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在现代农业操作过程中，传统防治病害的方法主要是通过化学药剂来杀死农作物上的有害生物达到病害防治的目的，但化学农药的使用往往导致病害产生抗药性、杀死其他有益生物、破坏环境等问题[1]. 生物防治作为植物保护绿色防控技术的核心组成部分，是我国有效控制化学农药用量、保障农业生产和生态环境安全、提高农产品质量、促进农业可持续发展的重要技术手段[2]. 生防菌在生物防治中发挥着重要作用，维持着生物屏障，增强根际免疫，有效抵御病原菌侵染[3-5]. 其中，木霉作为一种重要的生防菌，被报道是现在生物防治中普遍被认为具有良好生防作用的生防菌因子，其中哈茨木霉的生防价值潜力巨大，是木霉中研究较多的一类生防菌. 哈茨木霉是木霉菌的一种，属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，可寄生于18个属中的29种植物病原菌[6-9]，是一种最具有学术和应用价值的微生物资源之一，其良好的生防效果在实际农业生产中也得到了很好的应用和体现[10-12]. 对哈茨木霉的研究国外开始较早，Zimand[13]的研究发现，哈茨木霉对葡萄孢菌有明显的抑制作用. 国内的研究者针对哈茨木霉的生防作用也进行大量的研究与应用，李琼芳等[14]通过在药材上的研究试验发现，将哈茨木霉T23施用于田间，7.5 kg/hm2的T23田间防治效果达到70%以上，对比于多菌灵粉剂，中药材最多可增产24.5%. 姚彬等[15]在探究番茄病害的生物防治过程中发现，哈茨木霉对番茄灰霉病、叶霉病、枯萎病及褐斑病都有明显的抑制作用. 陈双臣等[16]研究发现，哈茨木霉通过激活与光合相关酶活性及基因表达缓解了叶霉菌对番茄光合生理的抑制作用，哈茨木霉菌株TH16和TH54对番茄叶霉病的防控效果达到69.4%和60.0%. 哈茨木霉作为生防菌剂，还在植物的疫霉病、植物白绢病、马铃薯黑痣病、烟草黑胫病等病害上具有明显的防治作用[17-22]. 近些年也出现了许多相关的物化产品，如美国的T22菌株和以色列的T39菌株都已经实现商业化[23]. 本研究是在研究室分离得到的一株具有生防能力的哈茨木霉菌株TMN-1的基础上，已经明确其生防活性与潜在的生防价值，通过单因素法探究其固体发酵技术，以期得到可用于田间使用的固体木霉制剂，也以此为木霉的商品化提供基础试验材料及理论依据.
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哈茨木霉TMN-1菌株由西南大学植物保护学院天然产物农药研究室分离纯化鉴定并保存.
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PDA培养基，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL. 玉米粉、麦麸、稻壳粉均购置于市场.
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将活化的木霉菌种接种在PDA培养基，置于28 ℃恒温培养箱培养7 d，待分生孢子成熟(PDA培养基上菌落呈浅绿色)，使用无菌水洗脱分生孢子2~3次，每次加入10 mL无菌水，用干净的毛刷轻轻刷下培养基表面的分生孢子，收集洗脱液，显微镜下通过计数板计数，调整孢子悬浮液最终浓度为1×106cfu/mL，备用.
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称取10 g固体发酵基质置于干净的烧杯中，烘箱105 ℃烘干12 h至恒质量. 按照公式计算固体发酵基质的初始含水量.
固体基质含水量(%)=(烘干前基质质量－烘干后基质质量)/烘干前基质质量×100%.
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发酵完成后，取固体发酵物1g加9 mL无菌水，在磁力搅拌器上搅拌5 min，将孢子悬浮液稀释100倍，采用细胞计数板检测发酵产物木霉分生孢子的浓度.
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1) 固体发酵基质的测定：准确称量玉米粉、麦麸、稻壳粉各10 g，以及将三者按1∶1比例两两混合制成10 g固体发酵培养基，分别加入广口玻璃瓶中，灭菌. 设置初始接种条件：含水量50%，接种量10%，发酵温度28 ℃，发酵周期为7 d.
2) 最佳接种量的探究：试验设计以下6个处理，分别以2%、4%、6%、8%、15%、20%的接种量进行接种，每个处理做3次重复.
3) 最佳含水量的确定：试验设计以下7个处理，分别以10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%的含水量进行发酵，其他条件均在上述试验最优条件下进行，每个处理重复3次.
4) 最佳发酵温度的确定：试验设计4个处理，分别在32 ℃、30 ℃、28 ℃、25 ℃的温度下进行发酵，其他条件均在上述试验的最佳条件下进行.
5) 外接碳源对发酵产物的影响：试验选取3种常见碳源，分别为1%葡萄糖溶液、1%麦芽糖溶液、1%淀粉溶液作为外加碳源，探究不同的外接碳源对发酵产物的影响. 每个处理3次重复，其他条件均在上述试验的最佳试验条件下进行.
在发酵的过程中，每12 h翻动发酵基质一次，保证固体基质透气疏松.
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利用Excel 2013进行数据整理，采用SPSS16.0统计软件在显著水平为0.05水平上进行差异分析，并采用Origin 9.0绘图.
1.1. 材料
1.1.1. 菌种
1.1.2. 固体发酵培养基
1.2. 方法
1.2.1. 菌种孢子悬浮液的配置
1.2.2. 发酵基质初始含水量的测定
1.2.3. 发酵产物木霉孢子浓度的测定
1.2.4. 木霉固体发酵条件的探索
1.3. 数据分析
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由表 1可以看出，在玉米粉、麦麸、稻壳3种不同的发酵基质中，含水量最高的是玉米粉，为14.2%，其次是麦麸，含水量为9.3%，稻壳粉含水量仅有4.2%. 3种发酵基质按1∶1比例两两混合的基质中，麦麸+玉米粉的含水量为11.7%，稻壳+玉米粉的含水量为9.1%，麦麸+稻壳粉的含水量最低，仅为6.9%. 在后续试验中基于以上结果进行相应的调整，以保障发酵基质含水量的稳定.
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本试验主要选取了6种固体发酵培养基，分别是麦麸、玉米粉、稻壳粉，以及三者分别按1∶1比例两两混合得到的混合物. 由表 2可以看出，在28 ℃恒温发酵7 d后，玉米粉处理的木霉分生孢子浓度最高，为8.00×109cfu/g；其次是稻壳粉，孢子浓度为6.86×109cfu/g；麦麸发酵效果较差，发酵1周后分生孢子浓度仅为1.2×109cfu/g. 三者两两混合发酵结果显示，玉米粉+稻壳粉可以达到最好的发酵效果，孢子浓度可达7.51×109cfu/g. 由此可以看出，3种发酵材料中，玉米粉的发酵效果最好，但在工业化过程中，成本问题是工业化最为关键的问题之一，由表 2可以看出，玉米粉的市场价格是稻壳粉的5倍，是麦麸的3倍. 产孢量仅为稻壳粉的1.2倍，是麦麸的6.7倍，综上，稻壳粉是最为理想的木霉发酵的固体基质，可作发酵培养基在工厂化条件下使用.
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固体发酵的过程中，初始接种量不仅影响发酵产物的纯度，也影响发酵的时间长短. 若接种量过少，会增加发酵时间，造成能源及空间的浪费，若接种量过大不仅会增加基质污染的风险，还会使有限的资源均用于菌丝体的生长而不利于孢子的产生. 因此适宜的接种量可以节约发酵时间，还能增加产物的稳定性，对提高产品质量有重要的作用.
由图 1A可看出，当发酵1周后，初始接种量为2%的产孢量最低，随着接种量的增加，产孢量逐渐增加，当初始接种量为8%时，产孢量达到最大；图 1B可知，当初始接种量为2%时，发酵1周后木霉分生孢子浓度仅有6.83×109 cfu/g；随着接种量的增加，产物中孢子浓度逐渐增多，在接种量为8%时，发酵产物中的木霉分生孢子含量达9.19×109 cfu/g，当接种量大于8%时，孢子浓度逐渐降低. 因此，在接种量为8%时，发酵1周的效果最佳，这与王永东等[24]的研究相一致.
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固体发酵中的含水量直接影响木霉在培养基中的生长情况，是发酵产物最关键的一项指标之一. 由图 2A可看出，当基质含水量在10%时，发酵1周后，发酵基质中只有零星的木霉孢子产生，水分含量严重地影响了木霉的生长和产孢能力. 由图 2B可知，发酵基质含水量只有10%，产孢量最低，孢子浓度为2.20×108 cfu/g，而当随着发酵基质含水量的上升，孢子产量显著上升，当基质含水量为30%时，孢子浓度可达1.02×1010cfu/g. 当发酵基质含水量增加到40%以上时，木霉孢子的产量逐渐下降. 因此，水分含量严重影响了木霉的产孢能力，由此研究可得基质含水量为30%时木霉固体发酵效果最佳.
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为确定最佳发酵温度，分别设计在32 ℃、30 ℃、28 ℃、25 ℃ 4个温度梯度下进行木霉的固体发酵. 由图 3A结果可知，温度对木霉固体发酵产物的影响十分明显，木霉固体发酵的最佳温度是28 ℃，发酵7 d后分生孢子浓度可达9.19×109 cfu/g；图 3B可以看出，虽然发酵温度越高可以促进木霉快速产孢(发酵到第3 d)，但却大大限制了木霉的产孢量，发酵7 d时，32 ℃、30 ℃的孢子浓度分别为2.80×109 cfu/g和4.03×109 cfu/g；同样发酵温度过低也不利于木霉菌丝的生长及分生孢子的形成，会增大木霉的发酵周期，25 ℃条件下发酵7 d时，木霉孢子浓度仅为2.42×109 cfu/g；而当在28 ℃条件下进行木霉的固体发酵时，在1~4 d主要是菌丝生长，第4天开始，菌落开始出现白色絮状物及分生孢子束，5~6 d时，白色逐渐变成绿色开始形成成熟的木霉孢子，直至第7 d，菌落颜色不在变化，白色菌丝消失，此时分生孢子浓度可达9.19×109 cfu/g. 因此可得出28 ℃是进行哈茨木霉TMN-1菌株固体发酵的最佳温度，适宜的发酵周期为8 d，在保证有足够的分生孢子产生的同时可以保证发酵时间最短.
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为探究外接不同碳源对产孢量的影响，本研究选取1%葡萄糖溶液、1%麦芽糖溶液、1%淀粉溶液作为外加碳源. 由图 4可知，不同外接碳源对哈茨木霉产孢量的影响从大到小顺序依次为：淀粉、麦芽糖、葡萄糖. 添加1%的葡萄糖、1%的麦芽糖对木霉孢子的产生没有显著的促进作用，而添加1%的淀粉溶液作为外接碳源时，孢子浓度为5.17×109 cfu/g，表明在固体培养基中添加淀粉作为碳源可以显著提高木霉发酵产物中分生孢子的含量. 因此在实际的发酵生产过程中，固体发酵基质中添加一定剂量的淀粉，可以有效增加发酵产物中木霉孢子的浓度.
2.1. 发酵基质含水量测定
2.2. 最佳固体发酵基质的确定
2.3. 最佳接种量的确定
2.4. 最佳含水量的确定
2.5. 最佳发酵温度
2.6. 外接不同碳源对孢子浓度的影响
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稻壳粉作为在大米生产过程中产生的副产品，具有来源丰富，价格低廉等优点，另外，稻壳生产过程中含有残留的淀粉，还有纤维素和半纤维素，在木霉的发酵过程中足够作为碳源提供给微生物生长繁殖所需，并且，稻壳本身还含有丰富的微量元素如钙、镁、铁等金属元素均是微生物生长繁殖所必须的[25-26]. 微生物在大量的生长繁殖的过程中对营养和水分的要求都很巨大，木霉是全世界分布最为广泛的微生物之一，这与其自生强大的环境适应能力及繁殖能力密不可分，木霉在快速生长的过程中会消耗大量的营养物质[24]，因此本试验在探索最适合木霉固体发酵基质的基础上还探究了不同外接营养物质对发酵产物的影响. 水分是影响微生物生长的关键因素，在发酵的过程中需要保证有足够的水分供微生物使用，但固体发酵基质水分含量也不宜太高，这会导致培养基透气性变差，影响微生物的生长和繁殖[27]. 同时，为了节省发酵时间和优化产物，进一步又探索了最适宜发酵温度及最佳的接种量. 结果表明，温度过高在一定程度上可以促进菌丝的发育，促进木霉提前产孢，但会大大地限制木霉产生分生孢子的能力. 同样，温度过低也不利于木霉的发酵，主要在于低温减缓了木霉菌丝的生长速度，延缓了产孢时间，不利于发酵的进行. 综上所述，哈茨木霉TMN-1菌株在28 ℃的条件下进行固体发酵，同时保持发酵基质初始含水量在30%~50%，接种量在8%的条件下可以达到木霉的最佳发酵效果，发酵周期为7~8 d即可完成木霉的固体发酵，发酵产物中木霉分生孢子浓度可达1×1010 cfu/g左右.
本研究采用了固体发酵技术生产的哈茨木霉菌剂，利于使用及运输，固体发酵也是生防菌大量应用的必经之路. 固体发酵有利于微生物菌剂的长时间保存，发酵基质不仅是一个载体，更重要的是在微生物使用到土壤之前为其提供了良好的生长和繁殖空间. 本研究通过探究生防菌哈茨木霉TMN-1的最佳固体发酵条件，可为木霉固体制剂的制备及木霉的商品化提供基础条件和理论依据.