实验用相同日龄的26头盆周山地猪个体选自盆周山地猪市级保种场，并在保种场内统一条件下饲养、自由采食和饮水。达90±5 kg体重时在重庆市涪陵区南沱镇屠宰场屠宰，统一采集2~3腰椎处的背最长肌，用于后续IMF含量测定、RNA提取、油红O染色。其中，RNA提取样本迅速置于液氮中，运回实验室后于-80 ℃冰箱保存；油红O染色样本用4%多聚甲醛固定；剩余样本于低温环境运送至农业农村部种猪质量监督检验测试中心(重庆)，打碎、称重后-20 ℃保存，用于IMF测定。

根据中华人民共和国农业行业标准《猪肉品质测定技术规程》 (NY/T 821—2019)的要求，采用索氏浸提法进行IMF含量的测定。依据每个样品IMF含量的测定值，2.5%为极低IMF含量组的筛选阈值，5.0%为极高IMF含量组的筛选阈值筛选出盆周山地猪群体内极低IMF含量组个体3头、极高IMF含量组个体5头。

通过油红O对目标组织进行染色，可以确定目标组织中脂类物质沉积的情况。具体步骤如下：将采集的背最长肌修剪成2 mm左右的长度后放入OCT包埋胶中，于恒温冰冻切片机中进行包埋。待OCT胶凝固后，于恒温冰冻切片机中连续切片，制成厚度为6 μm的切片。将切片于甲醛中固定10 min后用蒸馏水清洗，再用60%的异丙醇浸洗。随后，将切片浸泡在油红O染液中10 min后，再将切片浸入60%异丙醇分色至背景无色。然后，用蒸馏水清洗切片后用苏木精复染1 min。最后，用蒸馏水清洗切片，待切片晾干后用甘油封片。

利用Trizol试剂提取每个背最长肌样本的总RNA，用Nanodrop 2000检测RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，Agilent 2100检测样本的RIN值。对检测合格的样品利用Illumina PE150测序平台进行建库和测序，相关工作在北京百迈客生物科技有限公司完成。

利用FastQC软件，采用如下质控标准对原始数据进行质量控制：①去除含接头的reads；②去除质量低的reads(质量值Q≤20的碱基数占整条reads的50%以上)；③去除片段长度小于50 bp的reads；④去除含N比例大于10%的reads。利用STAR软件将质控后的高质量数据比对到猪的参考基因组(Sscrofa 11.1)上。利用Cufflinks(2.2.1)软件对比对到基因组的数据进行组装。随后，用Assemblyline软件对转录本进行单外显子的过滤，并通过TACO对所有转录本进行合并，筛选去除含有clipped exon(exon长度小于15个碱基)、FPKM(每百万映射读取的每千碱基片段数，Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)低于0.1以及长度小于250个碱基的转录本。再通过与基因组对比，判断是否有已注释基因或转录本的存在。对于不能被基因组注释的转录本，通过CPC2软件判断其蛋白编码潜能(编码或非编码)。接着，用Pfamscan软件分别对所有编码和非编码的转录本进行蛋白数据库(Pfam31)的比对，分别统计每个蛋白域比对上的转录本(编码或非编码)数量，并通过fisher方法检验编码与非编码转录本都比对上的蛋白域的相似性(当p＞0.05或OR＜10时，认为非编码对应的蛋白域更趋向于编码，其中OR为优势比)，没有被基因组注释的编码转录本即为TUCP(Transcripts with Unknown Coding Potential)，其余为lncRNA。最后通过kallisto软件对mRNA和lncRNA进行定量和count数目的统计。

利用edgeR软件包进行mRNA及lncRNA的差异表达分析，以|log₂FC|＞0.75、FDR＜0.05为标准筛选差异表达基因，其中FC(Fold Change)为差异倍数，FDR为(False Discovery Rate)阳性错误率。利用Metascape网站(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)对差异表达基因进行GO(Gene Ontology，基因本体论)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书)功能富集分析，以p＜0.01为显著富集条目和通路。

将lncRNA基因组位置上下游100 kB的基因认为是lncRNA的顺式作用靶基因。反式作用靶基因预测的基本原理认为lncRNA的功能跟编码基因的位置没有关系，而与其共表达的蛋白编码基因相关。可以通过样本间lncRNA与蛋白编码基因的表达量相关性分析来预测其靶基因。将lncRNA-mRNA之间的Pearson相关系数大于0.9或小于-0.9但p＜0.05的基因判定为lncRNA的反式作用靶基因。

为了验证测序结果的可靠性，分别挑选10个差异表达的mRNA和lncRNA(上调、下调各5个)进行RT-PCR验证。使用β-actin基因作为内参基因，所有引物信息见表 1，所有引物均在苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用2^-ΔΔCt方法计算基因的表达量。

利用索氏抽提法进行IMF测定，依据IMF脂肪含量测定结果，分别命名为高IMF组和低IMF组，其中高IMF组平均IMF含量为6.58±1.14%，低IMF组平均IMF含量为1.87±0.55%(图 1a)。高、低IMF组肌肉横切面及油红O染色结果如图 1b、1c所示，表明高IMF组肌肉组织内IMF分布比低IMF组更广。

对测序结果进行质控，共获得8个样本总计157.78 GB的clean reads，每个样本至少获得17.48 GB的clean reads。将clean reads比对到猪参考基因组(Scrofa 11.1)发现，样本的总比对序列数占比为96.82%~97.83%，唯一比对序列数占比为78.92%~89.91%，多重比对序列数占比为7.55%~17.90%(表 2)，测序数据质量整体较好，可以进行后续分析。

利用edgeR软件包进行mRNA筛选，以|log₂FC|＞0.75、FDR＜0.05为显著表达差异条件。结果表明高、低IMF组之间共有83个差异显著mRNA，相对于高IMF组，低IMF组中有56个mRNA显著上调，27个mRNA显著下调(图 2)，主要涉及的相关基因有MYH3、MYH13、PDK4、MSTN、FABP3等(图 3)。对差异表达基因进行GO条目分析发现，共有111个条目显著富集(p＜0.05)，主要参与肌肉系统过程、脂肪酸氧化调控、肌肉器官发育等生物学过程(图 4)。这些显著富集的GO条目中，14个与肌肉和脂肪相关，主要参与肌肉发育、脂肪酸氧化、脂肪酸代谢、葡萄糖代谢、脂质转运等过程(图 5)。KEGG功能富集分析结果表明，这些差异基因显著富集的信号通路有4个，即：甲状旁腺激素的合成、分泌和作用，胃酸分泌，糖尿病性心肌病以及胰液的分泌。

以|log₂FC|＞0.75、p＜0.05为显著表达差异条件筛选差异lncRNA。结果表明，两组之间共有237个已知的差异lncRNA。相较于高IMF组，低IMF组中有144个lncRNA显著下调，93个lncRNA显著上调(图 6)。

基于lncRNA在染色体上的位置，在差异显著lncRNA的上下游100 kB范围内共找到KIF5A、ACOX3、PDK4、KLF12、KLF3、LEP等413个编码基因(顺式作用靶基因)。GO富集分析发现，这些基因在405个GO条目中显著富集，包括骨骼肌系统发育、瘦素介导的信号通路、脂肪细胞分化的正向调控等生物学过程(图 7)。KEGG信号通路分析结果表明，这些基因富集在细胞周期、细胞衰老、脂质和动脉粥样硬化及非酒精性脂肪肝等信号通路(图 8)。基于lncRNA-mRNA之间的Pearson相关系数，在这些差异显著的lncRNA中，共鉴定得到11个lncRNA与515个编码基因存在相关关系。其中有6个差异显著的lncRNA与11个差异显著的编码基因之间存在相关关系。此外，有2个差异显著的lncRNA与3个差异显著的肉质相关编码基因存在潜在的靶向调控关系(表 3)。

为了验证转录组测序结果的准确性，随机选取10个mRNA和lncRNA进行实时荧光定量PCR验证。结果发现，所验证的mRNA和lncRNA(低IMF组vs高IMF组)表达趋势与转录组测序的表达趋势(低IMF组vs高IMF组)一致(图 9)，表明此次转录组测序结果可靠性高，可以用于后续研究。

盆周山地猪是我国优良地方猪种之一，平均IMF含量与肌肉的理想IMF含量3%~5%相符，是优良的育种素材，但是其IMF含量在群体内的一致性较差，这将对后期的利用产生影响。本研究以这一问题为出发点，通过比较高、低IMF含量猪只背最长肌的mRNA和lncRNA表达差异，筛选盆周山地猪IMF沉积差异的候选mRNA和lncRNA，以期为盆周山地猪肉质的选育提供分子依据。本研究首先通过索氏抽提法结合油红O染色在盆周山地猪群体中筛选出了高IMF组和低IMF组，高IMF组平均IMF含量(6.58±1.14%)是低IMF组(1.87±0.55%)的3.5倍(图 1a)，说明在盆周山地猪群体中个体之间IMF的含量有很大差异，有必要进一步挖掘调控盆周山地猪IMF沉积的关键基因。

随后对高IMF组和低IMF组肌肉组织进行了转录组测序，测序结果发现高IMF组和低IMF组之间共有83个差异表达的mRNA，推测这些差异表达基因可能与两组猪IMF含量差异相关，为了探究这些基因的生物学功能，对这些基因进行了GO功能富集分析，分析结果中值得注意的有脂肪酸氧化调节、脂肪酸代谢过程、葡萄糖代谢过程、脂质转运、脂质生物合成过程、单糖代谢过程、碳水化合物代谢过程等与能量代谢相关的过程，推测高IMF组和低IMF组猪IMF沉积能力的差异是由脂质、能量代谢相关基因的差异表达造成的。转录组测序结果还发现高IMF组和低IMF组之间有237个差异表达的lncRNA，为了明确差异表达lncRNA的潜在功能，对这些差异表达lncRNA进行了顺式作用靶基因的预测，共预测出413个基因，并对这些靶基因进行了GO功能和KEGG通路富集分析。GO分析结果显示这些靶基因主要富集在骨骼肌系统发育、瘦素介导的信号通路、脂肪细胞分化的正向调控等生物学过程。KEGG发现这些靶基因主要富集在细胞周期、细胞衰老、脂质和动脉粥样化及非酒精性脂肪肝等信号通路。基于lncRNA-mRNA之间的Pearson相关系数，筛选出有2个差异显著的lncRNA与3个差异显著的肉品质相关编码基因存在潜在的靶向调控关系，这3个基因分别为FABP3、PDK4和CTSD。因此推测，lncRNA通过调控这些基因的表达影响盆周山地猪IMF的沉积过程。

腺苷三磷酸酶家族中有4种丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate Dehydrogenase Kinase，PDKs)同工酶，分别为PDK1、PDK2、PDK3和PDK4 ^[11]。PDK4参与动物体内三羧酸循环、脂肪代谢、糖酵解、ATP的形成等多个新陈代谢过程^[12]，在人和小鼠的心脏、肝脏、骨骼肌和脂肪组织中有较高表达量^[11]。在家畜各组织中，PDK4基因在肌肉和脂肪组织中表达量较高，在屯昌猪背最长肌中表达量最高^[13]，在陆川猪和大白猪的皮下脂肪表达量最高^[14-15]，在巴马香猪和杜长大猪的腹脂中高表达^[16]，提示PDK4在家畜肌肉和脂肪生长过程中具有重要作用。已有研究发现，PDK4的表达量与鸡的脂肪沉积速度相关^[17]，PDK4的过表达能够增加猪的脂肪代谢效率^[15]，且PDK4基因的SNP位点与IMF、肌肉系水力等肉质性状具有相关性^[18-19]。PDK4可以抑制丙酮酸向乙酰CoA转化^[20]，乙酰CoA减少后会引起脂肪酸氧化抑制剂丙二酰辅酶A的减少，说明PDK4的上调表达可以促进脂肪酸氧化^[21]。PDK4敲基因小鼠禁食后，随着血糖降低，脂肪酸氧化速率降低，葡萄糖和丙酮酸氧化速率增加，且增加速率一致^[22]。结合以上的研究结果和本研究的结果，推测PDK4基因可能是影响盆周山地猪IMF沉积的关键候选基因。

脂肪酸结合蛋白(Fatty Acid Binding Protein，FABPs)作为脂质结合蛋白超家族的成员，广泛参与动物体脂质代谢和脂肪沉积等过程^[23]，对脂肪酸具有很强的亲和性^[24]，其中FABP3基因目前广泛被认为是调控IMF沉积的候选基因，主要通过参与细胞中长链脂肪酸的摄取、转运和利用实现脂肪代谢调节^[25]，目前有大量研究证实FABP3基因多态性与猪IMF之间存在显著相关性^[26-28]。本研究的转录组测序结果发现，盆周山地猪高IMF组和低IMF组的背最长肌FABP3基因mRNA的表达差异显著，推测FABP3基因是调控盆周山地猪IMF沉积的重要基因。

本研究通过转录组测序在盆周山地猪高IMF组和低IMF组的背最长肌中共鉴定出了83个差异表达mRNA和237个差异表达的lncRNA。差异表达lncRNA和mRNA主要在脂质、能量代谢相关的信号通路中富集。lncRNA-mRNA互作分析筛选出了2个差异显著的lncRNA(ENSSSCG00000044255、ENSSSCG00000048256)与3个差异显著的肉质相关编码基因(FABP3、PDK4和CTSD)存在潜在的靶向调控关系，因此推测这些lncRNA和mRNA是影响盆周山地猪IMF沉积的重要候选基因。