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菠菜(Spinacia oleracea L.)是我国各省区均有栽培的苋科1年生草本植物，富含丰富的蛋白质、铁、维生素和矿物质，具有丰富的营养价值，深受广大消费者的喜爱。近几年来，随着菠菜鲜食、加工业市场的不断发展，菠菜的价值也在不断提升。菠菜种植面积的扩大、化肥农药的不合理使用导致其抗性降低，因此菠菜生产中面临的病害问题也日趋严重，其中菠菜炭疽病、霜霉病和叶斑病等已成为目前制约菠菜高产优质的重要病害[1]。
菠菜炭疽病主要危害菠菜的叶片和茎，也危害叶柄、花和果皮[2]。病害通常从基部叶片开始发生，叶片染病时，初生水渍状淡黄色小斑，扩大后呈黄褐色、椭圆形或不规则形轮纹状病斑，中央有黑色小点，病斑中央呈灰白色，半透明，易穿孔，病斑连接成片，使叶片枯黄[3]。成株期染病主要发生于茎部，病斑为纺锤形或梭形，凹陷较深，中间灰白色，边缘灰褐色，密生黑色轮纹状排列小粒点，病部组织逐渐干腐，造成上部茎叶折倒，叶片变黄早枯，影响产量[4]。在陕西省，秋季高湿多雨，地势低洼、田间湿度大的田块发病早且严重。此外，反季节栽培、早播、密植等农事操作易造成田间通风透光不良、植株抗性下降，从而加剧病害的流行。
菠菜炭疽菌(Colletotrichum spinaciae)，属半知菌类真菌。近年来，C. spinaciae被认为是菠菜炭疽病的主要致病菌，也有报道球炭疽菌(C. coccodes)和平头炭疽菌(C. truncatum)可引起菠菜的炭疽病[5]。目前对于菠菜炭疽病的防治仍以化学防治为主。为了明确陕西省菠菜炭疽病的病原菌，筛选低毒高效的杀菌剂，本研究对陕西省菠菜炭疽病的病原菌进行了分离鉴定，同时还进行了室内生物活性测定和防效验证，旨在筛选出高效杀菌剂，为该病的研究与防治提供理论依据。
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菠菜炭疽病病样，采集于陕西省咸阳市武功县武功镇洛阳村。
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大叶菠菜，河南农家旺种业有限公司；优菠66，河南鼎优农业科技有限公司。
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250 g/L吡唑醚菌酯乳油(EC)，巴斯夫植物保护(江苏)有限公司；560 g/L嘧菌·百菌清悬浮剂(SC)，325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂(SC)，先正达南通作物保护有限公司；45%咪鲜胺悬浮剂(SC)，深圳诺普信农化有限公司；29%戊唑·嘧菌酯悬浮剂(SC)，安道麦马克西姆有限公司；40%苯甲·吡唑酯悬浮剂(SC)，广东真格生物科技有限公司；16%二氰·吡唑酯水分散粒剂(WG)，巴斯夫欧洲公司；10%苯醚甲环唑水分散粒剂(WG)，东莞市瑞德丰生物科技有限公司；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(WP)，允发化工(上海)有限公司；50%多菌灵可湿性粉剂(WP)，四川润尔科技有限公司。
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用接种针直接挑取病斑表面黑色分生孢子盘，置于2 mL离心管中，采用稀释分离法[6]获得分离株单菌落。将纯化后的菌株编号，4 ℃冰箱保存。
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将分离获得的菌株经PDA活化后，用直径6 mm打孔器于菌落边缘打取菌饼接种于新的PDA平板上。21 ℃黑暗培养7 d后测菌落直径，观察并记录菌落形态、颜色、质地等。在光学显微镜下观察其产孢结构、分生孢子形态与大小、附着胞形态等微观特征，3次重复。
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采用CTAB法提取真菌DNA，采用陕西擎科生物科技有限公司合成的引物对致病菌株DNA进行PCR扩增(表 1)。扩增体系(50 μL)包括Tap PCR Master Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、dd H2O 19 μL。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA和PCR扩增产物。将合格产物送至陕西擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对，将每个基因结合模式菌株的参考序列用软件MEGA 7.0中的Clustal W对齐、切除两端，之后按照ITS、ACT、CHS1、GAPDH、TUB2、HIS3的顺序首尾相连，与已知炭疽病菌种的标准序列进行比对(表 2)，以Monilochaetes Infuscans为外群[7]，用MEGA 7.0以最大似然法(Maximum Likeli-Hood)构建系统发育树。
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选择代表性分离株在PDA平板上21 ℃培养7 d，用无菌涂布器刮擦菌落表面菌丝，均匀涂抹至新的PDA平板内，继续培养10 d，待产孢后配制成1×106个/mL的孢悬液(吐温20质量分数为0.01%)。将孢悬液均匀喷于60日龄的大叶菠菜叶片表面，接种后置25 ℃育苗箱内保湿培养48 h，后取出25 ℃、14 h光照/10 h黑暗温室中继续培养，早晚各喷水1次。观察记录发病情况，待叶片发病后，根据柯赫氏法则，采用组织分离法于病健交界处再次分离病原菌，与初次分离菌对比，确定是否为该致病菌。
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采用菌丝生长速率法[13]，每个处理4次重复，21 ℃培养10 d后测量各药剂处理的菌落直径，计算不同药剂处理对菌丝的生长抑制率。用DPS数据处理系统建立毒力回归方程，计算相关系数r和抑制中浓度EC50。
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菠菜种植前先在室内进行催芽，待种子萌发后，种植于育苗盘中，培养35 d，移植到型号为10 cm×10 cm×10 cm的花盆内，每盆留苗1株，培养至45 d用于接菌。分生孢子悬浮液的配置方法和接种方法同1.2.4。药剂设16%二氰·吡唑酯WG 500倍液、50%多菌灵WP 500倍液，250 g/L吡唑醚菌酯EC 1 000倍液、45%咪鲜胺SC 1 000倍液，40%苯甲·吡唑酯SC 2 000倍液5个处理，以喷施无菌水为对照。使用喷壶(型号250 mL)向菠菜幼苗分别喷10 mL的病原菌和10 mL药剂，每处理喷8株菠菜，4次重复。盆栽试验分保护试验和治疗试验，保护组先喷药24 h后再喷菌，治疗组先喷菌24 h后再喷药。所有处理25 ℃保湿培养48 h，然后摘除保湿盖，14 h光照/10 h黑暗温室继续培养。接种后10 d，依据菠菜炭疽病分级标准检查各处理的病情严重度，计算病情指数和防效。病害分级标准[7]：0级，叶片无病斑；1级，病斑占叶面积的1%~25%；2级，病斑占叶面积的26%~50%；3级，病斑占叶面积的51%~75%；4级，病斑占叶面积的76%~100%。
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采用随机区组设计，在优菠66菠菜田自然发病条件下进行试验。小区面积6 m2，小区间隔0.8 m。供试5种药剂分别设置1 000倍液和2 000倍液2个浓度，喷清水为空白对照，共12个处理，每处理3次重复，在田间植株叶片上出现零星水渍状病斑时开始喷药(出苗后60 d)，间隔10 d喷药1次，共喷施3次。末次喷药后30 d，每处理各随机调查30株，统一检查最下层4~5片叶的发病情况，记录病害等级，并据此计算发病率、病情指数和防效。
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数据用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用Duncan氏新复极差法进行各处理间的差异显著性检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。
1.1. 材料
1.1.1. 供试病样
1.1.2. 供试菠菜品种
1.1.3. 供试药剂
1.2. 方法
1.2.1. 分离与纯化
1.2.2. 病原物的形态学观察
1.2.3. 病原物的分子生物学鉴定
1.2.4. 致病性测定
1.2.5. 菠菜炭疽病菌对10种药剂的敏感性测定
1.2.6. 不同药剂对菠菜炭疽病的盆栽防效
1.2.7. 不同药剂对菠菜炭疽病的田间防效
1.3. 数据处理
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菠菜炭疽菌主要危害菠菜叶片，也危害茎、花和果实(图 1)。苗期叶片染病时，初生水渍状淡黄色小斑，病斑半透明；扩大后呈黄褐色，椭圆形、纺锤形、梭形或不规则形轮纹状病斑，中央有黑色小点，其为病菌的分生孢子盘；后期易穿孔；危害严重时病斑连接成片形成孔洞，造成叶片枯黄(图 1a)。成株期染病时，病害通常从基部叶片开始自下而上发生，主要危害叶片、茎、花和果实；病斑为纺锤形或梭形，凹陷较深，中间灰白色，边缘灰褐色，密生黑色轮纹状排列小粒点，严重时病组织干腐，造成上部茎叶折倒，叶片变黄早枯(图 1b)，影响种子的品质和产量。
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病原菌在PDA平板上21 ℃黑暗培养7 d，菌落平均直径为19.8 mm。菌落边缘不规则，气生菌丝白色或灰白色，致密(图 2a，2b)。7 d后，将菌丝刮除，21 ℃黑暗继续培养7 d，可见菌落表面生出白色的“脓状物”(图 2c)，其为大量的分生孢子盘和分生孢子。分生孢子盘上着生刚毛和分生孢子；刚毛直立，末端尖锐，褐色或深褐色，有隔，大小为(52.0~83.5) μm×(4.0~5.5) μm(图 2d)。分生孢子单胞，镰状，向两端渐尖，无色，具油球，大小为(22.0~25.5) μm×(3.0~4.5) μm (n=50)(图 2e)。附着胞末端膨大，颜色较深，褐色至黑褐色，近球形，边缘光滑(图 2f)。
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基于ITS、ACT、CHS1、GAPDH、TUB2和HIS3 6个多基因位点对病原菌进行分子鉴定与系统发育分析，其PCR扩增片段长度分别为541、297、327、268、509、400 bp。图 3显示，菌株C221023与Colletotrichum spinaciae聚在同一分支上，节点支持率为100%。结合形态学将菌株C221023鉴定为菠菜炭疽菌C. spinaciae。
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将分离纯化后的菌株编号为C221023，培养至产孢(图 4a)，将孢悬液均匀喷于60日龄的菠菜叶片表面。室内接种孢悬浮液48 h后，可见水渍状褪绿斑(图 4b)；接种8 d后，表现出与田间相同的症状(图 4c)。从接种发病的病叶重新分离的病原物与第一次分离物相同，证明该分离物是引起菠菜炭疽病的病原菌。
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敏感性测定结果表明，供试10种杀菌剂对菠菜炭疽菌均有一定的抑制作用(表 3)，其中45%咪鲜胺SC、250 g/L吡唑醚菌酯EC、16%二氰·吡唑酯WG、40%苯甲·吡唑酯SC对菌丝生长具有明显的抑制效果，其EC50分别为0.055 9、0.092 9、0.162 9、0.307 5 mg/L，均小于1.0 mg/L。50%多菌灵WP、560 g/L嘧菌·百菌清SC等6种药剂EC50为1.291 9~6.264 2 mg/L，均大于1.0 mg/L。
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供试5种杀菌剂对菠菜炭疽病的保护和治疗效果如表 4。40%苯甲·吡唑酯SC室内盆栽防效最好，对菠菜炭疽病同时具有治疗作用和保护作用，且治疗作用效果(73.06%)强于保护作用效果(68.55%)。其次，250 g/L吡唑醚菌酯EC和16%二氰·吡唑酯WG防效也较佳，45%咪鲜胺SC和50%多菌灵WP防治效果基本相同。
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供试的5种杀菌剂除45%咪鲜胺SC外，田间防效均高于55%(表 5)。250 g/L吡唑醚菌酯EC防效最佳，1 000倍液和2 000倍液对菠菜炭疽病的防效分别为88.67%和87.86%，与其他处理间差异有统计学意义；50%多菌灵WP和40%苯甲·吡唑酯SC防效较好，1 000倍液的防效均为68.67%，二者差异无统计学意义；45%咪鲜胺SC和16%二氰·吡唑酯WG防效低于以上3种药剂。
2.1. 菠菜炭疽病田间症状
2.2. 菠菜炭疽病病原菌形态鉴定
2.3. 菠菜炭疽病病原菌分子生物学鉴定
2.4. 致病性测定
2.5. 菠菜炭疽菌对10种药剂的敏感性测定
2.6. 不同药剂对菠菜炭疽病的室内盆栽防效
2.7. 不同药剂对菠菜炭疽病的田间防效
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菠菜炭疽病是菠菜生产上主要叶斑病之一，在加拿大[14]、美国[15]、澳大利亚[16]、土耳其、加利福尼亚等菠菜产区均有报道，造成了严重的产量和经济损失。C. dematium f. sp. spinaciae通常被认为是菠菜和甜菜的一种病原体[17]。Von Arx[18]将菠菜炭疽病的致病菌描述为C. dematium，考虑到宿主特异性，将菠菜炭疽菌的病原菌命名为C. dematium f. sp. spinaciae。
病原菌在PDA平板上生长速度较慢，培养7 d的菌落呈圆形或不规则形，白色、灰白色至灰色，培养21 d的病原菌在PDA平板上产孢量较少或不产孢。本研究显示，玻片刮除菌丝或菌饼在平板上涂布接种可产生大量的分生孢子。分生孢子单孢无色，镰状，具有油球，附着胞末端膨大，颜色较深，褐色至黑褐色，与国外Damm等[17]、Kurt等[19]描述的菠菜炭疽菌，国内侵染线辣椒[20]、箭筈豌豆[21]的菠菜炭疽菌菌落形态、分生孢子形态特征基本一致。综合病原菌形态与分子生物学鉴定结果，认为陕西省菠菜炭疽病的致病菌为C. spinaciae。
目前已经有很多炭疽病药剂筛选的研究报道[22-23]，但是引起炭疽病的病原菌种类很多[24]，同种药剂对不同病原菌室内生物活性的抑制仍然存在较大差异。在菠菜炭疽病的防治上，应选择抑菌效果好的药剂。本研究测定了菠菜炭疽菌对10种杀菌剂的敏感性，筛选出45%咪鲜胺SC、250 g/L吡唑醚菌酯EC、16%二氰·吡唑酯WG、40%苯甲·吡唑酯SC等4种EC50小于1.0 mg/L的高效药剂，这与王琼[25]的研究结果一致。在室内盆栽防效试验中，40%苯甲·吡唑酯SC、250 g/L吡唑醚菌酯EC防效较好，兼具治疗作用和保护作用。菠菜炭疽病田间防效试验结果与盆栽防效结果不同，250 g/L吡唑醚菌酯EC和50%多菌灵WP田间防效优于40%苯甲·吡唑酯SC，产生差异的原因可能与光照、温湿度、土壤条件、病菌接种量、植株生长差异、药剂喷雾量等有关。Uysal等[26]研究表明，接种量、温度、保湿时间、植株叶龄对菠菜炭疽病发病都有影响，且老叶发病比嫩叶发病更为严重，这与本研究田间试验菠菜炭疽病老叶发病较新叶发病严重结果一致。250 g/L吡唑醚菌酯EC、50%多菌灵WP、40%苯甲·吡唑酯SC可有效防治不同炭疽菌引起的多种作物炭疽病，这与周洁等[27]的研究结果一致，为此，菠菜炭疽病发生时可交替使用这3种药剂进行防治。这3种药剂对菠菜炭疽病虽表现出良好的田间防效，但其高效且安全的应用方案，如施用剂量、施药时期、施用频率和安全间隔期等，仍需结合田间管理并经多年试验验证，以兼顾药效与农药减量。