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腹泻引发的肠道感染是一种常见的全球性公共卫生问题，其中未成年人，特别是5岁以下儿童是主要受害群体，其高发病率和致死率严重威胁着人类健康[1]。腹泻的发病机制极为复杂，炎症反应与病原体感染在疾病发生发展过程中扮演着重要角色[2]。肠道内的炎症反应会破坏肠黏膜屏障，引发上皮细胞损伤和通透性增加，导致消化吸收功能紊乱。促炎因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素- 6(IL-6)等大量释放，可加剧肠道炎症的级联反应，形成恶性循环[3]。细菌(如大肠杆菌、沙门氏菌)、病毒(如轮状病毒、诺如病毒)和寄生虫(如贾第虫)是腹泻的主要病原体，它们通过黏附、侵袭肠道上皮细胞，释放毒素，引发感染性腹泻。肠道菌群失衡也会削弱机体对病原体的抵抗能力，进一步加重病情[4]。目前，传统的腹泻治疗方法存在一定的局限性，抗生素滥用导致的耐药性问题日益突出，而单纯的对症治疗难以从根本上阻断炎症进程和清除病原体。因此，从抗炎和抑菌的双重角度探寻安全、有效的治疗方案，对推动腹泻治疗领域的发展具有重要的理论和实践意义。
近年来，中医药在治疗腹泻相关疾病上疗效显著，其止泻效果多与抑制腹泻相关致病菌活性和改善炎症反应有关[5-7]。连翁止痢颗粒主要由黄连、白头翁、老鹳草、大黄炭4味中药组成，具有清热燥湿、凉血止痢的功能；其主要药效成分是以香兰素、小檗碱和大黄素等为代表的生物碱类、多酚类和皂苷类物质。连翁止泻颗粒作为一款以传统中药理论为基础研制的复方制剂，前期研究已表明其在止泻、抗炎、抗菌等方面具有显著效果，在治疗腹泻等相关疾病领域展现出良好的应用前景[8]。随着中医药现代化进程的加速，中药制剂在临床治疗中的应用愈发广泛，其安全性问题也日益受到关注[9]。中药的安全性不仅关系到患者的用药健康，更影响着中医药事业的可持续发展。药物安全性评估是新药研发与临床应用的关键环节，对于中药制剂而言，由于其成分复杂，潜在的不良反应风险更需谨慎评估[10]。
目前针对连翁止泻颗粒安全性的系统研究仍存在较大空白，其长期或过量使用是否会引发毒副作用、是否存在潜在的致敏性，以及其止泻、抗炎、抑菌的效果如何等问题都亟待解答。因此，对连翁止泻颗粒的安全性进行评价，进一步研究连翁止泻颗粒的抗炎、抑菌、小肠推进和止泻方面的药效作用，不仅能够为临床合理用药提供科学依据[4]，还能进一步完善该制剂的质量评价体系，旨在为腹泻治疗药物的创制开发提供理论依据，推动中药制剂的规范化发展。
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受试药物：连翁止痢颗粒。连翁止痢颗粒药液配制：取连翁止痢颗粒50 g，加蒸馏水100 mL，加热回流30 min，过滤，减压浓缩至50 mL，即得浓度为1 g/mL的药液。
对照药物：盐酸小檗碱片。
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UV2600紫外可见分光光度计，上海天美科技有限公司；FA105电子天平，上海台衡仪器仪表有限公司；苏净安泰超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。
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大肠杆菌ATCC 25922，伤寒沙门氏菌ATCC 14028，均为2代菌，购自上海宝录生物科技有限公司。
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昆明小鼠，体质量18~22 g，250只，雌雄各半；Wistar大鼠，体质量180~200 g，110只，雌雄各半。实验室环境：室温为22~24 ℃，相对湿度为60%~70%。该动物试验由中国农业大学动物伦理委员会批准(审批号：Aw92804202-2-1)。
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4周龄清洁级Wistar大鼠80只，随机分为4组，每组20只，雌雄各半。试验设3个染毒剂量组，以LD50的1即5 000 mg/kg为最高剂量组(折合成饲料质量浓度为50 000 mg/kg)，以LD50的1/10即500 mg/kg为低剂量组(折合成饲料质量浓度为5 000 mg/kg)，中间再设1 515 mg/kg(即LD50的1/3.3剂量组，折合成饲料质量浓度为15 150 mg/kg)为中剂量组。另设蒸馏水配制的0.25 g/mL医用淀粉混悬液作为对照[11]。染毒时间根据连翁止痢颗粒临床拟推荐的给药方案，采用经口灌胃给药，连续给药30 d。
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每天观察健康状况、采食及饮水变化、体质量变化等。每周称体质量和饲料各1次，并计算平均摄食量、增质量及饲料利用率(料肉比)。将染毒剂量组与对照组加以比较和统计学处理，及时记录和分析大鼠的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间。
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给药30 d时各组扑杀大鼠(雌雄各半)，采血进行血相和肝、肾功能的检测：血相检测包括红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量等。采用生化分析仪检测肝、肾功能常规指标，如谷草转氨酶(AST或SGOT)、谷丙转氨酶(ALT或SGPT)、总蛋白(TP)、血清白蛋白(Alb)、血糖(GLu)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TCH)和甘油三酯(TG)等。
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昆明小鼠50只，随机分为5组，分别为连翁止痢颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组，盐酸小檗碱组和腹泻模型组，每组10只，每只单独观察。禁食12 h后，高、中、低剂量组分别按照2.6、1.3、0.65 g/kg的剂量给予连翁止痢颗粒，盐酸小檗碱组按照0.72 g/kg剂量给药，模型组给予生理盐水，所有小鼠每20 g灌胃0.5 mL，每天灌服1次，连续灌胃5 d，末次给药30 min后每只灌服5%的硫酸钠溶液0.5 mL，灌服完毕将小鼠置于垫有滤纸的烧杯下，观察并统计小鼠的腹泻情况[12]。小鼠大便大致可分为5种：正常便、外形正常但含水分较多、外形不正常的软便、水样便及黏液便。前3种视为正常便，后2种视为腹泻便。小鼠每腹泻1次用卫生纸擦去并记录，每隔1 h累积计算小鼠腹泻次数，连续观察4 h。
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昆明小鼠50只，随机分为5组，每组10只，小鼠分组、给药剂量及给药方法同1.6.1，每天灌服1次，连续灌胃5 d，末次给药30 min后每只小鼠灌服蓖麻油0.3 mL，灌服完毕观察小鼠的腹泻情况。
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昆明小鼠50只，随机分为5组，每组10只，小鼠分组、给药剂量及给药方法同1.6.1。各组小鼠每10 g灌胃含10%碳素墨汁的生理盐水0.2 mL。给药后15 min脱颈处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上。轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门至墨汁前沿的距离作为碳素墨汁在肠内的推进距离，用公式计算碳素墨汁推进率(R推进)。
式中：D为碳素墨汁在肠内推进距离(cm)；L为小肠总长度(cm)。
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昆明小鼠50只，随机分为5组，每组10只，小鼠分组、给药剂量及给药方法同1.6.1，连续5 d，末次给药后30 min，各鼠左耳两面各涂二甲苯0.02 mL致炎，60 min后处死，用直径7 mm打孔器双耳对称处取下耳片，称质量，计算肿胀率。
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取Wistar大鼠30只，体质量180~200 g，随机分成5组，每组6只。高、中、低剂量组分别按照2.6、1.3、0.65 g/kg的剂量给予连翁止痢颗粒，每只大鼠每天给药1次，连续给药5 d，于末次给药2 h后，左后足趾部皮下注射10%的蛋清0.1 mL，右后足趾部皮下注射2.5%的甲醛溶液0.05 mL。分别于致炎前及致炎后0.5、1、2、4 h测量足趾厚度，并计算足肿胀率(R肿胀)。
式中：T致炎后为致炎后足趾厚度；T致炎前为致炎前足趾厚度。
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昆明小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，小鼠分组、给药剂量及给药方法同1.6.1，末次给药后1 h腹腔注射0.6%醋酸溶液，每只0.2 mL。观察记录15 min内发生扭体反应(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)的潜伏期和次数。
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将标准的大肠杆菌、沙门氏菌活化后，接种于普通琼脂斜面培养基上，37 ℃恒温培养18~24 h，每支斜面加入1.5 mL灭菌蒸馏水，洗下菌液，调整细菌浓度为1.5×108 CFU/mL备用，具体方法参考文献[13-14]。
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采用水提法，4种单味中药和黄连与白头翁的配合药物粉碎为粗粉，各取20 g，加蒸馏水200 mL，浸泡30 min后煎沸，煎煮40 min，过滤；滤渣加水100 mL，再煎煮30 min，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至20 mL，即得质量浓度为1 g/mL的药液；置于抗生素小瓶中，120 ℃高压灭菌20 min，置4 ℃冰箱中保存备用。连翁止痢颗粒药液配制：取连翁止痢颗粒50 g，加蒸馏水100 mL，加热回流30 min，过滤，减压浓缩至50 mL，即得质量浓度为1 g/mL的药液。
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采用平板打孔法测定连翁止痢颗粒对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌效果。用LB液体培养基将药液分别稀释成250、200、175、150、125、75、62.50、50、31.25 mg/mL的9个含药量梯度，然后往每个梯度药液中加入等量菌液，置于36 ℃恒温摇床上培养过夜。用无菌棉签将每个梯度的药液分别均匀涂布于LB固体培养基平板上，置37 ℃恒温培养箱中培养18~24 h，观察平板长菌情况。试验重复3次，取平均值作为每种药物的最小抑菌浓度(MIC)。
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试验数据用x±s表示，SPSS 27.0统计软件进行单因素方差分析和多重比较。
1.1. 试药
1.2. 仪器与材料
1.3. 试验菌株
1.4. 试验动物
1.5. 连翁止痢颗粒安全性试验研究
1.5.1. 染毒剂量的选择及分组
1.5.2. 试验期间临床观察
1.5.3. 血液学和血液生化检测
1.6. 连翁止痢颗粒对不同类型腹泻的干预试验研究
1.6.1. 对硫酸钠诱导腹泻的干预试验
1.6.2. 对蓖麻油诱导腹泻的干预试验
1.6.3. 对小鼠小肠推进运动的影响
1.7. 连翁止痢颗粒对炎症反应的干预试验
1.7.1. 二甲苯致小鼠耳廓水肿试验
1.7.2. 甲醛和蛋清所致大鼠足趾肿胀的试验
1.7.3. 连翁止痢颗粒对小鼠试验性致痛的影响
1.8. 连翁止痢颗粒的体外抑菌试验
1.8.1. 菌液制备
1.8.2. 中药的制备
1.8.3. 体外抑菌试验
1.9. 数据分析及统计
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各组大鼠灌胃给药直至30 d，均无死亡，期间临床表现正常。各试验组在给药30 d时，各剂量组的体质量变化、饲料利用率和脏器系数等指标与对照组相比差异无统计学意义(p＞0.05)(表 1)。母鼠的体质量、增质量、耗料较公鼠的小，这可能是性别差异所致。
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大鼠连续给药30 d的血液学参数测定结果见图 1，与对照组相比，连翁止痢颗粒各剂量组的血液学参数之间差异无统计学意义(p＞0.05)。
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由图 2可知，与对照组相比，连翁止痢颗粒各剂量组血液中白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)和血糖(Glu)的含量差异无统计学意义(p＞0.05)。各剂量组肝功能指标谷丙氨氮酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、肾功能指标尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的活性、血压血脂指标甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)的活性与对照组相比均没有统计学意义(p＞0.05)。
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由表 2可知，连翁止痢颗粒对硫酸钠和蓖麻油致小鼠腹泻均有一定的止泻作用，其中以中剂量的连翁止痢颗粒止痢效果最好。
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由图 3可知，与模型组相比，各种剂量的连翁止痢颗粒与盐酸小檗碱均能显著降低小鼠小肠内碳素墨汁的推进距离，高剂量和低剂量的连翁止痢颗粒能显著降低小鼠小肠碳素墨汁的推进率，减慢小肠的蠕动速度。
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由图 4可知，与模型组比较，高、中、低剂量的连翁止痢颗粒对醋酸致小鼠扭体反应具有显著的抑制作用(p＜0.001)；同时，高、中剂量的连翁止痢颗粒能够显著缓解二甲苯导致的小鼠耳廓肿胀(p＜0.05)，以及对蛋清、甲醛(含低剂量)导致的大鼠足趾肿胀有较为显著的抑制作用(p＜0.05)，说明其具有一定的抗炎作用。
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由表 3和表 4可知，连翁止痢颗粒对大肠杆菌和沙门氏菌均有一定的抑菌作用，对大肠杆菌的抑菌圈直径平均为8.7 mm，对沙门氏菌的抑菌圈直径平均为10.3 mm。连翁止痢颗粒对大肠杆菌的MIC值为166.7 mg/mL，对沙门氏菌的MIC值为175.0 mg/mL。
2.1. 连翁止痢颗粒对大鼠生长性能和器官发育的影响
2.2. 连翁止痢颗粒对大鼠血液学参数的影响
2.3. 连翁止痢颗粒对大鼠机体生化指标的影响
2.4. 连翁止痢颗粒对小鼠试验性腹泻的影响
2.5. 连翁止痢颗粒对小鼠小肠推进运动的影响
2.6. 连翁止痢颗粒的抗炎作用
2.7. 连翁止痢颗粒的体外抑菌试验
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本研究通过对Wistar大鼠进行为期30 d的不同剂量连翁止痢颗粒灌胃试验，旨在探究该药物的亚慢性毒性[15]。结果显示，试验组大鼠各项指标均在正常范围内，且与对照组差异无统计学意义。这一结果表明在试验条件下，连翁止痢颗粒中长期重复应用未表现出亚慢性毒性。
从毒理学角度分析，试验中采用LD50的1、1/3.3和1/10剂量进行灌胃，覆盖了相对宽的剂量范围[16]，具有一定的代表性。而试验组与对照组在临床症状、体质量、血常规、血清生化指标以及组织变化等多方面均无显著差异，说明连翁止痢颗粒在该剂量范围内对大鼠的重要生命体征、血液系统、代谢功能以及重要脏器组织结构均未产生明显不良影响。这一结果为连翁止痢颗粒在临床中长期应用的安全性提供了有力的数据支持，也从侧面反映出该药物成分相对温和，在体内的代谢过程可能不会对机体造成严重负担。
本试验对连翁止痢颗粒药效学进行了研究，主要考察其对硫酸钠、蓖麻油致泻和小肠推进运动的影响，对二甲苯致小鼠耳廓水肿、甲醛和蛋清致大鼠足趾肿胀的影响，对醋酸致小鼠扭体的影响，对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌效果，从而评价其抗腹泻、抗炎、镇痛和抗菌效果。结果显示连翁止痢颗粒能抑制小鼠肠管的推进，可能与其处方中含有大量的小檗碱和大黄素等成分有关，这2种物质对肠管收缩有明显的抑制作用，此结果与庄萍等[17]和吕金胜等[18]报道小剂量大黄素能增加豚鼠、大鼠离体回肠和家兔在体回肠的收缩幅度，但大剂量能减弱其收缩幅度的结果相似。连翁止痢颗粒能减轻二甲苯导致的小鼠耳廓水肿和蛋清、甲醛导致的大鼠足趾肿胀，证明其具有一定的抗炎作用，可能与其含有大量黄连[19]、白头翁[20]有关。最终研究显示连翁止痢颗粒对大肠杆菌的抑菌圈直径平均为8.7 mm，MIC值为166.7 mg/mL，对沙门氏菌的抑菌圈直径平均为10.3 mm，MIC值为175.0 mg/mL，这些结果表明其具有一定的抑菌作用，可能与其含大量生物碱类、多酚类和皂苷类成分有关[21]。
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连翁止痢颗粒安全性比较高，有一定的止泻、抗炎和抗菌作用，可以作为一种良好的治疗腹泻的药物进行开发。本次试验仍存在一定的局限性，试验周期仅为30 d，对于一些潜在的、长期的毒性反应还无法完全检测出来。此外，试验仅以Wistar大鼠和昆明小鼠作为研究对象，不同物种之间存在生理差异，将试验结果外推至其他动物或人类时需谨慎。后续研究可延长试验周期，进一步观察药物在更长时间内对机体的影响；同时增加不同物种的试验，扩大研究范围，更全面地评估连翁止痢颗粒的安全性。