本试验方案经西南大学动物伦理委员会批准(批准号：SWU-20143003)。

随机选取由6头健康荣昌母猪自然分娩的12头健康、体重相近(0.96±0.06 kg)的1日龄雌性仔猪。仔猪在获得初乳后随机分为BF组(n=6)和FF组(n=6)。BF组自然吸取母乳，FF组饲喂以牛奶为基础的配方奶粉，其具体营养组成见表 1。配方奶粉需与40 ℃温水按1∶6的比例进行均匀混合，每天在6：00至21：00之间每小时饲喂1次。所有仔猪均处于相同环境中(温度：31.5±2.45 ℃；湿度：65.16%±3.93%)，自由饮水且禁喂固体饲料，严格执行标准免疫程序。仔猪于30日龄断奶后继续按NRC(2012)猪营养标准在相同的环境下进行饲喂，自由采食和饮水。

在210日龄时，使用真空采血管(不含抗凝剂)采集已禁食12 h的猪前腔静脉血液15 mL，静止10 min后3 500 r/min常温离心10 min，取上清液待测。然后，对猪进行麻醉处理(戊巴比妥钠：40 mg/kg)，屠宰后立即采集肝脏样本，并将每2个样本合并为1个，于液氮中极速冷冻后在-80 ℃保存备用。

生长性能指标(30日龄断奶重；210日龄末重)及平均日增重(Average Daily Gain，ADG)的测定，以及肝脏代谢相关血清指标[谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase，ALT)；谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase，AST)；谷氨酰氨基转移酶(Gamma-Glutamyl Transferase，GGT)；碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)；TC；TG；高密度脂蛋白(High-Density Lipoprotein，HDL)；低密度脂蛋白(Low-Density Lipoprotein，LDL)]的测定，均来自于本团队之前基于相同个体的研究^{[12, 14-15]}。

采用TRIzol法提取肝脏总RNA，并使用NanoDrop 2000和Bioanalyzer 2100对其质量浓度和完整性进行质检，合格后[总RNA质量浓度为872.67±115.46 ng/μL；RNA完整性系数(RNA Integrity Number，RIN)为8.5±0.3]用以构建文库。miRNA文库构建流程为：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE)富集18~30 nt的RNA，连接到具有独特分子标识退火的腺苷酸化3'端接头，然后连接5'端接头，将连接产物经PCR反应逆转录为互补DNA(complementary DNA，cDNA)并进行适当扩增，在PAGE上获得长度为110~130 bp的PCR产物，通过夹板寡核苷酸序列进行热变性和环化。mRNA文库构建流程为：利用oligo磁珠从总RNA中富集mRNA，并用MGIEasy rRNA kit去除核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)，在高温下使用二价阳离子将mRNA片段化，并使用逆转录酶和随机引物将其逆转录合成第一链cDNA，然后使用DNA聚合酶I和核糖核酸酶H(RNase H)与脱氧尿苷三磷酸(Deoxyuridine Triphosphate，dUTP)合成第二链cDNA，将cDNA片段与“A”碱基和测序适配器连接，利用PCR富集产物，通过夹板寡核苷酸序列进行热变性和环化反应完成文库构建。最终，使用Illumina HiSeq 2500对构建的文库进行测序。

对于mRNA测序数据，使用SOAPnuke过滤原始测序序列(reads)以获得高质量的有效序列(clean reads)，比如去除接头和低质量reads等，分别利用HISAT和StringTie软件将clean reads与猪参考基因组进行比对和组装转录本，结合GTF注释文件计算基因表达量，以每百万转录本(Transcripts Per Million，TPM)进行标准化。对于miRNA测序数据，使用SOAPnuke去除低质量标签(tags)、具有5'引物污染物和poly A的tags、无3'引物和插入片段的tags以及短于15 nt的tags以获得干净标签(clean tags)，然后利用Bowtie将clean tags映射到miRbase数据库，允许最多2个碱基的错配，同时，miRDeep2用于鉴定新型miRNA。

使用DESeq2(v1.24.0)进行差异表达miRNA(DEmG)和mRNA(DEG)筛选，标准为|log₂FC|≥1且p＜0.05，其中FC为差异倍数。然后，利用Targetscan、Miranda和miRDB分别预测DEmG的靶基因并取其交集(Overlapping Target Genes，OTG)。接下来，将OTG再与DEG取交集后使用Cytoscape绘制miRNA-mRNA互作网络图。利用DAVID数据库对基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析使用，p值采用Benjamini法进行校正，以校正后p＜0.05为显著富集。

整合BioGrid、InWeb_IM及OmniPath数据库并利用Metascape构建基因所对应的蛋白质互作网络，随后采用MCODE算法识别出网络中高度连接的功能模块，以挖掘出具有特定功能的分子复合体。最后，借助Cytoscape对构建的互作网络进行可视化呈现。

数据的统计分析使用SPSS 22.0(IBM Corporation，2014)进行Student's t-test，*表示差异具有统计学意义(p＜0.05)，所有数据以“平均值±标准差”表示。

本团队前期研究^{[12, 14-15]}指出，BF和FF猪的30日龄断奶重(BF猪为6.95±0.35 kg，FF猪为6.61±0.25 kg)无差异(p＞0.05)，而BF猪的210日龄末重显著高于FF猪(BF猪为80.23±2.56 kg，FF猪为71.02±2.92 kg，p＜0.05)，且其ADG也显著提高(p＜0.05)。此外，BF和FF猪的血清ALT和ALP水平在30和210日龄均表现出显著差异(p＜0.05)。

如表 2所示，测序共获得143.10 Mb原始miRNA序列(包含71.66 Mb的BF猪序列和71.44 Mb的FF猪序列)和689.64 Mb原始mRNA序列(包含344.82 Mb的BF猪序列和344.82 Mb的FF猪序列)，其中，miRNA和mRNA的有效序列分别为129.31 Mb(BF猪为64.97 Mb，FF猪为64.34 Mb)和681.70 Mb(BF猪为340.85 Mb，FF猪为340.84 Mb)，有效序列占比分别为90.36%(BF猪为90.62%，FF猪为90.10%)和98.85%(BF猪为98.85%，FF猪为98.85%)，碱基质量值Q20(Phred质量分值≥20，即碱基识别错误率≤1%)分别为98.67%(BF猪为98.70%，FF猪为98.63%)和97.34%(BF猪为97.29%，FF猪为97.40%)，与基因组的比对率分别为93.68%(BF猪为94.64%，FF猪为92.71%)和92.21%(BF猪为92.26%，FF猪为92.15%)。此外，miRNA有效序列长度主要分布在20~24 nt(BF猪为74.58%，FF猪为78.01%)，尤其是22 nt占比最高(BF猪为31.07%，FF猪为34.11%)。综上，测序数据质量可满足后续分析。

如图 1a所示，在测序数据中共鉴定出1 527个miRNA，包括348个已知miRNA和1 179个新发现的miRNA，其中共表达miRNA有1 114个(已知miRNA 331个，新发现miRNA 783个)，特异性表达miRNA有413个(BF猪组225个，FF猪组188个)。miRNA表达量在BF猪组内的相关系数为0.98，FF猪组内的相关系数为0.95，两组间的相关系数为0.93(图 1b)。此外，前20个高表达miRNA分别占BF和FF组总表达量的62.8%和63%，其中19个为共表达(图 1c和1d)。在mRNA层面，共鉴定出16 493个已知mRNA，其中特异性表达的mRNA有905个(BF猪组413个，FF猪组492个；图 1e)。mRNA表达量在BF猪组内的相关系数为0.98，FF猪组内的相关系数为0.96，两组间的相关系数为0.93(图 1f)。此外，前10个高表达mRNA分别占BF和FF组总表达量的31.35%和28.21%，其中共表达有7个(图 1g和1h)。

BF和FF组之间差异表达分析鉴定出476个DEG，其中上调364个，下调112个(图 2a)，DEG层级聚类分析显示所有个体根据处理聚集成独立簇群(图 2b)。其中23个差异倍数超过50(图 2c)。功能富集分析揭示DEG主要富集于脂质代谢、氧化应激和免疫反应通路(图 2d和图 2e)，且相关基因表达量在BF组显著高于FF组(p＜0.05；图 2f)。

BF和FF组之间鉴定出48个DEmG，其中19个上调，29个下调(图 3a)。DEmG层级聚类分析同样显示所有个体根据处理聚集成独立簇群(图 3b)，其中4个DEmG变异倍数超过5(图 3c)。DEmG靶基因富集在免疫通路、器官发育和甲状腺信号转导通路(图 3d和图 3e)，且通路中ssc-miR-216和ssc-miR-381-3p表达量在FF组显著上调(图 3f)。

对DEG进行蛋白质互作分析构建出5个功能模板(图 4a)，GO功能富集分析显示，这些模块主要富集于神经元引导、轴突导向和运动等生物学过程(图 4b)。比如，MCODE1蛋白互作网络主要参与肽受体活性、G蛋白偶联受体活性和神经活性配体-受体相互作用等过程(图 4c和4d)。

ssc-miR-218在DEmG中的表达量最高，且在FF组表达量显著降低(图 5a)。序列分析显示其种子序列在人、小鼠和牛等不同物种间高度保守(图 5b)。同时，其靶基因NAV3、EPHA7和KLHL29的靶位点在猪、人、小鼠上也高度保守(图 5c-5e)。进一步分析显示，与BF组相比，其靶基因NAV3、EPHA7和KLHL29表达量在FF组显著升高(图 5f)。值得注意的是，与EPHA7同家族的基因EPHA4和EPHA6表达量在FF组中也显著升高(图 5g)。

肝脏是机体多种代谢过程的枢纽，在能量稳态过程、氨基酸代谢、毒素和代谢物解毒以及免疫功能调节中发挥重要作用^[16]。前人研究指出，BF可降低ATP周转率，稳定肝脏能量代谢^[17]，并促进脂质代谢调节因子N-油酰乙醇胺的生成^[18]，而FF则提高碱性磷酸酶水平，增加单核细胞和嗜酸性粒细胞数量，加重肝脏代谢负荷，引起免疫功能异常^[9]。本团队前期研究^[14]指出，哺乳方式对猪30日龄断奶重无影响，但对30日龄和210日龄猪肝脏代谢相关的血清指标以及210日龄末重有显著影响，这表明哺乳方式对肝脏代谢的影响是即时发生并持续存在的，且这种影响最终会体现在后续生长发育表型上，其暗示了可能存在潜在的分子调控机制差异。母乳富含miRNA和mRNA等分子，在后代基因表达和信号传导等过程发挥积极作用^[19]，比如miR-378通过调节胰岛素信号通路来影响肝脏糖脂代谢^[20]，而miR-122则可调节肝脏细胞分化、损伤和代谢稳态^[21]。Baier等^[22]研究指出，后代从母乳中摄入的外泌体miRNA(如miR-29b)不足会引起肝脏KLF8基因表达量降低，且该效应无法通过内源性miRNA合成途径补偿，进而导致肝脏细胞增殖分化的正常进程受到影响。这表明，早期关键生长因子的缺乏可通过破坏肝脏基因的调控网络来对机体生长发育产生不可逆的长期影响。

本研究对210日龄BF与FF猪肝脏进行miRNA和mRNA测序鉴定出48个DEmG和476个DEG，其中4个DEmG差异倍数超过5，23个DEG的差异倍数超过50，表明这些分子在调控肝脏正常生理代谢过程中发挥着重要作用，其异常表达及相互作用可能参与脂肪肝、肝炎、肝纤维化，甚至肝癌等病变的发生和发展。比如，miR-218b^[23]家族、miR-381-3p^[24]和miR-216^[25]以及基因ABHD16B^[26]、MBOAT4^[27]、KLK7^[28]、CD177^[29]、PRRT3-AS1^[30]、PLCD4^[31]、CNKSR2^[32]、Trim63^[33-34]和DMRTA1^[35]。进一步分析显示DEG显著富集于脂质代谢、氧化应激和免疫反应通路，表明哺乳方式主要通过这些通路来影响肝脏的代谢功能。脂质代谢异常会导致肝脏积累脂肪酸和三酰甘油，引起脂肪肝并加剧胰岛素抵抗^[36]，其中基因CYP家族是胆固醇转化为胆酸的关键酶，参与胆固醇排泄和胆酸合成，影响脂肪乳化和吸收并调节胆固醇水平^[37]。本研究中，脂质代谢通路中的基因CYP3A46、CYP3A22和CYP2J34表达量在FF猪显著降低，提示FF猪肝脏易发生脂质代谢异常。肝脏因高度暴露于活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)而易发生氧化应激，破坏细胞内氧化还原平衡并损害肝脏功能，同时ROS会激活炎症反应，进而加剧氧化应激，形成恶性循环，最终导致免疫系统异常^[10]。本研究中，氧化应激通路中基因WNT1表达量在FF猪显著降低，其激活Wnt/β-连环蛋白信号通路的能力减弱，进而加剧氧化应激反应^[38]。基因TRPM8可促进巨噬细胞的抗炎和吞噬能力，有助于清除病原体等有害物质，在调控巨噬细胞的天然免疫反应中具有保护作用，对维持肝脏免疫稳态具有积极作用^[39]。基因ASIC1a具有促进巨噬细胞和小胶质细胞活化的作用^[40]。本研究中，免疫通路中的基因TRPM8和ASIC1a表达量在FF猪显著降低。综上，FF猪的抗氧化能力和免疫反应易发生异常，进而引起肝脏的损伤。此外，DEmG的靶基因则显著富集于免疫反应、肝脏发育和甲状腺信号转导通路。甲状腺激素会提高基因ATGL向脂滴的募集，以促进脂肪分解^[41]，还可上调肝脏细胞锌-α2-糖蛋白的表达，进而正反馈地促进甲状腺激素的脂解作用^[42]。甲状腺信号转导通路的抑制会引起肝脏脂质沉积，进而可能发展形成脂肪肝甚至非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)。研究已证实miR-216和miR-381-3p均可抑制肝脏发育和甲状腺信号转导通路，且miR-381-3p还可抑制免疫反应。本研究中，与BF猪相比，FF猪肝脏miR-216和miR-381-3p的表达显著上调，综合上述脂代谢、氧化应激以及免疫相关通路的基因表达变化，表明FF猪的肝脏在维持代谢稳态、抗氧化防御及免疫监视等功能上弱于BF猪。因此，FF猪肝脏处于更高的代谢紊乱风险之中，长期发展可能增加其肝脏病变的发生概率。

为了挖掘出更多的信息，互作网络分析显示DEG对应的蛋白质显著富集于神经信号传导和功能调控的相关通路，提示哺乳方式对神经系统的发育具有重要影响。同时，在DEmG中发现表达量最高的是miR-218，其靶基因EPHA7作为EPH受体酪氨酸激酶家族成员，在神经系统发育中发挥多效性调控作用，可促进神经元分化、引导轴突精准生长以建立正确神经连接^[43]。而且，EPHA受体还可通过调节Rho-GTP酶家族成员，如RhoA、Rac1和Cdc42，影响细胞骨架的动态变化，从而调节轴突的生长和导向^[42]。因此，EPHA家族对神经系统发育至关重要，比如EPHA4在神经元和神经干细胞中高表达，具有调控正常神经母细胞迁移以及空间组织和方向的作用^[44]。本研究中，与BF猪相比，FF猪的miR-218显著降低，基因EPHA4、EPHA6和EPHA7表达量显著升高，说明FF对猪肝脏神经系统的发育具有积极意义。此外，miR-218-5p表达降低可解除对靶基因ELOVL5的抑制，导致ELOVL5基因表达升高，进而提高肝脏合成n-3和n-6多不饱和脂肪酸的能力，而这类脂肪酸对神经系统的发育具有促进作用^[45]。除上述作用外，miR-218在肝脏发育，比如通过靶向降低基因PPP1CB和PPP2R5A的表达来抑制胆管细胞增殖^[46]，促进肝脏血窦内皮细胞增殖，进而提高肝脏再生能力^[47]，并与肝脏疾病，尤其是肝癌的发生密切相关。在肝癌患者中，其血清miR-218水平显著低于健康人群，其低表达水平与肿瘤大小、数目、血管浸润、Edmondson分级及TNM分期呈正相关关系^[48]。并且，miR-218表达水平的下调还会引起基因RETc和HoxA10表达升高，激活PTEN/AKT/PI3K通路，促进肝癌细胞的增殖生长^[49-50]。再次印证了前文指出的FF猪肝脏更易受到损伤的结果。

综上所述，BF猪在维持肝脏代谢稳态、抗氧化防御及免疫监视等方面表现出更强的功能基础，而FF猪肝脏则存在一定的功能缺陷，可能面临更高的代谢紊乱及肝脏病变风险，这主要与母乳与配方奶的组成差异相关。首先，母乳中的催乳素可抑制参与脂肪酸摄取的相关基因CD36以及脂肪酸合成相关基因SCD1表达，减少肝脏脂肪堆积^[51]，且还可通过CD36通路改善肝脏脂肪变性，比如NAFLD患者的血清催乳素浓度通常较低^[52]。其次，母乳中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶可清除体内过多的自由基，减轻氧化应激对细胞的损伤^[53]。此外，母乳中的乳铁蛋白可通过结合铁离子来抑制活性氧的形成，抑制氢过氧化物转化为羟基自由基，减轻氧化应激的损害，同时具有抗菌、抗病毒等作用，有助于增强机体免疫力^[54]。最后，母乳富含的免疫球蛋白、溶菌酶、细胞因子、母体白细胞等免疫因子，提供主动和被动保护，提高仔猪免疫力^[55]。FF则对猪肝脏神经系统的发育则有积极作用。一般来说，母乳中二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)含量易因母体膳食中相应脂肪酸的摄入量不足而缺乏，而配方奶中为了弥补这一点，其DHA含量高于母乳。江晨瑜^[56]的研究证实，母乳中DHA等多不饱和脂肪酸的相对含量仅为11.79%，而配方奶可达25.90%。DHA在神经发生和神经递质代谢调节等过程中具有关键作用^[57]，能促进神经元的增殖、分化和突起延伸，增加神经元的数量和复杂性，使神经网络更加丰富和发达^[58]。此外，DHA等n-3多不饱和脂肪酸可促进突触小泡蛋白、突触后密度蛋白等突触相关蛋白的表达，调节突触可塑性，对维持突触结构和功能的完整性具有重要意义^[58]。

本研究针对不同哺乳方式下的210日龄猪肝脏进行miRNA-mRNA联合测序，结果显示哺乳方式对猪肝脏脂质代谢、氧化应激、免疫功能和神经调节等方面具有显著影响。与BF猪相比，FF猪的肝脏脂质沉积、氧化应激与免疫反应能力存在不足，进而可能导致肝脏代谢异常和炎症损伤，但在神经系统发育方面具有一定的优势。此外，miRNA-mRNA网络分析揭示miR-218与基因EPHA家族之间的信号通路可能是哺乳方式引起肝脏代谢差异的关键分子机制。综合来看，本研究为初步理解母乳与配方奶对猪肝脏不同的影响提供了潜在的分子机制解释。