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基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测烟草靶斑病发病菌量

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李凤巍, 裴悦宏, 张晓枫, 等. 基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测烟草靶斑病发病菌量[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2023, 45(11): 96-105. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.11.010
引用本文: 李凤巍, 裴悦宏, 张晓枫, 等. 基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测烟草靶斑病发病菌量[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2023, 45(11): 96-105. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.11.010
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LI Fengwei, PEI Yuehong, ZHANG Xiaofeng, et al. Using SYBR Green Ⅰ Real-Time Quantitative PCR System for Detection of Rhizoctonia solani[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2023, 45(11): 96-105. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.11.010
Citation: LI Fengwei, PEI Yuehong, ZHANG Xiaofeng, et al. Using SYBR Green Ⅰ Real-Time Quantitative PCR System for Detection of Rhizoctonia solani[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2023, 45(11): 96-105. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2023.11.010
shu

基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测烟草靶斑病发病菌量

  • 1.

    西南大学 植物保护学院，重庆 400715

  • 2.

    中国烟草总公司重庆市公司烟叶分公司，重庆 400020

  • 3.

    中国烟草总公司重庆市公司石柱分公司，重庆 409100

  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31870147)；中国烟草总公司重庆市公司科技项目(B20212NY2312，B20221NY1307，B20211-NY1315)；广西中烟工业有限责任公司项目(2021450000340029)
详细信息
    作者简介:

    李凤巍，硕士研究生，主要从事植物病理学研究 .

    通讯作者: 冉茂，硕士；孙现超，博士，研究员，博士研究生导师; 

  • 中图分类号: S432.4+4

Using SYBR Green Ⅰ Real-Time Quantitative PCR System for Detection of Rhizoctonia solani

  • 1.

    College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 2.

    Tobacco leaf Branch of Chongqing Company of China National Tobacco Corporation, Chongqing 400020, China

  • 3.

    Shizhu Branch of Chongqing Company of China National Tobacco Corporation, Chongqing 409100, China

  • 摘要:

    本研究根据烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)与烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、烟草棒孢霉叶斑病菌(Corynespora cassiicola)等田间常见烟草叶部病害病原菌的rDNA-ITS(ribosomal DNA Internal Transcribed Spacers，rDNA-ITS)序列差异位点，设计一对特异性检测引物RSW1F/RSW2R，建立烟草靶斑病菌实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)快速准确检测体系，并分析烟草靶斑病最低发病菌量. 结果表明，设计的引物特异性良好，灵敏度达到1×10-3 ng/μL. 利用已获得的实时荧光定量PCR体系计算得出引起烟草靶斑病发病的最低菌量为12.03 pg/μL. 此外，对重庆龚滩地区烟叶中烟草靶斑病菌含量进行计算，发现土壤以及周边杂草可能为该地区烟草靶斑病菌的侵染来源，并进一步确定该地区预防烟草靶斑病的最佳时期为5月15日至6月15日，为烟草靶斑病菌的田间预警预报及流行提供理论依据.

    Abstract:

    In this study, a pair of specific primers RSW1F/RSW2R were designed according to the sequence differences of rDNA-ITS of common tobacco leaf disease pathogens in the field such as Rhizoctonia solani, Alternaria alternata and Corynespora cassiicola. Based on this, a real-time fluorescence quantitative PCR detection system were further developed for the rapid detection of R. solani and analysis of minimum pathogen content to cause tobacco target spot. The results demonstrated that the primers were designed with good specificity and sensitivity of 1×10-3 ng/μL. Using the developed real-time quantitative PCR system, the minimum content of R. solani DNA resulting tobacco target spot was 12.03 pg/μL. Furthermore, the content of R. solani in tobacco leaves in Gongtan area of Chongqing was calculated. The soil and surrounding weeds were found to be the possible sources of pathogens of tobacco target spot in this area. And the best prevention time of tobacco target spot was determined to be from May 15 to June 15, which provided a theoretical basis for the field early warning, forecast and epidemic occurrence of tobacco target spot.

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  • 图 1  烟草靶斑病菌菌饼接种示意图

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    图 2  烟草靶斑病菌引物特异性检测结果

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    图 3  靶斑病特异性引物RSW1F/RSW2R灵敏度检测结果

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    图 4  引物RSW1F/RSW2R的实时荧光定量PCR检测结果

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    图 5  K326叶片接种烟草靶斑病菌菌饼不同时间靶斑病菌含量检测

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    图 6  重庆龚滩烟区土壤样品和发病烟株叶片样品中靶斑病菌含量检测结果

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出版历程
  • 收稿日期:  2023-03-20
  • 刊出日期:  2023-11-20

基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测烟草靶斑病发病菌量

    通讯作者: 冉茂，硕士；孙现超，博士，研究员，博士研究生导师; 
    作者简介: 李凤巍，硕士研究生，主要从事植物病理学研究
  • 1. 西南大学 植物保护学院，重庆 400715
  • 2. 中国烟草总公司重庆市公司烟叶分公司，重庆 400020
  • 3. 中国烟草总公司重庆市公司石柱分公司，重庆 409100
  • 收稿日期:  2023-03-20
基金项目:  国家自然科学基金项目(31870147)；中国烟草总公司重庆市公司科技项目(B20212NY2312，B20221NY1307，B20211-NY1315)；广西中烟工业有限责任公司项目(2021450000340029)

摘要: 

本研究根据烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)与烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、烟草棒孢霉叶斑病菌(Corynespora cassiicola)等田间常见烟草叶部病害病原菌的rDNA-ITS(ribosomal DNA Internal Transcribed Spacers，rDNA-ITS)序列差异位点，设计一对特异性检测引物RSW1F/RSW2R，建立烟草靶斑病菌实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)快速准确检测体系，并分析烟草靶斑病最低发病菌量. 结果表明，设计的引物特异性良好，灵敏度达到1×10-3 ng/μL. 利用已获得的实时荧光定量PCR体系计算得出引起烟草靶斑病发病的最低菌量为12.03 pg/μL. 此外，对重庆龚滩地区烟叶中烟草靶斑病菌含量进行计算，发现土壤以及周边杂草可能为该地区烟草靶斑病菌的侵染来源，并进一步确定该地区预防烟草靶斑病的最佳时期为5月15日至6月15日，为烟草靶斑病菌的田间预警预报及流行提供理论依据.

English Abstract

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  • 开放科学(资源服务)标识码(OSID)：

  • 烟草作为我国重要的经济作物，其产品质量受到生物与非生物胁迫等多方面的影响[1-3]. 烟草叶部病害往往是直接危害烟叶产量和质量最主要的因素之一，常见的烟草叶部真菌、病毒、细菌类病害主要有烟草赤星病[4]、烟草病毒病[5]、烟草野火病[6]和烟草角斑病[7]等，这些病害的发生往往会给烟草行业带来不可估量的经济损失. 随着对几种常见烟草叶部病害重视的加强以及研究的深入，已经筛选出有效的防治手段及综合防控措施[8-10]，并且相关的病害发生预测模型[11-13]也基本建立起来. 比如，袁守超[14]建立了烟草赤星病、野火病及角斑病等3种病害的预测模型，并推测出其发病规律与流行趋势，进一步分析出防治指标.

    烟草靶斑病自2005年在我国辽宁丹东地区首次发现发生以来[15]，在东北烟区大面积发病，随后迅速扩散至全国各地. 近5年来，云南[16]、湖南[17]、四川[18]、贵州[19]等多个西南地区的烟区均有报道烟草靶斑病的发生. 烟草靶斑病发病时，烟草叶片形成不规则病斑，一般形成同心轮纹，坏死部分易脱落形成穿孔[20]，通常在田间相对湿度较大时容易大规模发生[21-22]，导致对其防治比较困难. 目前对于烟草靶斑病比较有效的防治措施主要为化学防治，田亮等[23]通过比较不同药剂对烟草靶斑病的防控效果，筛选出80%波尔多液+38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺对烟草靶斑病防治效果较好，且药效持续时间长. 吴元华[24]在11种化学杀菌剂和9种生物杀菌剂中筛选出咯菌腈和丁子香酚对烟草靶斑病菌抑制作用最强. 同时，最近也有研究表明0.3%四霉素对烟草靶斑病菌的抑制效果较好，其抑制中浓度EC50达到0.04 mg/L[25]. 在生物防治方面，目前对于烟草靶斑病的防治方法报道较少，莽春霞[26]、尹秀娟等[27]筛选出一种对烟草靶斑病菌具有抑制作用的生防菌灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，其抑菌圈直径为14 mm，抑菌率达到90.88%. 近几年，也有研究发现链霉菌KX852460 (Streptomyces strain)[28]、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)[29]等生防菌对烟草靶斑病病原菌(Rhizoctonia solani)具有显著的拮抗作用. 但是，目前国内外对于烟草靶斑病还没有有效的防治方法，也没有建立相关预测模型和形成完整的绿色防控体系. 因此，十分有必要建立更快、更准确及时的烟草靶斑病检测体系，从而更有效地防治烟草靶斑病的发生，也更利于贯彻“预防为主，绿色防控”的方针.

    实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)相比于普通PCR具有更高的灵敏性及特异性的特点[30]，基于这些优点，近年来，越来越多应用RT-qPCR技术体系快速检测植物病原菌的报道[31]. 例如，刘美等[32]建立SYBR Green Ⅰ染料的实时荧光定量PCR技术用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒. 谢中玉等[33]根据链格孢属ITS基因序列差异位点，设计特异性引物，并构建了基于SYBR Green Ⅰ烟草赤星病菌实时荧光定量PCR快速定量检测方法. 目前，已有研究报道了基于Taqman探针的实时荧光定量PCR体系用于检测烟草靶斑病菌[34]，但该方法存在检测成本较高，不适用于烟草田间大规模病害发生的检测等缺点. 而基于SYBR Green Ⅰ的实时荧光定量PCR技术成本相对较低，并且可以实现更快、更精确的定量. 因此，本研究针对烟草靶斑病菌建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测体系，并确定了烟草靶斑病最低发病菌量，对烟草靶斑病的快速检测、提前防治以及降低经济损失具有重要意义，为田间烟草靶斑病的有效检测和及时防治提供有效依据.

1.   材料与方法

    1.1.   材料

    1.1.1.   供试菌株

  • 供试病原菌：烟草靶斑病病原菌(Rhizoctonia solani AG-3)YC-9由沈阳农业大学吴元华教授馈赠，烟草赤星病病原菌(Alternaria alternata)PZh4和烟草棒孢霉叶斑病病原菌(Corynespora cassiicola) 3-2由西南大学植物保护学院植物免疫与病害生态防控研究室保存.

    • 1.1.2.   试剂与引物

  • 十六烷基三甲基溴化铵(2×CTAB)，V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1；异丙醇、实时荧光定量SYBRPrime qPCR购自重庆葆光生物技术有限公司；Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit和DN45-FastBeat土壤基因组DNA提取试剂盒(珠磨法)购自北京艾德莱生物科技有限公司；2×Taq Master Mix(Cat. No. ∶E005-01)购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；DNA回收试剂盒Universal DNA Purification Kit和质粒DNA提取试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司；引物合成和测序均由北京擎科生物科技有限公司完成.

    • 1.1.3.   仪器

  • Q5000超微量核酸蛋白测定仪(美国QUAWELL公司)；RePure-A基因扩增仪(杭州柏恒科技有限公司)；CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统(百乐科技有限公司)；DYY-12型电泳仪(北京六一仪器厂)；凝胶电泳成像仪(基因有限公司).

    • 1.2.   方法

    1.2.1.   样品DNA提取

  • 供试菌株及烟草叶片总DNA的提取：采用CTAB法提取供试菌株及烟草叶片总DNA，根据韦学锋等[35]的方法稍做改动. ①取0.1 g叶片样品在液氮中快速研磨成粉状，加入1 mL 65 ℃预热好的CTAB置于65 ℃水浴裂解45~60 min，每10 min混匀一次，于4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min；②吸取上清液700~800 μL，在上清液中加入等体积的酚∶氯仿∶异丙醇(25∶24∶1)混合液充分颠倒混匀后于4 ℃条件下12 000 r/min离心10~15 min，重复操作两次. ③取上清液500~600 μL，加入等体积的-20 ℃预冷的异丙醇，于-20 ℃放置2 h左右；④于4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，弃上清，将剩余液体吸干，管底的沉淀物用75%的乙醇充分洗涤两次后弃上清，放置3~5 min待乙醇挥发后，加入60 μL ddH2O溶解沉淀. 提取的DNA用Q5000超微量核酸蛋白测定仪检测DNA浓度，并置于-20 ℃冰箱中保存备用.

    土壤样品DNA的提取：采用DN45-FastBeat土壤基因组DNA提取试剂盒(珠磨法)提取土壤样品DNA，提取过程严格按照试剂盒说明书(http://aidlab.cn/up_product/big/2018-2-13-98845451.pdf)操作.

    • 1.2.2.   特异性引物设计

  • 利用DNAMAN Version 9软件对供试菌株R. solani AG-3的DNA测序结果与NCBI GenBank中的烟草赤星病菌(A. alternata)和烟草棒孢霉叶斑病菌(C. cassiicola)的rDNA-ITS基因序列进行比对，根据3种病原菌不同的ITS序列差异，利用Primer3web version 4.1.0(https://bioinfo.ut.ee/primer3/)设计引物共3对，其中获得一对具有特异性的引物RSW1-F(5′-TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGG-3′)和RSW2-R(5′-CAAGGAATACCAAGGAGCGCAAG-3′).

    • 1.2.3.   普通PCR引物特异性检测及灵敏度检测

  • 将提取的供试菌株R.solani AG-3的DNA经超微量核酸蛋白测定仪检测浓度，并按10倍梯度用ddH2O依次稀释为100，10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6 ng/μL，使用特异引物RSW1F/RSW2R进行常规PCR扩增，50 μL常规PCR体系按推荐的反应体系进行(https://www.novoprotein.com.cn/group1/M00/00/04/rBKQbGLszNiAI1DyAARWBqaNWR4981.pdf)，以双蒸水作为阴性对照，测定特异引物灵敏度.

    • 1.2.4.   PCR扩增产物的克隆和序列测定

  • 以1.2.1中提的烟草靶斑病菌基因组DNA为模板，用设计的烟草靶斑病菌特异性引物RSW1F/RSW2R进行常规PCR扩增，得到276 bp左右的PCR产物. 将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳后胶回收，将回收片段连接到pTOPO-Blunt Simple载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性菌落37 ℃过夜培养，菌检后将含有目的DNA片段的菌液送至北京擎科生物科技有限公司进行测序.

    • 1.2.5.   标准曲线的建立

  • 提取含有目的DNA片段的大肠杆菌标准质粒，以10倍梯度稀释后的标准质粒作为扩增模板，采用SYBR qPCR Master Mix推荐的反应体系(http://cloud.bgbiotech.com/#s/78DlXioQ)进行RT-qPCR扩增. 以拷贝数的对数(lg Ct)为横坐标，循环阈值(Ct)为纵坐标制作标准曲线. 根据标准曲线所得数据分析拷贝数与Ct值之间的关系，并建立数学模型，检验相关性.

    • 1.2.6.   重庆龚滩烟区土壤及发病烟株叶片中靶斑病菌RT-qPCR检测

  • 重庆龚滩地区土壤采样：对重庆龚滩烟区土壤样品进行取样，每个地区设置3个取样点. 3个取样点分散在不同的地块上并各取3个处理，每个处理取烟草根基周边土壤.

    发病烟株叶片采样：龚滩烟区每个地区设置3个取样点. 3个取样点分散在不同的地块上并各取3个处理，采集田间发病烟株中下部叶.

    RT-qPCR检测：按照1.2.1的方法提取烟草叶片样品总DNA并进行荧光定量PCR检测，反应体系与1.2.5相同.

    • 1.2.7.   利用RT-qPCR体系检测烟草靶斑病最低发病菌量

  • 靶斑病菌接种：采用菌饼接种法(图 1). 试验采用K326烟草叶片进行接种，用针均匀刺伤烟草叶片，造成伤口，然后将活化15 d左右的直径为1 cm2的靶斑菌菌饼接种在烟草叶片上，以同等大小的水琼脂培养基接种健康烟草叶片为对照，设置3个生物学重复，接种后密封放置于室温26 ℃观察. 从0 h开始每间隔24 h取一次样，取两个接种菌饼之间的叶片样品0.1 g，同时观察接种处发病情况并拍照记录. RT-qPCR检测方法同1.2.6.

    • 1.2.8.   数据分析

  • 使用SPSS 26统计软件对试验数据进行统计分析，采用Duncan's新复极差法进行差异显著性检验. 使用Microsoft excel 2016软件进行标准曲线绘制.

2.   结果与分析

    2.1.   普通PCR引物特异性和灵敏度的检测

  • 通过普通PCR技术检测引物的特异性. PCR产物电泳结果显示，引物RSW1F/RSW2R可以检测出烟草靶斑病菌，并且烟草棒孢霉叶斑病菌、烟草赤星病菌没有扩增出条带，说明该引物特异性较好. 测序结果表明该引物可以扩增出大小为276 bp的特异性条带(图 2). 扩增序列：TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGGAATTTATTTGTTATTTTTTGTAATAAAATAATAATAAGTCATTGAACCCTTCTGTCTACTCAACTTATATAAACTCAATTTATTTTAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTCATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTG. 进一步对不同浓度的烟草靶斑病菌R. solani AG-3的DNA进行普通PCR扩增，电泳结果显示，该引物最低能够检测到浓度为1×10-1 ng/μL的靶斑病病原菌DNA(图 3).

    • 2.2.   RT-qPCR标准曲线的建立

  • 将1.2.5中所得标准质粒按10倍梯度稀释为6个浓度，每个梯度设置8个重复进行实时荧光定量PCR扩增，计算每个梯度的Ct均值，绘制标准曲线. 结果显示，实时荧光定量PCR能够检测到浓度最低为1×10-3 ng/μL的标准质粒，为常规PCR灵敏度的100倍(图 4a). 此外，溶解曲线图可以看出熔解曲线呈单一熔解峰，并且熔点温度趋于一致，约为82.1 ℃，表明扩增产物比较单一，引物的特异性较好并且无明显的引物二聚体生成(图 4b). 由扩增曲线可以看出计算得到标准曲线y=-3.557 4x+27.74，相关系数R2为0.995 4(图 4c)，由扩增效率计算公式(E=10-1/k-1)计算出扩增效率E约为91.03%，趋近于1，表明所得标准曲线符合要求.

    • 2.3.   RT-qPCR体系检测烟草靶斑病最低发病菌量的检测

  • 通过实时荧光定量PCR检测接种烟草靶斑病菌菌饼24 h，48 h，72 h，96 h和120 h后两个接种菌饼之间叶片样品的靶斑病菌含量，实时荧光定量结果显示接种后5个不同时间点的Ct值分别为20.76，20.65，20.34，17.61，15.33，对照健康叶片无Ct值，将各处理Ct值代入标准曲线计算靶斑病菌的相对含量，得出其烟草靶斑病菌含量分别为9.16 pg/μL，9.84 pg/μL，12.03 pg/μL，70.40 pg/μL和307.97 pg/μL. 由图 5可以看出，24~72 h含菌量变化较小，没有显著性差异，接种处无明显病斑出现. 而第96 h与第24~72 h相比，靶斑病菌含量显著上升，并且伴随着较大病斑的出现. 说明在72 h时，即Ct值为20.34，靶斑病菌含量为12.03 pg/μL时，达到烟草靶斑病的最低发病菌量.

    • 2.4.   重庆龚滩烟区土壤和发病烟株叶片中靶斑病菌含量检测分析

  • 使用设计的特异性引物对重庆龚滩烟区土壤样品DNA以及5~7月发病烟株的叶片样品DNA进行RT-qPCR检测其靶斑病菌含量. 实时荧光定量结果显示，5月15日、5月30日、6月15日龚滩烟区土壤RT-qPCR的扩增Ct值分别为25.14，24.12和23.91，代入2.2所得标准曲线计算出其烟草靶斑病菌含量分别为0.54 pg/μL，1.04 pg/μL和1.19 pg/μL(图 6). 本研究发现重庆龚滩烟区土壤中的靶斑病菌含量随时间推移升高，一定程度上可以推测该地区的靶斑病菌可能通过土壤传播到烟株上，但具体证据需进一步的试验验证，但可说明需加强对该地区土壤的消毒杀菌，以降低土壤中烟草靶斑病菌含量. 5月15日杂草以及6月15日、6月30日、7月30日龚滩烟区发病烟株叶片RT-qPCR的扩增Ct值分别为23.95，19.11，17.40和22.29，其烟草靶斑病菌含量分别为1.16 pg/μL，26.66 pg/μL，80.65 pg/μL和3.40 pg/μL(图 6b). 根据2.2中的标准曲线，计算得出各时期龚滩烟区土壤样品、发病叶片样品中靶斑病菌含量，发现杂草中烟草靶斑病菌的含量较高，说明应当及时清除烟田周边杂草，以阻断烟草靶斑病菌从烟田周边杂草传入烟叶的可能. 同时，结合2.3中已知的烟草靶斑病最低发病菌量的Ct值(20.34)，龚滩烟区烟叶6月15日的烟草靶斑病菌含量接近临界发病菌Ct值，说明应该在此之前对烟草靶斑病进行预防，以避免其进一步侵染为害其他烟株导致病害流行. 此外，由图 6可以看出，5~6月，龚滩烟区土壤和病叶中靶斑病菌含量显著上升. 但到7月底发病叶片中含菌量显著下降，可能是由2022年重庆7月持续高温(＞40 ℃)引起，表明高温对靶斑病菌生长有一定影响.

3.   讨论

  • 烟草靶斑病自在我国首次发现以来，其扩散速度十分迅速，同时具有再侵染频繁、危害性大等特点[15]，一旦发病便带来巨大的经济损失. 对于烟草靶斑病的有效防治仍然主要采取化学防治的手段，然而，烟草靶斑病在田间的发病症状与烟草赤星病、烟草棒孢霉叶斑病等常见烟草叶部病害的发病症状极为相似，尤其是与烟草赤星病常常难以区分[36]，而该3种烟草病害常用的有效药剂以及最佳防治时期不同，无法准确区分该3种病害往往会导致在化学药剂的针对性选择上以及准确把握药剂使用时期等方面造成困难. 同时，在西南地区常发的烟草叶部病害主要有烟草赤星病、烟草棒孢霉叶斑病以及烟草靶斑病，尤其是近几年烟草靶斑病在西南多个地区暴发[37-39]. 因此，开发一种针对烟草靶斑病的特异性定量引物用于区分此3种症状相似的病害以及田间烟草靶斑病的快速准确检测十分重要，一旦发病便可以对症下药，选取有效的药剂以及在有效的防治时期进行防治. 而对于烟草其他真菌病害，如烟草黑胫病、烟草灰霉病等，在症状上可以与烟草靶斑病有明显的区分，对于药剂选择以及防治时期上没有造成困难. 因此，本研究针对烟草靶斑病以及与其症状相似的两种常见的烟草叶部病害设计了一对特异性引物RSW1F/RSW2R，结果表明该引物能够特异性检测烟草靶斑病菌R. solani AG-3，能够有效区分其与另外两种症状相似的烟草真菌病害，从而可以对发病初期的烟草病害有针对性的进行化学防治. 然而，R. solani目前国内外已经报道的有14个融合群(AG1-13和AGBI)[19]. 根据地理位置不同，烟草靶斑病的致病病原菌R. solani存在不同的菌丝融合群. 目前在我国已鉴定出的烟草靶斑病病原菌主要为R. solani AG-3融合群，主要分布于湖南[17]、湖北[38]以及贵州[39]等地区，但也有少数地区如广西、贵州等地区检测出R.solani AG-2、R.solani AG-4[40]以及R.solani AG-6[41]等融合群. 因此，对于重庆龚滩地区的烟草靶斑病病原菌是否存在除R.solani AG-3以外的融合群还需要进一步探究.

    同时，烟草靶斑病菌R.solani是一种土传真菌病害[42-43]，其侵染范围广泛[44-46]，可以侵染烟草、番茄、玉米和黄瓜等. 本研究在重庆龚滩地区5~6月土壤样品及杂草中检测出靶斑病菌，说明在该地区靶斑病初侵染来源主要存在于土壤和杂草中. Budge等[47]的研究表明表面浅层土壤更容易比深层土壤中检测出R.solani，因此，可以通过深翻耕等农艺措施来预防其侵染烟株地上部分. 此外，在重庆龚滩地区5月中旬-6月中旬土壤中靶斑病菌含量逐渐增高. 赵艳琴等[48]测定了辽宁丹东地区一年中土壤中靶斑病菌的动态变化数据，发现在一年中该地区土壤靶斑病菌含量于6月28日达到最高值，本研究结果与其基本一致，表明5~6月为靶斑病菌在田间适宜生长的时期. 另外，田间5~6月叶片靶斑病菌含量变化趋势与土壤中变化趋势基本一致. 同时，叶片中6月中旬的Ct值较为接近最低发病菌量的Ct值，提示我们可以在此之前采集田间样品检测烟草靶斑病菌含量，在其达到最低发病菌量之前采取措施防止靶斑病的进一步流行. 因此，在该地区靶斑病的最佳防治时期为5月15日至6月15日. 另一方面，7月烟草叶片中靶斑病菌含量显著降低，说明降雨、温度、湿度等环境因素对该菌的生长有较大的影响.

    综上所述，对于烟草靶斑病的防控可以根据建立的实时荧光定量PCR检测体系检测田间烟草靶斑病菌含量，并在达到最低发病菌量之前及时利用药剂进行有效控制防治. 此外，聂晓等[49]根据新疆泽普县2012-2019年内的小麦白粉病发病情况进行调查统计和数据分析后，将往年病害发生情况与病害发生流行的关键气象因子相结合，利用多元回归分析法建立了小麦白粉病的病害预测模型. 因此，对于烟草靶斑病的预防，还可以在将田间气候预测与GIS技术等相结合从而建立预测模型等方面继续深入探索，做到精准把控田间施药，以预防烟草靶斑病的发生与流行.

4.   结论

  • 本研究设计了一对能够特异性检测烟草靶斑病菌的引物RSW1F/RSW2R，该引物能够有效区分烟草靶斑病菌、烟草赤星病菌、烟草棒孢霉叶斑病菌等重庆烟区常见烟草病害，同时建立了烟草靶斑病菌的实时荧光定量体系，计算出烟草靶斑病的最低发病菌量为12.03 pg/μL，并且将已建立检测体系运用到重庆龚滩烟区靶斑病的检测，发现该烟区的土壤和杂草可能为烟草靶斑病菌的来源，同时确定了5月15日至6月15日为该地区预防烟草靶斑病的最佳时期，为烟草靶斑病的预报预警及科学用药提供依据.

参考文献 (49)

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