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Ⅰ型蓝舌病毒NS4基因的克隆及序列分析

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赵瑶, 徐栋, 马三立, 等. Ⅰ型蓝舌病毒NS4基因的克隆及序列分析[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2020, 42(9): 77-86. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.09.009
引用本文: 赵瑶, 徐栋, 马三立, 等. Ⅰ型蓝舌病毒NS4基因的克隆及序列分析[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2020, 42(9): 77-86. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.09.009
shu
Yao ZHAO, Dong XU, San-li MA, et al. Cloning and Sequence Analysis of Ⅰ Serotype Bluetongue Virus NS4 Gene[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2020, 42(9): 77-86. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.09.009
Citation: Yao ZHAO, Dong XU, San-li MA, et al. Cloning and Sequence Analysis of Ⅰ Serotype Bluetongue Virus NS4 Gene[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2020, 42(9): 77-86. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.09.009
shu

Ⅰ型蓝舌病毒NS4基因的克隆及序列分析

  • 1.

    西南大学 动物医学院, 重庆 荣昌 402460

  • 2.

    重庆市兽医科学工程研究中心, 重庆 荣昌 402460

  • 3.

    重庆市城口县职业教育中心, 重庆 城口 405900

  • 4.

    重庆市荣昌区农业技术推广站, 重庆 荣昌 402460

  • 基金项目: 中央高校基本科研业务专项基金项目(XDJK2018C059, XDJK2018C060);重庆市基础研究与前沿探索专项基金项目(cstc2018jcyjAX0615)
详细信息
    作者简介:

    赵瑶(1994-), 女, 硕士研究生, 主要从事兽医临床感染与免疫学研究 .

    通讯作者: 易华山, 讲师, 博士

  • 中图分类号: S852.65

Cloning and Sequence Analysis of Ⅰ Serotype Bluetongue Virus NS4 Gene

  • 1.

    College of Veterinary Medicine, Southwest University, Rongchang Chongqing 402460, China

  • 2.

    Chongqing Veterinary Science Engineering Research Center, Rongchang Chongqing 402460, China

  • 3.

    Chongqing ChengkouVocational Education Center, Chengkou Chongqing 405900, China

  • 4.

    Chongqing Rongchang Agricultural Technical Extension Station, Rongchang Chongqing 402460, China

  • 摘要: 为研究蓝舌病毒NS4基因分子特征, 本研究从重庆分离的蓝舌病毒(BTV-1/China/2017)感染细胞提取总RNA, 采用RT-PCR方法对蓝舌病毒(BTV-1/China/2017)NS4基因进行克隆与序列分析.结果表明:所获得的NS4基因ORF长234 bp, 编码77个氨基酸.通过DNAMAN软件分析, 表明本研究中克隆的NS4基因与BTV-8/Netherland/2008/03, BTV-4/Italy/2003, BTV-4/Israel/2010, BTV-8/Israel/2010/03, BTV-1/France/2007/18, BTV-1/France/2008/24, BTV-1/Algeria/2006/01, BTV-2/Sudan/1983/05, BTV-14/Cameroon/1982/04株相似性为100%, 与BTV-2/South Africa/ RSA vaccine strain, BTV-9/South Africa/RSA vaccine strain株及BTV-1/Libya/2007, BTV-2/Italy/2000等25株参考毒株的相似性为98.7%, 而与BTV-1/Australia/2003/01和BTV-16/Indonesia/1998相似性最低, 为90.8%;突变主要发生在5~6位、17~18位、35~36位、39~40位、53~54位、65位及73~74位.系统进化分析表明: BTV-1/China/2017株NS4基因与欧洲源BTV-4/Italy/2003, BTV-8/Netherland/2008/03, BTV-2/France/2001, BTV-15/Israel/2006, BTV-4/Israel/2010, BTV-1/France/2008/24, BTV-4/Spain/2005株聚为一类, 同BTV-4/Italy/2003株亲源关系最近.通过在线软件预测发现NS4蛋白存在2个α-螺旋区, 无跨膜区, 具有亮氨酸拉链(bZIP)典型结构; 存在典型的核定位信号并具有线粒体亚细胞定位特征.
    Abstract: In order to understand the molecular characteristics of the NS4 gene of bluetonge virus (BTV), its total RNA was extracted from the cells infected by the BTV isolated from Chongqing (BTV-1/China/2017), and the NS4 gene of this virus strain was amplified with RT-PCR. The results showed that the amplified BTV NS4 gene contained an ORF 234 bp in length and encoded 77 amino acids. Analysis with DNAMAN showed that the cloned NS4 gene shared a 100% similarity with the strains BTV-8/Netherland/2008/03, BTV-4/Italy/2003, BTV-4/Israel/2010, BTV-8/Israel/2010/03, BTV-1/France/2007/18, BTV-1/France/2008/24, BTV-1/Algeria/2006/01, BTV-2/Sudan/1983/05 and BTV-14/Cameroon/1982/04, a 98.7% similarity with BTV-2/South Africa/RSA vaccine strain, BTV-9/South Africa/RSA vaccine strain and BTV-1/Libya/2007 and BTV-2/Italy/2000 and other 21 reference strains, and a 90.8% similarity with the BTV-1/Australia/2003/01 strain and the BTV-16/Indonesia/1998 strain. The amino acid mutation sites were mainly distributed in 5-6, 17-18, 35-36, 39-40, 53-54, 65 and 73-74. Phylogenetic analysis indicated that the NS4 gene of the cloned gene and BTV-4/Italy/2003, BTV-8/Netherland/2008/03, BTV-2/France/2001, BTV-15/Israel/2006, BTV-4/Israel/2010, BTV-1/France/2008/24 and BTV-4/Spain/2005 strain isolated from European countries were located in the same evolutionary branch, which showed that they had a close phylogenetic relationship with BTV-4/Italy/2003 strain. Prediction of NS4 proteins through online software identified two alpha helixes and a typical leucine zipper (bZIP) structure, but no transmembrane region. They had a typical nuclear localization signal and the character of mitochondrial subcellular localization.
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  • 图 1  BTV NS4基因的PCR扩增产物

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    图 2  BTV NS4基因重组质粒PCR扩增

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    图 3  BTV-1/China/2017株NS4基因氨基酸同源性比对

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    图 4  BTV-1/China/2017株NS4基因的系统进化分析

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    图 5  NS4蛋白同源建模分析

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    图 6  NS4蛋白核定位信号分析

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    表 1  参考毒株种属来源及序列信息

    毒株种属来源登录号
    BTV-8/Netherland/2008/03cattleAKV61590.1
    BTV-4/Italy/2003sheepAEO19812.1
    BTV-4/Israel/2010cattleAFN58184.1
    BTV-8/Israel/2010/03ovineAFN58192.1
    BTV-1/France/2007/18sheepAFV68238.1
    BTV-1/France/2008/24cattleAFV68249.1
    BTV-1/Algeria/2006/01sheepAKV61434.1
    BTV-2/Sudan/1983/05CulicoidesAKV61514.1
    BTV-14/Cameroon/1982/04unknow lab_host=“mammalian cells”AKV61630.1
    BTV-4/France/2016/03sheepAQW44907.1
    BTV-24/Israel/2010/06ovineAFN58234.1
    BTV-10/UK/2012unknowYP_006390083.1
    BTV-9/South Africa/RSA vaccine strainAEO19728.1
    BTV-12/Israel/2011cattleAFN58206.1
    BTV-15/Israel/2012ovineAFN58212.1
    BTV-16/Israel/2017/11cattleAFN58216.1
    BTV-24/Israel/2010/01ovineAFN58232.1
    BTV-14/South Africa/1959sheepAKV61408.1
    BTV-3/Cyprus/1958/01unknown lab_host=“mammalian cellsAKV61518.1
    BTV-3/Cyprus/1943sheepAKV61520.1
    BTV-14/Russion/2011/01cattleAKV61634.1
    BTV-15/Israel/2006sheepAKV61638.1
    BTV-4/Spain/2005cattleAKV61580.1
    BTV-4/France/2003mammalian cellsAKV61538.1
    BTV-2/Italy/2000sheepAEO19836.1
    BTV-1/Libya/2007sheepAKV61460.1
    BTV-2/Italy/2000sheepAEO19848.1
    BTV-2/France/2001sheepAKV61494.1
    BTV-2/South Africa/ RSA vaccine strainAEO19764.1
    BTV-1/Tunisia/2007sheepAKV61490.1
    BTV-9/Libya/2008/08sheepAKV61614.1
    BTV-9/Libya/2008/03sheepAKV61616.1
    BTV-4/Morocco/2009/07sheepAKV61566.1
    BTV-17/Brazil/2014/73sheepAOG59226.1
    BTV-16/Israel/2001/18wsheepAKV61426.1
    BTV-16/Israel/2008/08cattleAFN58222.1
    BTV-4/Greece/1999/24sheepAKV61546.1
    BTV-4/Greece/2000/07sheepAKV61550.1
    BTV-1/France/2001/01cattleAQR59263.1
    BTV-9/Ecuador/2015/01cattleAQR59288.1
    BTV-1/Australia/2003/01cattleASW41570.1
    BTV-7/Australia/2007/6963cattleAFK91729.1
    BTV-16/Indonesia/1998unknowASW41620.1
    BTV-16/Turkey/2000/01unknowAKV61432.1
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-22
  • 刊出日期:  2020-09-20

Ⅰ型蓝舌病毒NS4基因的克隆及序列分析

    通讯作者: 易华山, 讲师, 博士
    作者简介: 赵瑶(1994-), 女, 硕士研究生, 主要从事兽医临床感染与免疫学研究
  • 1. 西南大学 动物医学院, 重庆 荣昌 402460
  • 2. 重庆市兽医科学工程研究中心, 重庆 荣昌 402460
  • 3. 重庆市城口县职业教育中心, 重庆 城口 405900
  • 4. 重庆市荣昌区农业技术推广站, 重庆 荣昌 402460
  • 收稿日期:  2019-01-22
基金项目:  中央高校基本科研业务专项基金项目(XDJK2018C059, XDJK2018C060);重庆市基础研究与前沿探索专项基金项目(cstc2018jcyjAX0615)

摘要: 为研究蓝舌病毒NS4基因分子特征, 本研究从重庆分离的蓝舌病毒(BTV-1/China/2017)感染细胞提取总RNA, 采用RT-PCR方法对蓝舌病毒(BTV-1/China/2017)NS4基因进行克隆与序列分析.结果表明:所获得的NS4基因ORF长234 bp, 编码77个氨基酸.通过DNAMAN软件分析, 表明本研究中克隆的NS4基因与BTV-8/Netherland/2008/03, BTV-4/Italy/2003, BTV-4/Israel/2010, BTV-8/Israel/2010/03, BTV-1/France/2007/18, BTV-1/France/2008/24, BTV-1/Algeria/2006/01, BTV-2/Sudan/1983/05, BTV-14/Cameroon/1982/04株相似性为100%, 与BTV-2/South Africa/ RSA vaccine strain, BTV-9/South Africa/RSA vaccine strain株及BTV-1/Libya/2007, BTV-2/Italy/2000等25株参考毒株的相似性为98.7%, 而与BTV-1/Australia/2003/01和BTV-16/Indonesia/1998相似性最低, 为90.8%;突变主要发生在5~6位、17~18位、35~36位、39~40位、53~54位、65位及73~74位.系统进化分析表明: BTV-1/China/2017株NS4基因与欧洲源BTV-4/Italy/2003, BTV-8/Netherland/2008/03, BTV-2/France/2001, BTV-15/Israel/2006, BTV-4/Israel/2010, BTV-1/France/2008/24, BTV-4/Spain/2005株聚为一类, 同BTV-4/Italy/2003株亲源关系最近.通过在线软件预测发现NS4蛋白存在2个α-螺旋区, 无跨膜区, 具有亮氨酸拉链(bZIP)典型结构; 存在典型的核定位信号并具有线粒体亚细胞定位特征.

English Abstract

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  • 蓝舌病(Bluetongue，BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的、以昆虫(库蠓)为传播媒介的反刍动物的一种非接触性传染病，其易感动物为绵羊、山羊、牛和鹿等反刍动物，是世界动物卫生组织(OIE)划定为A类、我国列为一类的动物重要疫病[1]. BTV隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus). BTV粒子呈二十面体对称，圆形，成熟的病毒粒子无囊膜，由7种结构蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4，VP5，VP6，VP7)和5种非结构蛋白(NS1，NS2，NS3，NS3A，NS4)组成[2]. BTV外层衣壳主要由VP2和VP5组成，VP2通过与宿主细胞表面的糖蛋白结合，通过网格蛋白介导的细胞内吞机制进入牛羊等宿主细胞内，VP5蛋白构象在胞内酸性环境下发生变化与内吞体膜融合，使BTV脱去外层衣壳蛋白VP2和VP5，开始病毒基因的转录[3-4].由VP1，VP3和VP7及dsRNA组成的核心粒子在VP1蛋白作用下转录得到10个基因组片段的正链RNA，VP4将mRNA分子加帽；病毒mRNA作为合成病毒蛋白的模板在宿主细胞核糖体中翻译成7种结构蛋白(VP1~VP7)和5种非结构蛋白(NS1，NS2，NS3，NS3a，NS4)[3]. NS1蛋白促进BTV ssRNA翻译、调节病毒蛋白合成和影响病毒体dsRNA的组装过程[5-6]. NS2蛋白作为病毒包涵体(viral inclusion bodies，VIBs)的主要组成成分，参与病毒核心粒子的组装[2]. BTV核心粒子组装完成，会从VIB上释放，VP2和VP5组装至病毒核心粒子使其成为完整的病毒粒子，通过NS3蛋白和NS3A蛋白的共同作用进行新一轮的病毒传播[2, 7-10]. NS4基因编码77~79个氨基酸，高度保守的N端富含碱性氨基酸，C端有亮氨酸拉链结构的新型非结构蛋白.研究发现，NS4蛋白在IFN-α/β受体缺陷(IFNAR-/-)的小鼠中表达量低，在一定剂量干扰素(Interferon，IFN)处理的细胞中有利于BTV的复制，是细胞内干扰素信号通路的拮抗剂[11-12].本研究对重庆地区分离的蓝舌病毒BTV-1/China/2017 NS4基因进行了克隆和序列分析，为进一步研究蓝舌病毒NS4基因的功能奠定基础，为深入研究BTV复制和致病机制提供资料.

1.   材料与方法

    1.1.   实验材料

    1.1.1.   主要材料

  • 重庆地区分离的Ⅰ型蓝舌病毒(命名为BTV-1/China/2017)感染的细胞，由西南大学动物科学学院李前勇博士提供.

    • 1.1.2.   主要试剂

  • pGEM-T easy载体，RNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司，DNA片段纯化试剂盒、AMV反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂、DNA Marker、X-gal和T4 DNA连接酶、以及rTaq DNA聚合酶等均购自宝生物(大连)工程有限公司. B型质粒小量快速提取试剂盒购自Axygen公司.

    • 1.1.3.   引物设计

  • 参照GenBank收录的BTV NS4基因序列(AFV68249.1)设计并合成引物NS4 F和NS4 R，用于扩增从ATG到TAA一个完整阅读框的BTV NS4基因.引物NS4 F：5′-ATGGTGAGGGGACACAACAGA-3′，NS4 R：5′-CTACCCATCCTCCTCTGCTCG-3′.以上引物由北京华大生物有限公司合成.

    • 1.2.   方法

    1.2.1.   材料处理及组织RNA的提取

  • 取出液氮中保存的蓝舌病毒感染的细胞及细胞液，加入1 mL Triol，在涡旋器上充分震荡混匀，按照RNeasy Mini Kit操作说明从细胞组织中提取总RNA.

    • 1.2.2.   RT-PCR

  • 按照RNeasyR Mini Kit Handbook说明书提取蓝舌病毒感染的细胞及细胞液总RNA，以Oligd T及试剂盒随机引物，用反转录酶M-MLV按照试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增. PCR反应条件：94 ℃ 5 min，1个循环；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃再延伸5 min. RT-PCR产物于0.01 g/mL的琼脂糖凝胶中电泳后，按Axygen quick Gel Extraction Kit说明书进行纯化并将纯化产物与PGEM-Teasy连接，连接产物转化Trans-T1感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，按质粒小量快速提取试剂盒提取质粒，进行PCR鉴定.

    • 1.2.3.   目的基因氨基酸序列比对与生物信息学分析

  • 将鉴定正确的重组质粒送北京华大生物工程公司测序，利用Blast在NCBI网站进行序列相似性比对分析；利用在线ExPASy和TMpred进行蛋白理化性质及跨膜结构域预测http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白的跨膜区.应用Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)软件进行蛋白二级结构预测；利用Phyre 2软件(http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1)进行蛋白同源建模.利用cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)及TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)软件预测蛋白核定位信号及亚细胞定位特征.多序列比对运用Clustal W和Muscle.exe软件进行，再用MEGA 5.0软件中的Boot-strapped Neighbor-Joining绘制BTV NS4基因系统进化树，44株参考毒株信息见表 1.

2.   结果

    2.1.   病毒NS4基因RT-PCR结果

  • 病毒NS4基因扩增PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示大约在250 bp处有特异性条带，与预期的扩增结果一致(图 1).

    • 2.2.   重组质粒PCR鉴定

  • 以阳性克隆的重组质粒为模板进行NS4基因PCR扩增，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示大约在250 bp处有特异性条带，表明重组质粒中含有目的基因片段(图 2).

    • 2.3.   测序及序列分析结果

    2.3.1.   基因序列测定结果

  • 序列测定由华大基因测序完成，结果表明分离株NS4基因长度为234 bp，编码77个氨基酸.

    • 2.3.2.   基因核苷酸和氨基酸序列分析

  • BTV-1/China/2017株NS4基因核苷酸和氨基酸与BTV-8/Netherland/2008/03，BTV-4/Italy/2003，BTV-4/Israel/2010，BTV-8/Israel/2010/03，BTV-1/France/2007/18，BTV-1/France/2008/24，BTV-1/Algeria/2006/01，BTV-2/Sudan/1983/05，BTV-14/Cameroon/1982/04株同源性均为100%.与BTV-4/France/2016/03，BTV-24/Israel/2010/06，BTV-10/UK/2012，BTV-9/South Africa/RSA vaccine strain，BTV-12/Israel/2011，BTV-15/Israel/2012，BTV-16/Israel/2017/11，BTV-24/Israel/2010/01，BTV-14/South Africa/1959，BTV-3/Cyprus/1958/01，BTV-3/Cy prus/1943，BTV-14/Russion/2011/01，BTV-15/Israel/2006，BTV-4/Spain/2005，BTV-4/France/2003，BTV-2/Italy/2000，BTV-1/Libya/2007，BTV-2/Italy/2000，BTV-2/France/2001，BTV-2/South Africa/ RSA vaccine strain，BTV-1/Tunisia/2007，BTV-9/Libya/2008/08，BTV-9/Libya/2008/03，BTV-4/Morocco/2009/07，BTV-17/Brazil/2014/73毒株的氨基酸相似性高达98.7%；与BTV-16/Israel/2001/18w，BTV-16/Israel/2008/08，BTV-4/Greece/1999/24，BTV-4/Greece/2000/07毒株的氨基酸相似性为97.4%；与BTV-1/France/2001/01，BTV-9/Ecuador/2015/01毒株的氨基酸相似性为96.1%；与BTV-16/Turkey/2000/01毒株的氨基酸相似性为93.4%；与BTV-7/Australia/2007/6963毒株的氨基酸相似性为92.1%；与BTV-1/Australia/2003/01和BTV-16/Indonesia/1998毒株的氨基酸相似性为90.8%. NS4蛋白氨基酸序列同44株参考毒株间的突变主要发生在5~6位、17~18位、35~36位、39~40位、53~54位、65位及73~74位，其中BTV-1/Australia/2003/01等4个毒株在5-6位(RS→HN)发生了突变；BTV-10/UK/2012等19个毒株在第6位(S→N)发生了突变(图 3).

    • 2.3.3.   基因系统进化分析

  • 运用MEGA 5.0软件对BTV-1/China/2017株NS4基因序列与GenBank中检索的44株相似序列进行系统进化树分析，发现BTV-1/China/2017株与欧洲源BTV-4/Italy/2003，BTV-8/Netherland/2008/03，BTV-2/France/2001，BTV-15/Israel/2006，BTV-4/Israel/2010，BTV-1/France/2008/24，BTV-4/Spain/2005株聚为一类，同BTV-4/Italy/2003株亲源关系最近(图 4).

    • 2.3.4.   BTV NS4蛋白二级结构及跨膜区

  • 通过Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)软件预测NS4蛋白氨基酸残基2个α-螺旋区，在6~70位及72~75位存在α-螺旋区；应用https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan在线预测发现NS4蛋白9~11位(TGK)存在蛋白激酶C磷酸化位点，在27~52位(KAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLED)存在泛素结构域，在55~58位(TLSD)存在酪蛋白激酶∏磷酸化位点.利用TMHMM对BTV NS4跨膜区进行预测，结果显示BTV NS4蛋白无跨膜区、膜内区和膜外区.

    • 2.3.5.   NS4蛋白同源建模与核定位信号分析

  • 应用Phyre 2软件预测发现BTV NS4蛋白与模型2e42.1.C序列相似性为35.42%. QMEAN为-6.03，Cβ为2.17，具有亮氨酸拉链(bZIP)的典型结构特征(图 5). cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)预测核定位信号，发现在N端12~24位(RKRAAKRLKMQMW)存在一个核定位信号，在11~43位(RRKRAAKRLKMQMWIDAYILQWDLDQAQKDLEN)存在两个核定位信号区(图 6). TargetP 1.1 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)预测发现NS4蛋白亚细胞定位特征，发现具有mitochondrial targeting peptide (mTP)和secretory pathway signal peptide (SP). SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测无分泌蛋白信号肽及其剪切位点，发现NS4蛋白无信号肽剪切位点.

3.   分析与讨论

  • 近年来，蓝舌病毒广泛分布于亚洲、欧洲、非洲、北美洲、南美洲、大洋洲热带、亚热带及温带地区，已构成名副其实的世界性虫媒传染病[1].我国于1979年在云南省师宗县首次发现BTV，已经鉴定出BTV-1，BTV-2，BTV-3，BTV-4，BTV-12，BTV-15，BTV-16等14种不同的血清型，其中BTV-1和BTV-16是中国BTV主要的血清型[13-17]. BTV编码的5种非结构蛋白(NS1，NS2，NS3/NS3A，NS4)参与调节病毒基因组的复制和转录、病毒形态的生成、辅助病毒粒子的释放及抗干扰素应答等过程，是BTV重要的功能蛋白[2].本研究中分离株BTV-1/China/2017 NS4基因在不同血清型毒株之间变异较小，通过与44株参考毒株的序列比对分析，发现仅在5~6位、17~18位、35~36位、39~40位、53~54位、65位及73~74位存在变异，其中19株参考毒株在第6位(S→N)发生突变，这一位点突变对NS4基因功能的影响目前仍不清楚. BTV-1/China/2017 NS4基因在进化上同欧洲源BTV-4/Italy/2003，BTV-8/Netherland/2008/03，BTV-2/France/2001，BTV-15/Israel/2006，BTV-4/Israel/2010，BTV-1/France/2008/24，BTV-4/Spain/2005株关系密切且氨基酸相似性为100%，与其他25株参考毒株的氨基酸相似性高达98.7%，由此可见BTV NS4基因核苷酸及氨基酸序列相对保守，可能在病毒的感染中具有重要作用.

    同源建模结果发现NS4蛋白具有亮氨酸拉链结构(bZIP)类似于转录因子C/EBP β，即CCAT增强子结合蛋白[18]. bZIP结构由60~80个氨基酸组成α-螺旋结构，一般由碱性区和拉链区组成，N端的碱性区与特异DNA结合，参与寡聚作用的亮氨酸拉链区与碱性区紧密相连，如转录调控蛋白Fos，Jun和mye蛋白等均含有bZIP结构，统称为碱性亮氨酸拉链家族蛋白[18-19].同时，NS4蛋白在亮氨酸拉链区域存在泛素结构域及酪蛋白激酶∏磷酸化位点，由此推测NS4蛋白可能为BTV病毒转录调控蛋白，但其是否直接与细胞DNA结合，调控宿主细胞下游基因或与其他转录因子相互作用调控基因的表达还需进一步研究.最新的研究也表明，BTV NS4蛋白可能与JAK1/TYK2相结合，抑制了感染细胞中IFN-α/β的产生而逃避宿主天然免疫应答，从而实现拮抗干扰素介导的天然免疫，逃脱宿主的天然免疫应答[12]. bZIP蛋白是真核生物的转录因子和阻碍蛋白中最大且最为保守的家族之一，在哺乳动物中具有抑制或者促进基因翻译的作用[20]，NS4蛋白中bZIP结构详细的分子调控机制有待进一步研究.

    研究表明，流感病毒NP蛋白、NS1蛋白通过核浆穿梭充当运输载体，进行信号传递而行使特定的生物学功能[21-22].本研究中NS4序列特征碱性区域具有核定位信号(NLS)，同时具有线粒体亚细胞定位特征，吕爽等[23]研究也发现在NS4蛋白第二个α-螺旋区域还存在核输出信号(NES)，由此推测BTV NS4蛋白可能具有核—胞浆穿梭功能，因此BTV NS4基因NLS的鉴定及其入核调控机制在核—胞浆穿梭过程中扮演的重要作用需进一步研究.总之，NS4基因的发现及其功能研究将补充BTV病毒复制、致病机理及拮抗宿主细胞IFN免疫应答机制，给新型抗病毒药物的研发提供新的靶标和思路.

参考文献 (23)

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