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广东百香果炭疽病病原菌的分离及鉴定

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陈佩君, 杨春艳, 林泽岳, 等. 广东百香果炭疽病病原菌的分离及鉴定[J]. 植物医学, 2024, 3(5): 48-55. doi: 10.13718/j.cnki.zwyx.2024.05.006
引用本文: 陈佩君, 杨春艳, 林泽岳, 等. 广东百香果炭疽病病原菌的分离及鉴定[J]. 植物医学, 2024, 3(5): 48-55. doi: 10.13718/j.cnki.zwyx.2024.05.006
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CHEN Peijun, YANG Chunyan, LIN Zeyue, et al. Isolation and Identification of the Pathogen Causing Anthracnose in Passion Fruitin Guangdong[J]. PLANT HEALTH AND MEDICINE, 2024, 3(5): 48-55. doi: 10.13718/j.cnki.zwyx.2024.05.006
Citation: CHEN Peijun, YANG Chunyan, LIN Zeyue, et al. Isolation and Identification of the Pathogen Causing Anthracnose in Passion Fruitin Guangdong[J]. PLANT HEALTH AND MEDICINE, 2024, 3(5): 48-55. doi: 10.13718/j.cnki.zwyx.2024.05.006
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广东百香果炭疽病病原菌的分离及鉴定

  • 仲恺农业工程学院植物健康研究院/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省普通高校果蔬病虫害绿色防控重点实验室, 广州 510225

  • 基金项目: 广东省农业发展和农村工作专项资金项目(2017LM4172)
详细信息
    作者简介:

    陈佩君，助理农艺师，主要从事植物保护研究 .

    通讯作者: 韩群鑫，博士，教授

  • 中图分类号: S436

Isolation and Identification of the Pathogen Causing Anthracnose in Passion Fruitin Guangdong

  • Innovative Institute for Plant Health, Zhongkai University of Agriculture and Engineering/Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Green Prevention and Control on Fruits and Vegetables in South China, Guangzhou 510225, China

  • 摘要:

    随着我国百香果产业的发展，病虫害成为生产中不可忽视的问题.采用组织分离法，对广东省河源市和平县和广州市南沙区百香果产区采集到的炭疽病果实和枝蔓样本进行分离纯化，获得4个高频率出现的菌株.通过致病性测定，确认果实病原菌菌株ZB2-1和枝蔓病原菌菌株DGZB，二者的形态特征与巴西炭疽菌(Colletotrichum brasiliense)相似，通过构建多基因联合系统发育树，发现两个菌株与巴西炭疽菌处于同一分支，自展值为100%.结合形态学特征、致病性测定以及构建多基因序列系统发育树的方法进行病原鉴定，结果表明，在广东省河源市和平县和广州市南沙区侵染百香果果实和枝蔓的炭疽病菌主要为巴西炭疽菌.

    Abstract:

    With the development of passion fruit industry in China, diseases and pests have become the problem that cannot be ignored in the production of passion fruit. In this paper, pathogens in the anthracnose disease infected samples from Heping County, Heyuan City and Nansha District, Guangzhou City, Guangdong Province were isolated and purified by tissue separation method, and 4 high-frequency strains were obtained. Through pathogenicity testing, it was confirmed that the strain ZB2-1 and strain DGZB could infect the fruit and branch of passion fruit, respectively. The morphological characteristics of the two strains were similar to those of Colletotrichum brasiliense. By constructing a multigene combined phylogenetic tree (ITS-TUB2-ACT-CHS1-HIS3-GAPDH), it was found that the two strains were in the same branch with C. brasiliense, with a 100% bootstrap support value.The pathogen identification was carried out by combining morphological characteristics, pathogenicity and phylogenetic tree construction. The results indicated that C. brasiliense was the pathogen of anthracnose infecting passion fruits and branches in Heping County, Heyuan City and Nansha District, Guangzhou City.

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  • 图 1  百香果炭疽病田间症状

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    图 2  百香果果实回接症状

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    图 3  百香果枝蔓回接症状

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    图 4  百香果炭疽病病原菌菌落形态及显微镜形态

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    图 5  基于ITS-TUB2-ACT-CHS1-HIS3-GAPDH基因序列构建的炭疽菌系统发育树

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    表 1  PCR扩增所用的引物及序列

    基因 引物名称 序列(5′-3′)
    ITS ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
    ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
    GAPDH GDF1 GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA
    GDR1 GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT
    TUB2 T1 AACATGCGTGAGATTGTAAGT
    CYLTUB1R AGTTGTCGGGACGGAAGAG
    ACT ACT-512F ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC
    ACT-783R TACGAGTCCTGGCCCAT
    CHS1 CHS-79F TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG
    CHS-354R TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG
    HIS3 CYLH3F AGGTCCACTGGTGGCAAG
    CYLH3R AGCGATGTCCTTGGACTG
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    表 2  用于构建百香果炭疽病病原菌进化树的GeneBank登录号

    菌种 菌株号 GeneBank登录号
    ITS TUB2 ACT CHS1 HIS3 GAPDH
    Colletotrichum brasiliense CBS：128528 MH865008.1 JQ005668.1 JQ005582.1 JQ005408.1 JQ005495.1 JQ005321.1
    Colletotrichum brasiliense CBS：128501 MH864997.1 JQ005669.1 JQ005583.1 JQ005409.1 JQ005496.1 JQ005322.1
    Colletotrichum parsonsiae CBS：128525 MH865006.1 JQ005667.1 JQ005581.1 JQ005407.1 JQ005494.1 JQ005320.1
    Colletotrichum hippeastri CBS：241.78 JX010293.1 JQ005666.1 JX009485.1 JQ005406.1 JQ005493.1 JX009932.1
    Colletotrichum hippeastri CBS.125376 MH863510.1 JQ005665.1 JQ005579.1 JQ005405.1 JQ005492.1 JQ005318.1
    Colletotrichum hippeastri CBS.125377 JQ005230.1 JQ005664.1 JQ005578.1 JQ005404.1 JQ005491.1 JQ005317.1
    Colletotrichum boninense CBS.123756 MH863324.1 JQ005589.1 JQ005502.1 JQ005328.1 JQ005415.1 JQ005241.1
    Colletotrichum boninense CBS.128549 MH865016.1 JQ005590.1 JQ005504.1 JQ005330.1 JQ005417.1 JQ005243.1
    Colletotrichum boninense HJH-3 MH370508.1 MH3705501 MH370529.1 MH370522.1 MH370543.1 MH370515.1
    Colletotrichum karsti CPO 27.948 MN744282.1 MN848362.1 MN746516.1 MN746549.1 MN848389.1 MN737341.1
    Colletotrichum karsti LW1 MT274065.1 MT274067.1 MT274066.1 MT274068.1 MT274070.1 MT274069.1
    Colletotrichum karsti CPO 27.953 MN744283.1 MN848363.1 MN746517.1 MN746550.1 MN848390.1 MN737342.1
    Colletotrichum plurivorum CBS 125473 MG600717.1 MG600984.1 MG600924.1 MG600840.1 MG600886.1 MG600780.1
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-06-27
  • 刊出日期:  2024-10-25

广东百香果炭疽病病原菌的分离及鉴定

    通讯作者: 韩群鑫，博士，教授
    作者简介: 陈佩君，助理农艺师，主要从事植物保护研究
  • 仲恺农业工程学院植物健康研究院/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省普通高校果蔬病虫害绿色防控重点实验室, 广州 510225
  • 收稿日期:  2024-06-27
基金项目:  广东省农业发展和农村工作专项资金项目(2017LM4172)

摘要: 

随着我国百香果产业的发展，病虫害成为生产中不可忽视的问题.采用组织分离法，对广东省河源市和平县和广州市南沙区百香果产区采集到的炭疽病果实和枝蔓样本进行分离纯化，获得4个高频率出现的菌株.通过致病性测定，确认果实病原菌菌株ZB2-1和枝蔓病原菌菌株DGZB，二者的形态特征与巴西炭疽菌(Colletotrichum brasiliense)相似，通过构建多基因联合系统发育树，发现两个菌株与巴西炭疽菌处于同一分支，自展值为100%.结合形态学特征、致病性测定以及构建多基因序列系统发育树的方法进行病原鉴定，结果表明，在广东省河源市和平县和广州市南沙区侵染百香果果实和枝蔓的炭疽病菌主要为巴西炭疽菌.

English Abstract

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  • 开放科学(资源服务)标识码(OSID)：

  • 百香果(Passiflora spp.)又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，属于西番莲科西番莲属，原产于巴西、巴拉圭、阿根廷等国家，热带和亚热带地区均有种植. 国内百香果产地主要分布在台湾、福建、广东和广西等地区[1]. 近年来，百香果在我国多地作为扶贫产业推广，种植面积迅速增加. 广东省百香果产业最大种植区为粤西南部[2]. 广东适宜的气候，有利于百香果的种植和产业发展，除田间商业化种植外，不少农户庭院和闲置农场也种植了百香果.

    随着百香果种植面积的不断扩大，病虫害问题日益凸显，成为影响生产的关键因素之一. 其中，炭疽病作为百香果的重要病害，普遍存在于百香果果园中，对百香果的经济价值与产量构成了严重威胁. 该病害不仅会导致果实与枝蔓腐烂，严重时甚至会使整株植物枯死，极大地制约了百香果产业的健康发展. 国内外已有关于百香果炭疽病病原鉴定的研究，但不同地区鉴定出的病原种类不尽相同. 已有研究表明，百香果炭疽病可以由不同种类的炭疽病菌单独或复合侵染[3-7]. 目前，炭疽菌分类鉴定主要采用形态学与多基因分子鉴定相结合的方法[8]. Júnior等[3]认为巴西黄金百香果果实的炭疽病病原为博宁炭疽菌(Colletotrichum boninense)；Damm等[4]认为博宁炭疽菌复合种中的Colletotrichum brasiliense、Colletotrichum colombiense、Colletotrichum torulosum和Colletotrichum karstii等可引起百香果炭疽病；Du等[5]认为福建百香果果实的炭疽病病原为短孢炭疽菌(Colletotrichum brevisporum)；冉飞等[6]认为贵州百香果果实的炭疽病病原是喀斯特炭疽菌(C.karstii)；赵晓珍等[7]认为贵州百香果果实炭疽病的病原主要有巴西炭疽菌(C. brasiliense)和喀斯特炭疽菌(C. karstii)两种. 百香果炭疽病病原菌种类的多样性可能与种植地的气候和环境相关，而不同病原菌种类对同种杀菌剂的药效可能存在差异[6]. 因此，鉴定广东地区百香果炭疽病病原具有重要意义.

    采用组织分离法，并结合致病菌菌落形态、致病性和构建多基因联合系统发育树的方法对广东百香果主产区百香果炭疽病病原菌进行分离鉴定，为后期防治百香果炭疽病提供科学依据，有助于促进百香果产业的健康发展.

1.   材料与方法

    1.1.   材料

  • 百香果病果采集于广东省百香果产区. 2019年7月于河源市和平县下车镇采集炭疽病果实，2020年8月于广州市南沙区大岗镇采集炭疽病枝蔓.

    • 1.2.   培养基

  • 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和水琼脂培养基(WA).

    • 1.3.   病原菌的分离与纯化

  • 采用组织分离法，取病健交界部5 mm × 5 mm组织块，先用75% 酒精浸泡35 s，然后转移至2%次氯酸钠溶液中浸泡35 s，再用无菌水漂洗3次，放在灭菌滤纸上吸干水分. 将组织块转移至PDA培养基，28 ℃恒温培养，待组织块周围长出菌落，肉眼可见无其他杂菌，挑取菌落边缘琼脂块至WA培养基，28 ℃恒温培养. 待菌落在新的WA培养基上长出菌丝，挑取单菌丝，重复3次. 单菌丝纯化后的菌株接种到斜面PDA培养基，放入4 ℃冰箱保存.

    • 1.4.   致病性测定

  • 将分离纯化后的菌株接种在PDA培养基中培养5 d，用直径5 mm的灭菌打孔器取菌饼备用. 利用活体接种以及针刺接种的方法把带菌菌饼接种到百香果的果皮和枝蔓上. 设置对照组(CK)，对照组的菌饼为在无菌PDA培养基获取的直径为5 mm的琼脂块. 每个处理重复3次. 2~15 d后观察发病情况，并对发病组织再次进行分离纯化鉴定.

    • 1.5.   病原菌鉴定

    1.5.1.   形态学鉴定

  • 将纯化后的分离病原菌接种到新的PDA培养基，28 ℃恒温培养箱中黑暗倒置培养3 d后，记录菌落的形态、颜色、边缘和表面特征，并在显微镜下观测分离菌的分生孢子和产孢结构.

    • 1.5.2.   分子生物学鉴定

  • 根据StarSpin Fungal DNA Kit DNA提取试剂盒的操作步骤，提取致病菌总DNA，对内转录间隔区基因(Internal transcribed spacer，ITS)[9]、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)[10]、β-微管蛋白基因(β-tubulin，TUB2)[11]、肌动蛋白基因(Actin，ACT)、几丁质合成酶基因(Chitin synthase 1，CHS1)[12]、组蛋白基因H3(Histone H3，HIS3)[13]进行扩增，反应体系为2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Nuclease-Free Water 9.5 μL. ACT引物的反应条件：95 ℃预变性8 min，95 ℃变性12 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃延伸5 min. ITS、GAPDH和CHS1 3对引物的反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，退火温度分别为50 ℃、57 ℃和56 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min. TUB2和HIS3引物的反应条件：94 ℃分别预变性1 min和3 min，94 ℃分别变性60 s和30 s，退火温度为58 ℃，分别退火60 s和30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min. PCR扩增所用的引物及序列见表 1.

    委托天一辉远生物科技有限公司对待鉴定物种基因的PCR扩增产物进行测序和序列拼接，将得到的序列在NCBI数据库上进行Blast同源性比对，采用MEGA 7对所有序列进行ClustalW比对，按ITS、TUB2、ACT、CHS1、HIS3、GAPDH的顺序将各基因序列首尾拼接，采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，自举值(Bootstrap)为1 000.

2.   结果与分析

    2.1.   百香果炭疽病田间症状

  • 田间调查发现炭疽病可危害百香果的枝蔓和果实. 广州市南沙区大岗镇采集到的百香果炭疽病枝蔓在发病初期呈水渍状. 环境湿度大时，发病组织逐渐腐烂，环境湿度小时，发病组织干枯，出现病斑，病斑上出现大量小黑点，严重时全株干枯(图 1a和图 1b). 河源市和平县下车镇采集到的百香果炭疽病果实的表皮在感病初期出现水渍状小斑点，随后病斑扩大，病斑中央呈黄褐色，病斑边缘呈水渍状(图 1c).

    • 2.2.   致病菌的分离及致病性测定

  • 采用组织分离法，从感染的百香果中分离纯化得到4个菌株，分别从百香果感病果实中获得菌株ZB1和菌株ZB2-1，从百香果感病枝蔓中获得菌株DGZA和菌株DGZB. 将分离纯化后的菌株ZB2-1和DGZB分别接种到健康的果实和枝蔓上，接种部位均出现褐色病斑(图 2b、图 2c和图 3b)，分离纯化菌株ZB2-1和DGZB具有致病性，分离纯化菌株ZB1和DGZA无致病性，对照组未出现病斑(图 2a，图 3a). 对发病组织再次分离纯化，观察到菌株在PDA培养基上的菌落形态与接种菌的菌落形态一致. 因此，可以确认果实病原菌ZB2-1和枝蔓病原菌DGZB是百香果炭疽病的病原菌.

    • 2.3.   病原菌鉴定

    2.3.1.   病原菌形态特征

  • 采用组织分离法，对发病组织进行分离纯化，纯化后的菌株接种到PDA培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中，黑暗培养2~3 d，病原菌形态特征见图 4.

    由图 4可以看出，果实病原菌ZB2-1和枝蔓病原菌DGZB在PDA培养基上菌落形态一致，菌落呈圆形，菌丝绒毛状，边缘完整. 菌落初期呈白色，中后期菌落中央为橙红色. 培养3 d后，分生孢子长13.81~19.43 μm，宽5.84~7.71 μm，边缘光滑，呈圆柱形，顶端和基部圆，分生孢子内有颗粒状物质.

    • 2.3.2.   病原菌分子生物学鉴定

  • 用引物ITS-TUB2-ACT-CHS1-HIS3-GAPDH对果实病原菌菌株ZB2-1和枝蔓病原菌菌株DGZB进行PCR扩增，得到ZB2-1和DGZB的多基因序列，采用MEGA7 Neighbor Joining法构建系统发育树，结果表明，果实病原菌菌株ZB2-1和枝蔓病原菌菌株DGZB与巴西炭疽菌C. brasiliense(菌株号CBS：128528和CBS：128501)聚于同一分支(表 2)，且自展值为100%，外群菌株处在系统发育树的外围(图 5). 综合病原菌形态学特征、致病性验证和多基因鉴定，确定引起广东百香果炭疽病的病原菌为巴西炭疽菌.

3.   讨论与结论

  • 炭疽菌属(Colletotrichum)真菌是一类全球分布的植物病原真菌，寄主范围甚广. 已有研究表明，炭疽病菌可侵染油茶[14]、芒果[15]、葡萄[16]、辣椒[17]和火龙果[18]等作物，可导致植株枯萎、果实腐烂、叶片病斑等症状，造成严重的经济损失. 炭疽病原菌可通过风力作用在植物表皮伤口完成侵染. 每年6-10月是广东地区的台风季节，植物容易受到机械损伤，同时病残体的越冬菌丝体和分生孢子盘可借助风力传播侵染植物的表皮伤口，继而发生炭疽病. 本研究在广东省河源市、平县和广州市南沙区百香果果园采样，从感染的百香果果实和枝蔓中分离得到4个纯化菌株，分别为ZB1、ZB2-1、DGZA和DGZB. 菌株ZB1和DGZA分别回接在百香果果实和枝蔓后均无病征出现，表明菌株ZB1和DGZA可能是百香果的内生真菌. 菌株ZB2-1和DGZB具有致病性，这2个菌株的形态特征与巴西炭疽菌(C. brasiliense)的形态一致[4]，结合ITS-TUB2-ACT-CHS1-HIS3-GAPDH多基因构建系统发育树分析，鉴定出广东百香果炭疽病的致病菌为巴西炭疽菌(C. brasiliense)，与赵晓珍等[7]报道炭疽病果上的病原菌(C. brasiliense)相同. 本研究证明了广东地区百香果炭疽病病原菌主要是巴西炭疽菌(C. brasiliense)，同时证明了巴西炭疽菌不仅可侵染果实，降低百香果的经济价值和产量，还可以危及百香果植株的生长发育，影响百香果产业的发展.

    明确炭疽病病原菌的种类及其侵染植株部位对炭疽病的防治至关重要，这不仅有利于有效选用药剂以及对部位精准施药，还能促进百香果炭疽病的绿色防控. 在确定了广东省内引起百香果炭疽病的主要致病菌之后，还需进一步研究该菌的生物学特性，开发出适合大田生产的综合防控措施，为百香果产业的健康发展提供科学依据.

参考文献 (18)

目录

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