对均匀，成熟度基本相同，无病虫害、机械伤的果实，经预冷后设置3个处理。① 0 ℃处理：直接置于(0±0.5) ℃环境中贮藏；② 8 ℃处理：直接置于(8±0.5) ℃环境中贮藏；③程序降温(LTC)：果实在5 ℃下处理6 d后转到(0±0.5) ℃贮藏。相对湿度90%~95%。果实用聚乙烯(PE)薄膜包装后装入塑料筐中，薄膜上打直径1 mm圆孔，不扎袋口，每袋30个。试验采用完全随机设计，设3个生物学重复，每重复10个果实，分别于0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d取样。

硬度测定采用TA-XT plus型质构分析仪(Stable Micro Systems，UK)，采用PS探头(直径5 mm)。参考徐倩^[19]的方法：测定深度4 mm，测前速度3mm/s，测定速度1 mm/s，测后速度10 mm/s。每个果实赤道面(去除小块果皮)测定两次，间隔90°，以单个果实2次测定数值的平均值作为一个重复，单果重复10次。单位用牛顿(N)表示。

褐变指数的统计和计算参考Cai等^[20]的方法，果皮褐变按褐变面积分为5级。0级：无褐变；1级：褐变面积＜5%；2级：褐变面积5%~25%；3级：褐变面积25%~50%；4级：褐变面积＞50%。

果实香气成分采用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行测定。称取5 g枇杷果实冷冻样品，加液氮磨成粉末，放入20 mL顶空萃取瓶中，加入5 mL饱和氯化钠溶液和壬酸乙酯(内标)，封口后混匀，置于AOC-5000自动进样萃取装置的萃取盘，顶空萃取30 min后进入GC-MS(岛津QP2010气相色谱-质谱联用仪，日本)系统检测。HS-SPME针头为65 μm PDMS/DVB(Sigma公司，美国)，设置色谱条件。色谱柱：Rtx-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；升温程序：初始温度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升至150 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃，保持1 min，最后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，保持2 min；载气为氦气，流速1 mL/min，恒线速率，不分流进样。MS条件：离子源为电子电离源，离子源温度230 ℃，接口温度240 ℃，电子能量70 eV，扫描范围35~350 m/z。

数据分析运用计算机检索并与图谱库(NIST 08)的标准质谱图对照，结合相关文献和保留指数RI(Retention Index)，确认香气物质的化学成分，按内标法算出样品各个组分的含量。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和热图分析利用Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca)开展，并计算变量重要性投影值(VIP)，采用SPSS 18.0进行数据分析。

“大五星”枇杷采后3种处理条件下的果实硬度和褐变指数见图 1。21 d时，3种贮藏方式果实硬度变化差异不显著；28 d和35 d时，0 ℃贮藏果实的硬度显著高于8 ℃和LTC处理，8 ℃与LTC处理间差异不显著。其中，35 d时果实的硬度比贮藏前(0 d)增加28%。

3种贮藏条件下褐变起始时间不同：8 ℃和LTC处理在7 d时已有褐变发生，而0 ℃处理7 d后才出现(图 1)；14 d、21 d时，3种贮藏方式的褐变指数差异不显著，但21 d后，褐变指数上升趋势则明显增强；28 d和35 d时，0 ℃和8 ℃处理的褐变指数显著高于LTC处理，0 ℃和8 ℃处理两者间差异不显著。

综合来看，贮藏时间延长到28 d和35 d时，LTC处理对减缓果实硬度增加和降低果实褐变效果较好。

采用HS-SPME-GC-MS分析3种贮藏温度下枇杷果肉的香气成分，共检测到74种成分，包括醛类15种、醇类10种、萜烯类18种、酯类10种、酮类8种、酸类1种、芳香族类8种和其他类4种。本研究各贮藏期内共有的成分为27种。包括9种醛类：分别是己醛、反-2-己烯醛、正庚醛、辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛、癸醛、β-环柠檬醛、β-环高柠檬醛；3种酯类：2-甲基丁酸甲酯、丁酸辛酯、邻苯二甲酸二乙酯；5种酮类：3-辛酮、莰酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯；3种萜烯：对伞花烃、α-蒎烯、γ-松油烯；4种芳香类：1-甲基乙基苯、1-乙基-2-甲基苯、1，2，3-三甲苯、1，2，3，5-四甲苯；3种其他成分：萘、麝香草酚以及甲氧基-苯肟。醛类是总含量最高的物质，0 d时为115.69 μg/kg；在整个贮藏过程中，8 ℃和0 ℃两个处理下醛类总含量总体上呈下降趋势，8 ℃处理下在35 d时最低，为54.32 μg/kg，而0 ℃处理在14 d时最低，为36.20 μg/kg；LTC处理的总含量则为先下降后上升的趋势，到35 d时达到130.95 μg/kg。酯类的总含量仅次于醛类，在0 d时为96.96 μg/kg，3种贮藏方式下总含量均不断减少。萜烯类的总含量在0 d时为22.20 μg/kg，3个处理含量均不断降低，其中葎草烯、γ-衣兰油烯和δ-杜松烯仅在0 d中检测到。酮类的总含量在8 ℃处理下不断降低，到35 d时下降了62.5%，为3.37 μg/kg；在LTC和0 ℃处理下则不断增加，为15.44 μg/kg和20.21 μg/kg。仅检测到一种酸类，即2-甲基丁酸，含量总体呈下降趋势。共检测到10种醇类，贮藏期间含量均不断增加，但在28 d和35 d时，LTC和0 ℃处理的总含量明显高于8 ℃处理。芳香族类物质的总含量则整体上呈上升变化(图 2)。

从贮藏期内香气成分总含量变化可知，8 ℃处理在14 d时总含量最高，之后不断降低，在35 d时最低；而LTC和0 ℃处理的总含量在35 d最高，但仍低于0 d时的总含量，表明低温贮藏导致香气总含量减少。

将3种贮藏方式下采收当天及采后贮藏期间检测出的24种共有芳香物质(萘、麝香草酚、甲氧基-苯肟除外)绘制为热图并进行聚类分析(图 3)。结果显示，Ⅰ类中主要是醛类和酯类，壬醛和辛醛是0 d时含量较高的脂肪族醛类，分别为23.25 μg/kg和7.48 μg/kg，C7-C12的脂肪族醛类是醛香型化合物的重要代表。壬醛在0 ℃和LTC处理下含量总体呈上升的趋势，8 ℃处理下含量则不断降低，35 d时，0 ℃和LTC处理间差异不显著，但均显著高于8 ℃处理。辛醛在3种贮藏方式下呈下降趋势，在35 d时，0 ℃和LTC处理间差异不显著，但LTC显著高于8 ℃处理；癸醛在3种贮藏方式下含量变化无显著差异，0 ℃和LTC处理间差异也不显著，但两者均显著高于8 ℃处理。0 d时正己醛含量最高，为48.25 μg/kg，正己醛在0 ℃处理下总体上呈下降趋势，在LTC处理下呈先下降后上升趋势，8 ℃处理下呈现先下降后上升又下降的规律，35 d时LTC处理的含量显著高于0 ℃和8 ℃处理。反-2-己烯醛在3种贮藏方式下均表现为下降趋势，但35 d时LTC显著高于其他两种处理。反-2-壬烯醛在8 ℃处理下先升高后下降，在0 ℃和LTC处理下则呈升高的趋势，35 d时LTC显著高于8 ℃处理。2-甲基丁酸甲酯是0 d时含量最高的酯类，含量为84.71 μg/kg，占0 d时总香气的87.4%，贮藏35 d后显著降低；0 ℃、8 ℃和LTC处理后分别为2.89、5.23和5.10 μg/kg，8 ℃和LTC处理间无显著差异，但均显著高于0 ℃处理。0 d时含量次之的酯为邻苯二甲酸二乙酯，为9.53 μg/kg，具有微弱的芳香气味，是香蕉、成熟木瓜中的一种香气成分。

Ⅱ类中主要是脱辅基类胡萝卜素类香气物质，其中香叶基丙酮、β-紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯属于低阈值香气物质，35 d时，LTC和0 ℃处理的二氢猕猴桃内酯显著高于8 ℃处理。香叶基丙酮的阈值为60 nL/L，具有木兰、青草和花香，35 d时，8 ℃、LTC和0 ℃处理分别为0.28、0.98和2.56 μg/kg，0 ℃处理显著高于其他两种处理。β-紫罗兰酮带有紫罗兰木本和浆果的特有香气，在水中的阈值为0.007 μg/kg，0 d时β-紫罗兰酮的含量为2.53 μg/kg，占酮类香气总含量的28.1%；35 d时，8 ℃、LTC和0 ℃中的含量分别为1.16、7.19和11.11 μg/kg，分别占总酮类的34.4%、46.6%和55.0%，3个处理间差异达显著水平。β-环柠檬醛赋予新鲜枇杷甘草气味。

Ⅲ类中主要是萜烯类和芳香族类，α-蒎烯、γ-松油烯和对伞花烃属单萜类。α-蒎烯具有松香气味，油中阈值为2.08 μg/mg；γ-松油烯的油中阈值为2.89 μg/mg，具有草本香气；对伞花烃具有柑橘香味，水中阈值为0.1 μg/mg。0 d时对伞花烃、α-蒎烯、γ-松油烯的含量分别为0.16、0.22和1.89 μg/kg；对伞花烃和γ-松油烯在8 ℃处理下无显著差异，在0 ℃和LTC处理下则呈上升趋势；α-蒎烯在0 ℃和LTC处理下14 d时含量最高，分别为0.45和0.62 μg/kg，而8 ℃处理在21 d时最高，为0.65 μg/kg。α-蒎烯、γ-松油烯和对伞花烃等单萜类是宽皮柑橘、柚子和晚熟甜橙精油中的主要香气成分。

偏最小二乘判别分析(PLS-DA)是一种多变量统计方法，可以有效区分组间差异。为了从整体上评判不同贮藏温度下枇杷果实香气的差异，以不同贮藏温度和时间下的共有香气物质及0 d含量为变量，对数据归一化处理后进行PLS-DA分析，置换检验结果通过了验证，表明构建的PLS-DA模型结果可靠。PLS-DA模型的前3个成分解释了60.1%的香气差异(图 4)。该模型可以较好区分相同贮藏时间下不同贮藏温度的枇杷果实样品。

变量重要性投影(VIP)主要用于说明自变量在解释因变量时的权重，通常VIP大于1的物质表示在PLS-DA判别过程中为重要差异化合物，这些物质被认为在模型解释中具有显著贡献。本研究中VIP大于1的香气物质有7种(图 5)，分别是对伞花烃、香叶基丙酮、辛醛、α-蒎烯、壬醛、反-2-己烯醛和2-甲基丁酸甲酯。贮藏14 d、21 d、28 d、35 d时，LTC处理对伞花烃的含量均显著高于8 ℃处理，其中14 d、28 d、35 d时LTC和0 ℃处理间差异不显著。贮藏7 d、14 d、28 d时，LTC处理的壬醛含量显著高于其他两处理；35 d时，LTC与0 ℃间差异不显著，但均显著高于8 ℃处理。35 d时，0 ℃处理的香叶基丙酮、α-蒎烯、对伞花烃和壬醛含量较高，LTC处理中关键差异物质为对伞花烃、壬醛、辛醛、反-2-己烯醛和2-甲基丁酸甲酯，其中醛类物质种类多且含量较高，对枇杷清香属性贡献显著。8 ℃处理仅2-甲基丁酸甲酯含量较高。

适宜低温是果实采后长期贮藏最主要的技术措施，可有效延长贮藏期。本研究结果显示，0 ℃贮藏7 d后才出现褐变，而8 ℃和LTC处理在7 d时已有褐变，这些现象表明，低温贮藏可降低果实褐变发生率，提高好果率，但会诱发冷害。与0 ℃和8 ℃相比，LTC贮藏可减缓果实硬度增加和褐变指数上升，表明LTC处理能有效减轻木质化症状，减缓冷害症状，较好地保持果实品质，这与相关研究结果基本一致^{[11, 20-21]}。

本研究基于PLS-DA的多元统计分析获得7种重要差异香气物质，分别是对伞花烃、香叶基丙酮、辛醛、α-蒎烯、壬醛、反-2-己烯醛和2-甲基丁酸甲酯。其中8 ℃处理组的反-2-己烯醛含量呈下降趋势。王毓宁等^[22]报道，随着贮藏时间延长，(6±0.5) ℃贮藏的“冠玉”枇杷中反-2-己烯醛逐渐增加，与本研究结果相反，可能源于品种差异。壬醛赋予水果果香和柑橘香，本研究中0 d时壬醛占醛类总含量的20%。袁婷等^[23]对7个白肉品种枇杷和15个红肉品种枇杷成熟果实的研究表明，壬醛是对果肉风味贡献率最高的挥发性物质，与本研究结论一致。2-甲基丁酸甲酯是0 d时含量最高的酯，付婷婷^[12]报道0 d时含量最高的酯为油酸甲酯，贮藏中均能检测到棕榈酸甲酯，与本研究结果不太一致。袁婷等^[23]在成熟的“大五星”果实中也检测到了2-甲基丁酸甲酯。付婷婷^[12]采用同时蒸馏萃取法提取“大五星”样品，而本研究和袁婷等^[23]采用的是顶空固相微萃取法，差异可能源于萃取方法的不同。王毓宁等^[22]的研究表明，2-甲基丁酸甲酯是“冠玉”枇杷的特征挥发性物质，含量在贮藏中逐渐降低。2-甲基丁酸甲酯具有新鲜水果香味，在“Algerie”枇杷发育过程中被检测到，含量随果实成熟不断增加，但在“Golden”枇杷中却未被检测出^[24]。蒋际谋等^[25]在“香甜”和“钟香25号”两个枇杷品种中检测到了2-甲基丁酸甲酯，但在“解放钟”和“香钟11号”枇杷中却未发现，而Sun等^[26]在“香钟11号”枇杷中检测到了该物质；这些研究表明，香气物质的生物合成受到遗传、成熟阶段、采后贮藏以及生长环境等因素影响^[27-28]。

PLS-DA作为一种有监督的多元统计降维与判别方法，在香气的客观评价中被广泛应用^[29-31]，可衡量变量对分组区分的贡献度。徐慧等^[29]依据检测的挥发性成分构建PLS-DA模型，将3种野生牡丹分类，筛选得到15种差异性成分。通过建立的PLS-DA模型，张映萍等^[30]从草果、艳山姜、草豆蔻3种姜科植物果实中筛选出21种VIP＞1的关键挥发性香气成分。张鹏等^[31]通过“梨香”菊花朵挥发物的PLS-DA模型，利用VIP值和P值筛选得到24种重要差异性成分，对区分不同开花阶段/时间点下“梨香”菊花朵挥发物具有重要作用。研究表明“大五星”枇杷果实在4 ℃下贮藏时，随着贮藏期的延长，会诱发冷害发生，出现木质化败坏^[9]，8 ℃是“大五星”枇杷较适宜的贮藏温度，贮藏期为20 d左右^[9]。程序降温过程中，因果实逐渐适应低温的冷锻炼^[32]，减轻了低温对细胞膜、细胞壁的损害程度^[26]，最终减缓果皮的褐变程度^[32-33]，从而保持较好的贮藏品质。本研究中，35 d时，LTC处理包含较多VIP＞1的重要差异香气物质，0 ℃处理次之，8 ℃处理仅2-甲基丁酸甲酯含量较高。郑现容^[34]的研究表明，梯度预冷处理下关键风味物质(ROAV＞1)有7种：2-戊基呋喃、2-乙基己醇、2-壬烯醛、庚醛、2-十一烷、异戊醇、2-辛烯醛，而直接预冷处理下仅为前4种，表明梯度预冷处理可保留更多关键风味物质。此外，LTC处理一定程度上缓解了冷藏南果梨香气变淡的问题^[35]，蟠桃果实采用一氧化氮结合LTC处理可以延缓果实中体现桃成熟芳香风味的酯类物质的下降，保持贮藏后期芳香风味^[36]；基于本研究结果，后续可结合感官评价或GC-O试验，对不同贮藏方式下的果实香气变化情况进行较为全面的评价。本研究结果表明，3种低温贮藏条件下，结合硬度、褐变指数及香气成分的变化，LTC处理在延长贮藏时间后能更好地维持枇杷的采后品质，表现出较低的褐变程度和较优的香气保留效果。