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植物病毒病防治难度极大，素有“植物癌症”之称，作为仅次于真菌病害的第二大植物病害，每年都给全球农业造成沉重的经济损失[1]。由植物病毒单独或复合侵染引发的病毒病，是烟草生产中最常见且最难防治的主要难题。我国已发现31种烟草病毒及其多个分离物，田间以复合侵染为主，导致病害形势愈发复杂和严重[2]。近年来，我国烟草病毒病的发生种类与危害范围均呈上升趋势，以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)和马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)为主，以辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus，ChiVMV)和番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)为辅的病毒病发生普遍且危害严重，田间的复合侵染现象导致病害症状更加复杂，所造成的损失也进一步加剧[3-4]。生产上尚无高效药剂，且杀虫剂和抗病毒剂的高频使用容易导致烟叶农残超标。
免疫诱抗剂能够激活植物的分子免疫系统，并调控一系列代谢通路，从而在诱导抗病性的同时，促进植物根、茎、叶的生长，提高叶绿素含量，最终实现抗病与增产的双重功效[5-7]。新型免疫诱抗剂的研发与应用是提升作物病毒病绿色防控水平的关键途径。其中，灵菌红素作为一种由沙雷氏菌(Serratia marcescens)或链霉菌(Streptomyces)等微生物产生的天然次级代谢产物，其分子结构为三吡咯环，展现出巨大的应用潜力。该物质不仅拥有卓越的广谱生物活性，如抗癌、抗菌和抗疟等医药价值，还在环境修复(如铜污染治理)、工业领域(如食品着色剂、太阳能电池光敏剂)展现出多样化应用前景[8-11]。作为最早被发现的灵菌红素产生菌，粘质沙雷氏菌亦是该领域研究最为广泛的物种。前期研究表明，灵菌红素可抑制TMV的复制并诱导植株系统抗性，该菌株还能分泌一种对TMV具有高效钝化活性的碱性金属蛋白酶[12-13]。石墨烯独特的纳米结构和表面性质能够通过气孔途径渗透叶片，直接与叶绿体相互作用，增强叶片光合作用活性，促进下游关键次生代谢物的积累，进而提升植物健康程度并增加作物产量，优化寄主植物的整体营养水平[14]。近年来，石墨烯在农业中作为营养调节剂的应用潜力逐渐被发掘，石墨烯在极低施用量(18 g/hm2)下可通过叶面喷施显著提升多种作物的光合效率、抗氧化能力及产量，且不影响作物品质[14]。同时，地上部光合产物的增加会协同促进根系的生长发育。研究表明，石墨烯可以有效促进种子萌发、诱导抗氧化酶活性、协调碳氮代谢平衡、提高作物光能利用率及促进生长[15]。在适宜浓度下，石墨烯可显著促进玉米[16]、白榆[17]、番茄[18]、芦荟[19]、藜麦[20]及油松[21]等多种植物根系与地上部分的生长发育。
提高烟株抗病毒能力是烟草病毒病防控的关键，免疫诱抗技术对烟草病毒病防控具有一定效果，但尚需配合营养协调才能高效提升烟株抗病毒能力。本文旨在系统研究营养调节剂与免疫诱抗剂对TMV、PVY的协同控制作用。通过室内生测和田间药效试验，测定对病毒病的抑制效果，为推广应用模式提供依据。
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免疫诱抗剂：0.015%灵菌红素水剂(中国农业科学院烟草研究所中试产品)、生防菌纳米核酸药物(中国农业科学院烟草研究所中试产品)、5%氨基寡糖素水剂(登记证号PD20160015，青岛滨海泰生作物科学有限公司)；营养调节剂：生物质石墨烯(FG，中国农业科学院烟草研究所中试产品)；抗病毒剂：20%辛菌胺醋酸盐水剂(登记证号PD20161522，潍坊万胜生物农药有限公司)。20%辛菌胺醋酸盐水剂处理组为阳性对照，清水处理组为阴性对照。
供试烟草：本氏烟(Nicotiana benthamiana)，NN基因型粘烟草(N. glutinosa)，三生NN烟(N. tabacum var. Samsun NN)，NN基因型烟草中烟100和云烟87。烟草植株置于通风良好的温室中培养，生长环境设置：温度25℃，光周期16 h光照/8 h黑暗，相对湿度55%。
供试病毒：在中烟100上活体保存的TMV、在粘烟草上活体保存的PVY。
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分别用清水配制0.015%灵菌红素水剂120倍液、生防菌纳米核酸药物120倍液、5%氨基寡糖素水剂500倍液、20%辛菌胺醋酸盐水剂500倍液，以及10、20、50 mg/L的生物质石墨烯。
分别取0.5 g TMV和1 g PVY病叶，于研钵中加入液氮充分研磨后，加40 mL 0.01 mol/L的PBS配制TMV和PVY接种液。接种前在叶面上均匀撒少许石英砂，接种后15~30 min喷施清水冲洗掉多余石英砂。
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在6~7叶期粘烟草上采用半叶法[22]摩擦接种TMV，即叶片一侧接种处理液，另一侧接种对照液，检测免疫诱抗剂对TMV的钝化效果。其中，免疫诱抗剂药液或抗病毒剂药液与病毒接种液等体积混合为处理液，清水与病毒接种液等体积混合为对照液。每处理15片叶，重复3次。接种3 d后，统计TMV枯斑数，按式(1)计算药液对TMV的抑制效果。
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在6~7叶期三生NN烟草上采用先喷淋药液后接种病毒的方法，检测免疫诱抗剂对TMV的抑制效果。即在处理组植株上喷淋免疫诱抗剂药液或抗病毒剂药液，在对照组植株上喷淋清水，每株30 mL。每处理15株，重复3次。间隔1 d连续喷施3次。末次喷施后15 min摩擦接种TMV。接种3 d后，统计TMV枯斑数，按式(1)计算药液对TMV的抑制效果。
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在6~7叶期本氏烟上摩擦接种PVY，检测免疫诱抗剂对PVY的钝化效果。即在处理组植株上接种处理液，在对照组植株上接种对照液。免疫诱抗剂药液或抗病毒剂药液与病毒接种液等体积混合为处理液，清水与病毒接种液等体积混合为对照液。每处理15株，重复3次。接种5 d后，取心叶提取RNA，反转录为cDNA，进行qRT-PCR检测。以本氏烟actin为内参基因，采用相对CT法(2-ΔΔCT)计算PVY外壳蛋白mRNA相对表达量[13]，按式(2)计算药液对PVY的抑制效果。
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在6~7叶期中烟100上采用先喷淋药液后接种病毒的方法，检测免疫诱抗剂对PVY的抑制效果。即在处理组植株上喷淋免疫诱抗剂药液或抗病毒剂药液，在对照组植株上喷淋清水，每株30 mL。每处理15株，重复3次。间隔7 d连续喷施3次。末次喷施后15~30 min摩擦接种PVY。接种14 d后，按《烟草病虫害分级及调查方法》(GB/T 23222-2008)[23]，逐株统计PVY病级，按式(3)和式(4)分别计算病情指数和药液对PVY的抑制效果。
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本氏烟假植缓苗后自6~7叶期开始叶面喷施营养调节剂，即喷施10、20、50 mg/L的生物质石墨烯药液，以喷施清水为空白对照。每处理15株，重复3次。间隔2 d连续喷施5次。末次喷施后2 d测定烟株的生物量(净重/g、株高/cm)。
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田间药效试验在山东青岛即墨进行，栽植品种为中烟100。试验面积为0.2 hm2，植烟15 000~18 000株/hm2。设置6个处理(表 1)，随机排列，每处理共计500~600株。移栽前1周和移栽时根系灌施1次，50 mL/株；移栽缓苗后伸根期至团棵期叶面喷淋，间隔7~10 d连续施用2次[24-26]。
示范试验在四川凉山会理(0.1 hm2)和冕宁(3.3 hm2)进行，栽植品种为云烟87。设置2个处理(表 2)：营养调节剂+免疫诱抗剂(0.015%灵菌红素水剂120倍液+石墨烯10 mg/L液)和清水对照。末次施药7 d后，每处理采用随机5点取样方法，每点不少于50株，调查发病级别[23]。按式(5)计算发病率，按式(3)和式(4)分别计算病情指数和抑制效果[24]。采用DPS进行统计分析。
1.1. 材料
1.2. 药液和病毒接种液的制备
1.3. 免疫诱抗剂对TMV的钝化作用测定
1.4. 免疫诱抗剂对TMV的抑制作用测定
1.5. 免疫诱抗剂对PVY的钝化作用测定
1.6. 免疫诱抗剂对PVY的抑制作用测定
1.7. 营养调节剂对烟株的促生作用测定
1.8. 营养调节剂与免疫诱抗剂对烟草病毒病的协同控制作用检测
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粘烟草半叶法接种TMV，测定免疫诱抗剂对TMV的钝化效果。接种3 d后的枯斑抑制效果如图 1和表 3所示，免疫诱抗剂或抗病毒剂处理一侧(左)的枯斑数显著低于清水对照一侧(右)。其中，生防菌纳米核酸药物、0.015%灵菌红素水剂、5%氨基寡糖素水剂、20%辛菌胺醋酸盐水剂处理一侧的枯斑数分别为7.07、27.87、10.95、3.81，均显著低于清水对照处理一侧的枯斑数60.61、61.64、60.87、61.52，抑制效果分别为88.34%、54.79%、82.01%、93.81%。这表明免疫诱抗剂对TMV有显著的钝化效果。
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三生NN烟草上先施药后接种TMV，测定免疫诱抗剂对TMV的抑制效果。接种3 d后的枯斑抑制效果如图 2和表 4所示，免疫诱抗剂或抗病毒剂处理叶片的枯斑数显著低于清水对照处理叶片的枯斑数。其中，生防菌纳米核酸药物、0.015%灵菌红素水剂、5%氨基寡糖素水剂、20%辛菌胺醋酸盐水剂处理的枯斑数分别为65.88、76.39、71.21、60.13，均显著低于清水对照处理的枯斑数110.31，抑制效果分别为40.28%、30.75%、35.45%、45.49%。这表明免疫诱抗剂对TMV有显著的抑制效果。
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本氏烟接种PVY并测定免疫诱抗剂对PVY的钝化效果。接种5 d后对系统花叶的抑制效果如图 3和图 4所示，免疫诱抗剂或抗病毒剂处理的花叶皱缩症状显著轻于清水对照处理。qRT-PCR检测显示，相对于清水对照处理的PVY外壳蛋白mRNA表达量，生防菌纳米核酸药物、0.015%灵菌红素水剂、5%氨基寡糖素水剂、20%辛菌胺醋酸盐水剂处理的PVY外壳蛋白mRNA相对表达量分别为0.5913、0.6916、0.6776、0.6266，对PVY的抑制效果分别为40.87%、30.84%、32.24%、37.34%。这表明免疫诱抗剂对PVY有显著的钝化效果。
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中烟100先施药后接种PVY并测定免疫诱抗剂对PVY的抑制效果。接种14 d后对系统花叶的抑制效果如图 5和表 5所示，免疫诱抗剂或抗病毒剂处理的花叶皱缩症状和病情显著轻于清水对照处理。其中，生防菌纳米核酸药物、0.015%灵菌红素水剂、5%氨基寡糖素水剂、20%辛菌胺醋酸盐水剂处理的病情指数分别为40.25、47.16、47.66、42.22，均显著低于清水对照处理的病情指数67.41，抑制效果分别为40.29%、30.04%、29.30%、37.37%。这表明免疫诱抗剂对PVY有显著的抑制效果。
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生物质石墨烯按照10、20、50 mg/L进行配制，分别对本氏烟叶面喷施5次后，对烟株的促生效果如图 6和表 6所示。与清水对照处理相比，营养调节剂石墨烯处理的植株净重和株高均显著增加。其中，10、20、50 mg/L石墨烯处理的新鲜植株净重分别为24.03、26.40、28.83 g，均显著高于清水对照处理净重的20.03 g，对烟株净重的提升效果分别为19.97%、31.80%、43.93%；地上部株高分别为20.77、23.47、25.20 cm，均显著高于清水对照处理株高的17.07 cm，对株高的提升效果分别为21.68%、37.49%、47.63%。这表明营养调节剂生物质石墨烯对烟株有显著的促生效果。
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青岛即墨烟草试验示范区内2025年病毒病发病率和病情指数较高，主要种类为TMV和PVY，以及零星发生的TSWV。营养调节剂与免疫诱抗剂末次施药7 d后对病毒病的抑制效果如表 7所示。与清水对照相比，营养调节剂、免疫诱抗剂各处理的病情指数均显著下降，“营养调节剂+免疫诱抗剂”的协同控制效果最好。其中，清水对照⑥发病率为100%，病情指数为64.93；“免疫诱抗剂+营养调节剂”处理④(0.015%灵菌红素水剂120倍液+石墨烯10 mg/L液)的发病率为96.88%，病情指数为31.87，对病毒病抑制效果为50.92%，与抗病毒剂处理③(5%氨基寡糖素水剂500倍液+20%辛菌胺醋酸盐水剂500倍液)的抑制效果47.91%相当。
此外，会理和冕宁试验示范区内2025年主要发生TMV和PVY，病情显著低于即墨试验区，“营养调节剂+免疫诱抗剂”协同处理对烟草主要病毒病亦表现较好的抑制效果。其中，会理示范区内，清水对照⑥发病率为21.23%，病情指数为14.57；“营养调节剂+免疫诱抗剂”处理④发病率为15.16%，病情指数为8.88，对病毒病抑制效果为39.05%。冕宁示范区内，清水对照⑥发病率为12.70%，病情指数为32.33；“营养调节剂+免疫诱抗剂”处理④发病率为2.40%，病情指数为11.64，对病毒病抑制效果为64.00%。
2.1. 免疫诱抗剂对TMV的钝化效果
2.2. 免疫诱抗剂对TMV的抑制效果
2.3. 免疫诱抗剂对PVY的钝化效果
2.4. 免疫诱抗剂对PVY的抑制效果
2.5. 营养调节剂石墨烯对烟株的促生作用
2.6. 营养调节剂与免疫诱抗剂对烟草病毒病的协同控制效果
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烟草病毒病害的防治主要基于病毒的机械或介体传播特性及流行规律，针对传播途径与流行的关键环节，采取综合措施控制初侵染源并阻断传播途径，主要包括选用抗(耐)病品种、改进栽培技术及化学防治3个方面。抗病毒剂对病毒病有良好的抑制效果，8%宁南霉素水剂和5%氨基寡糖素水剂稀释800倍叶面喷施，对烟草病毒病具有较好的防控作用[26]；0.06%甾烯醇微乳剂900 g/hm2叶面喷施，对番茄病毒病有较好的抑制效果[27]。实验室现有研究表明，灵菌红素可抑制TMV的复制增殖，又可诱导植株产生系统抗性[28]，0.015%灵菌红素水剂在烟草移栽至团棵期施用，可预防病毒病发生[29]。此外，10 mg/L石墨烯溶液处理，可提高作物的光能利用率，降低热能耗散，增加能量积累。其中，植物的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳浓度(Ci)以及叶绿素含量(Chl)显著提升，光能吸收和转化能力显著提高，进而增加植物生物量的积累，达到促生目的[14]。灵菌红素与石墨烯组合施用抗病毒机制在于二者的功能协同。一方面，灵菌红素可激活植物蛋白泛素化水平，促使与病毒侵染复制密切相关的HSP70蛋白家族泛素化降解，激活寄主植物天然免疫活性[30]；另一方面，石墨烯提高叶片的光合效率，增加能量积累，增强植物抵抗病原物的能力[14]。
本研究的室内生测试验以生防菌纳米核酸药物、0.015%灵菌红素水剂、5%氨基寡糖素水剂处理植株作为处理组，20%辛菌胺醋酸盐水剂处理植株作为阳性对照组，清水处理植株作为阴性对照组。粘烟草半叶法接种TMV后测定免疫诱抗剂对TMV的钝化效果，接种TMV 3 d后，处理组一侧的枯斑密度显著低于对照组一侧，对TMV的抑制效果分别为88.34%、54.79%、82.01%、93.81%；三生NN烟上先施药后接种TMV再测定免疫诱抗剂对TMV的抑制效果，接种3 d后，对TMV的抑制效果分别为40.28%、30.75%、35.45%、45.49%，这表明免疫诱抗剂对TMV有显著的抑制效果。本氏烟接种PVY后测定免疫诱抗剂对PVY的钝化效果，接种5 d后对PVY的抑制效果分别为40.87%、30.84%、32.24%、37.34%；在中烟100先施药后接种PVY再测定免疫诱抗剂对PVY的抑制效果，接种14 d后，处理组的花叶皱缩症状和病情显著轻于对照组，对PVY的抑制效果分别为40.29%、30.04%、29.30%、37.37%，这表明免疫诱抗剂对PVY有显著的抑制效果。营养调节剂生物质石墨烯以10、20、50 mg/L为处理组，清水处理为对照组，在对本氏烟叶片喷施5次后，处理组植株的净重和株高均显著增加，这表明营养调节剂石墨烯对烟株有显著的促生效果。田间药效试验以免疫诱抗剂和营养调节剂的协同处理对病毒病的抑制效果良好，即墨、会理、冕宁示范区的抑制效果分别为50.92%、39.05%、64.00%。上述示范试验均表明，营养调节剂与免疫诱抗剂协同控制烟草病毒病的效果较好，且该组合施用成本不高于375元/hm2，具有推广应用前景。
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“免疫诱抗剂+营养调节剂”处理(0.015%灵菌红素水剂120倍液+石墨烯10 mg/L液)对TMV、PVY表现出良好的诱抗效果，并可通过移栽前1周和移栽时根系灌施以及移栽缓苗后伸根期至团棵期叶面喷淋的方式进行施药，有效促进了烟株营养和提高烟株抗性。协同作用效果总体优于单独作用效果，且该组合施用成本低，可在烟草病毒病绿色防控中推广应用。