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新型杂环膦酸酯衍生物的合成与生物活性

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胡仕琴, 樊玲玲, 刘静姿, 等. 新型杂环膦酸酯衍生物的合成与生物活性[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2019, 41(8): 64-73. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.08.011
引用本文: 胡仕琴, 樊玲玲, 刘静姿, 等. 新型杂环膦酸酯衍生物的合成与生物活性[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2019, 41(8): 64-73. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.08.011
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Shi-qin HU, Ling-ling FAN, Jing-zi LIU, et al. Synthesis and Bioactivity of Novel Phosphate Derivatives Containing Heterocyclic Moieties[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2019, 41(8): 64-73. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.08.011
Citation: Shi-qin HU, Ling-ling FAN, Jing-zi LIU, et al. Synthesis and Bioactivity of Novel Phosphate Derivatives Containing Heterocyclic Moieties[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2019, 41(8): 64-73. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.08.011
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新型杂环膦酸酯衍生物的合成与生物活性

  • 贵州医科大学 药学院/贵州省药物制剂重点实验室/民族药与中药开发应用教育部工程研究中心, 贵阳 550004

  • 基金项目: 国家自然科学基金项目（81160385）；贵州省科技厅项目（黔科合SY字[2012]3103）；贵州省教育厅项目（黔省专合字[2012]89号）；贵阳医学院基金项目（YJ2014-17）
详细信息
    作者简介:

    胡仕琴(1991-), 女, 硕士研究生, 主要从事药物合成的研究 .

    通讯作者: 刘静姿, 博士, 教授; 

  • 中图分类号: O626

Synthesis and Bioactivity of Novel Phosphate Derivatives Containing Heterocyclic Moieties

  • School of Pharmacy, Guizhou Medical University/Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics/Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic, Guizhou Medicine and TCM, Ministry of Education, Guiyang 550004, China

  • 摘要: 为了获得广谱、高效的活性先导物，我们在前期研究工作的基础上，结合药物设计原理，采用简便方法合成了一系列新型杂环膦酸酯衍生物，其结构经IR，（1H，13C，31P，19F）NMR和HRMS（ESI）等确证与表征.生物活性测试结果表明，部分化合物具有抗大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌及金黄色葡萄球菌等活性，尤其是化合物A4，A8，A22，A24，A27和A28抗菌活性好，与对照药剂氨苄西林（Ampicillin）的MIC接近或相当.同时，发现部分化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，其中化合物A24和A28分别对人结肠癌细胞HT29和人肺癌细胞A549的IC50为18.0±0.7 μmol/L和17.1±1.3 μmol/L，接近对照药SAHA（IC50分别为14.3±1.1 μmol/L和12.5±1.8 μmol/L）.在此基础上研究其构效关系，对进一步结构改造与优化具有十分重要的意义.
    Abstract: In order to obtain broad-spectrum and highly effective bioactivity lead compounds, a series of novel phosphonate derivatives containing heterocyclic moieties were synthesized with a simple method based on our preliminary research and combined with the drug design principle. Their structures were confirmed and characterized by IR, (1H, 13C, 31P and 19F) NMR and HRMS (ESI). A test of their bioactivity showed that some compounds had antibacterial activity against E. coli, P. aeruginosa, S. aureus and MRSA (Methicillin-resistant S. aureus) in some degree. Compounds A4, A8, A22, A24, A27 and A28 had a good antibacterial activity close or equal to that of the control agent Ampicillin. At the same time, it was found that compounds A24 and A28 had antitumor activity against tumor cell HT29 and human lung cancer cell A549, their IC50 being 18.0±0.7 μmol/L and 17.1±1.3 μmol/L, respectively, which was close to that of the control drug SAHA, whose IC50 was 14.3±1.1 μmol/L and 12.5±1.8 μmol/L, respectively. Further SAR (structure-activity relationship) studies based on our present results will be of significance for the structural modification and optimization of these compounds.
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  • 图 1  目标化合物A1-A28的合成

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    图 2  目标化合物结构通式

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    图 3  化合物结构与活性关系(SAR)

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    表 1  目标化合物的取代基及相关物理数据

    化合物 取代基 性状 产率/ % 熔点/ ℃
    R1 R2 R3
    A1 H Et 3-呋喃基 浅黄色固体 82 145~150
    A2 H iPr 3-呋喃基 浅黄色固体 82 137~138
    A3 F Et 3-呋喃基 浅黄色固体 72 183~185
    A4 F iPr 3-呋喃基 浅黄色固体 74 135~136
    A5 H Et 3-噻吩基 白色固体 85 110~112
    A6 H iPr 3-噻吩基 白色固体 83 137~138
    A7 F Et 3-噻吩基 白色固体 80 101~102
    A8 F iPr 3-噻吩基 白色固体 77 126~127
    A9 H Et 3-吡啶基 白色固体 87 204~205
    A10 H iPr 3-吡啶基 浅黄色固体 84 119~120
    A11 F Et 3-吡啶基 浅黄色固体 80 113~114
    A12 F iPr 3-吡啶基 浅黄色固体 83 135~136
    A13 H Et 6'-甲基-3-吡啶基 白色固体 88 148~149
    A14 H iPr 6'-甲基-3-吡啶基 白色固体 81 170~171
    A15 F Et 6'-甲基-3-吡啶基 浅黄色固体 71 124~125
    A16 F iPr 6'-甲基-3-吡啶基 浅黄色固体 78 143~144
    A17 H Et E-3-吡啶丙烯基 浅黄色固体 93 129~130
    A18 H iPr E-3-吡啶丙烯基 白色固体 95 177~178
    A19 F Et E-3-吡啶丙烯基 白色固体 86 144~145
    A20 F iPr E-3-吡啶丙烯基 浅黄色固体 83 127~129
    A21 H Et 6-喹啉基 白色固体 86 138~139
    A22 H iPr 6-喹啉基 白色固体 89 187~188
    A23 F Et 6-喹啉基 浅黄色固体 80 162~163
    A24 F iPr 6-喹啉基 浅黄色固体 72 143~144
    A25 H Et (1H)-3-吲哚基 白色固体 79 203~204
    A26 H iPr (1H)-3-吲哚基 浅黄色固体 81 219~220
    A27 F Et (1H)-3-吲哚基 白色固体 76 195~197
    A28 F iPr (1H)-3-吲哚基 白色固体 73 212~213
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    表 2  不同催化剂及其物质的量对产物A1收率的影响

    编号 催化剂与中间体4a用量比/mmol 催化剂
    (C4H9)4NBr DIPEA DCC DMAP
    1 0.5:1 - - - -
    2 1.0:1 - - - -
    3 1.5:1 - - - -
    4 2.0:1 34.6 40.3 - 33.2
    5 2.5:1 37.1 41.2 36.9
    注“-”表示产物点增加不明显，未分离.
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    表 3  不同溶剂、反应温度及反应时间对产物A1收率的影响

    编号 温度/℃ 时间/h 溶剂
    CH2Cl2 CH3COCH3 THF THF* CH3CN C6H5CH3
    1 15~20 ℃ 2 - - - - - -
    2 保持微沸腾 2 43.2 35.4 50.8 - 47.5 39.1
    3 保持微沸腾 3 - - - - - -
    4 保持微沸腾 4 - - 67.4 - - -
    5 保持微沸腾 5 70.5 62.9 79.7 82.3 67.2 51.0
    6 保持微沸腾 6 73.3 - 80.4 81.3 - -
    7 保持微沸腾 7 74.6 - 75.1 - - -
    注：溶剂沸点：CH2Cl2(39.8 ℃)，CH3COCH3(56 ℃)，THF(66 ℃)，CH3CN(81 ℃)，C6H5CH3(110 ℃)；THF*为干燥处理.
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    表 4  目标物对不同细菌的最低抑菌浓度MIC值

    /(mg·mL-1)
    化合物 R1 R2 R3 MIC/(mg·mL-1)
    E.coli P.aeruginosa S.aureus N-E.coli N-P.aeruginosa MRSA
    A1 H Et 16 8 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A2 H iPr 4 8 4 16 ＞16 ＞16
    A3 F Et 8 8 16 16 ＞16 ＞16
    A4 F iPr 1 2 4 16 16 8
    A5 H Et 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A6 H iPr 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A7 F Et 16 8 16 ＞16 16 ＞16
    A8 F iPr 1 4 4 8 8 16
    A9 H Et 16 16 8 ＞16 ＞16 ＞16
    A10 H iPr 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A11 F Et 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A12 F iPr 16 8 8 ＞16 16 16
    A13 H Et 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A14 H iPr 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A15 F Et 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A16 F iPr 16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A17 H Et ＞16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A18 H iPr ＞16 16 16 ＞16 ＞16 ＞16
    A19 F Et ＞16 16 8 ＞16 ＞16 16
    A20 F iPr 16 16 16 ＞16 ＞16 16
    A21 H Et 16 8 4 ＞16 16 16
    A22 H iPr 2 1 8 16 ＞16 16
    A23 F Et 8 16 16 16 16 ＞16
    A24 F iPr 1 8 16 4 8 16
    A25 H Et 8 4 16 16 16 16
    A26 H iPr 4 16 8 16 8 8
    A27 F Et 2 1 1 8 8 4
    A28 F iPr 0.25 0.5 4 8 4 8
    氨苄西林 0.1 0.05 0.1 2 1 2
    注：细菌溶液浓度为1×106 CFU/mL，化合物质量浓度为160 mg/mL.
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    表 5  目标化合物对肿瘤细胞抑制活性

    化合物 抑制率/% 化合物 抑制率/%
    A549 HT29 HK2 A549 HT29 HK2
    A1 20.2±2.3 13.0±3.0 11.3±1.2 A15 16.5±0.7 31.5±11.3 14.3±2.4
    A2 16.4±4.2 15.1±1.5 16.5±0.8 A16 24.4±6.8 73.9±1.4 11.6±0.6
    A3 19.9±7.3 10.4±3.4 17.1±3.9 A17 7.4±2.7 31.6±6.2 12.6±3.0
    A4 19.2±5.5 11.8±2.7 12.8±1.0 A18 8.7±1.2 36.9±5.8 14.7±1.5
    A5 15.7±5.2 25.4±2.0 15.5±3.6 A19 11.1±1.6 39.5±4.3 18.3±9.4
    A6 19.2±3.3 22.4±3.7 17.4±8.4 A20 10.8±0.2 41.3±3.7 17.6±7.7
    A7 25.9±2.1 28.3±3.1 19.5±7.4 A21 31.0±11.9 31.2±2.6 19.7±8.6
    A8 26.5±3.2. 20.7±2.2 10.8±9.7 A22 35.2±7.6 37.5±4.0 28.5±3.1
    A9 10.0±1.4 23.1±1.8 11.1±2.6 A23 36.0±13.2 40.8±5.1 25.5±6.3
    A10 13.7±2.5 26.5±0.7 16.4±3.7 A24 43.6±8.2 78.1± 2.3 17.2±0.9
    A11 16.5±2.2 33.7±3.1 15.9±3.0 A25 33.9±6.4 32.3±9.1 18.4±3.2
    A12 17.9±2.4 46.7±11.2 17.8±3.2 A26 32.7±9.3 41.1±8.6 14.2±4.1
    A13 22.3±5.9 38.7±8.3 18.5±2.8 A27 45.3±4.1 43.8±2.3 13.6±1.5
    A14 25.7±2.1 43.6±10.6 18.8±8.1 A28 76.9±3.2 69.6±0.2 16.4±6.8
    SAHA 81.6±11.7 82.8±7.3 78.2±13.6
    注：采用MTS比色法试验；A549为人肺癌细胞；HT29为人结肠癌细胞；HK20为人肾小管正常细胞；SAHA为阳性对照药.
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    表 6  化合物A16，A24和A28抗A549，HT29，HK2细胞IC50

    化合物 IC50/(μmol·L-1)
    A549 HT29 HK2
    A16 - 36.2±1.2 130.9±0.7
    A24 - 18.0±0.7 124.7±1.3
    A28 17.1±1.3 34.6±0.9 126.8±2.4
    SAHA 12.5±1.8 14.3±1.1 33.7±1.2
    注：IC50值表示50%细胞存活浓度.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-10
  • 刊出日期:  2019-08-20

新型杂环膦酸酯衍生物的合成与生物活性

    通讯作者: 刘静姿, 博士, 教授; 
    作者简介: 胡仕琴(1991-), 女, 硕士研究生, 主要从事药物合成的研究
  • 贵州医科大学 药学院/贵州省药物制剂重点实验室/民族药与中药开发应用教育部工程研究中心, 贵阳 550004
  • 收稿日期:  2019-04-10
基金项目:  国家自然科学基金项目（81160385）；贵州省科技厅项目（黔科合SY字[2012]3103）；贵州省教育厅项目（黔省专合字[2012]89号）；贵阳医学院基金项目（YJ2014-17）

摘要: 为了获得广谱、高效的活性先导物，我们在前期研究工作的基础上，结合药物设计原理，采用简便方法合成了一系列新型杂环膦酸酯衍生物，其结构经IR，（1H，13C，31P，19F）NMR和HRMS（ESI）等确证与表征.生物活性测试结果表明，部分化合物具有抗大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌及金黄色葡萄球菌等活性，尤其是化合物A4，A8，A22，A24，A27和A28抗菌活性好，与对照药剂氨苄西林（Ampicillin）的MIC接近或相当.同时，发现部分化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，其中化合物A24和A28分别对人结肠癌细胞HT29和人肺癌细胞A549的IC50为18.0±0.7 μmol/L和17.1±1.3 μmol/L，接近对照药SAHA（IC50分别为14.3±1.1 μmol/L和12.5±1.8 μmol/L）.在此基础上研究其构效关系，对进一步结构改造与优化具有十分重要的意义.

English Abstract

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  • 杂环化合物因其具有种类繁多、结构多样和生物活性广泛等特点，不仅普遍存在于天然药物分子中，同时在人工合成化学药物中也被广泛应用[1-2].据统计，目前临床使用的90%以上的药物为杂环化合物，因此，从大量的杂环化合物中寻找具有高疗效、低毒性、容易获得的候选物仍然是当前新药研发的热点之一[3-4].另一方面，含磷化合物广泛的生物活性及多变的结构类型一直受到人们的关注，许多天然产物药物分子以及合成药物都含有磷原子.近年来本课题组先后设计合成一系列含膦酸酯、膦酰基、硫脲膦酸酯类化合物，发现不同系列化合物表现出抗病毒[5-8]、抗肿瘤[9-12]、杀菌[13-14]等生物活性.其中α-氨基膦酸酯，作为天然氨基酸的含磷类似物，已成为有机磷化学发展的重要组成部分，在药物合成中扮演着重要的角色，是一些药物合成的关键中间体.人们通过对其合成方法[15-17]与生物活性[18-21]的研究，发现其对肾素合成酶、HIV酶、FPT酶、EPSP合成酶及高血压蛋白原酶等具有抑制作用[15, 17-18]，从而表现出多种重要的生理活性，广泛应用于医药和农药领域.由此，为了拓宽化合物生物活性并寻找到高活性先导物，基于前期的研究工作[7-13]，我们将不同杂环引入氨基膦酸酯中，并优化反应条件，合成了一系列新型杂环膦酸酯衍生物28个，其结构均经IR，(2H，13C，31P，19F)NMR和HRMS(ESI)等确证与表征，合成路线见图 1.生物活性测试结果表明，部分化合物具有抗大肠杆菌、绿脓杆菌或金黄色葡萄球菌等活性；同时，发现化合物A16，A24，A28对肿瘤细胞的抑制活性较好，与对照药剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)接近.在此基础上研究其构效关系，对进一步结构改造与优化具有十分重要的意义.

1.   实验部分

    1.1.   仪器与试剂

  • B11-1型磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；N-110型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；X-4型显微熔点测定仪，上海易测仪器设备有限公司；Shimadzu IR Prestige-21型傅立叶红外光谱测定，日本岛津公司(KBr压片法)；JEOLECX400型400 MHz核磁共振仪，日本电子株式会社(TMS为内标，CDCl3或DMSO-d6为溶剂)；UPLC-QTOF Xevo G2-XS电喷雾四级杆串联飞行时间质谱仪，美国沃特世公司.所用试剂均为市售AR或CP级，使用前经常规方法处理.

    • 1.2.   化合物的合成

    1.2.1.   中间体4的合成

  • 参考文献[6-7, 22]方法合成中间体4，其理化数据与文献报道相符，合成路线见图 1.

    • 1.2.2.   目标物A的合成

  • 在50 mL三口瓶中加入0.5 mmol杂环甲酸化合物(固体)，用5 mL无水干燥THF溶解后加O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU 0.5 mmol，1eq)，混合均匀后再加催化剂N-N-二异丙基乙胺(DIPEA 1 mmol，2eq)及中间体4(0.5 mmol).在油浴加热保持微沸腾(66 ℃左右)中回流并搅拌反应，底物由浑浊变为澄清，以TLC跟踪反应5~6 h后停止反应.粗产物经薄层色谱(CH2Cl2/C2H5OH/NH3·H2O为10/1/0.1)分离纯化得到目标产物A1-A28，合成路线见图 1，结构通式见图 2，取代基、产率与熔点结果见表 1.

    • 1.2.3.   部分目标化合物A的核磁、高分辨质谱数据

  • O，O'-二异丙基-α-(4-氟苯基)-α-(3-呋喃甲酰胺基)甲膦酸酯(A4)：2H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.01(s，1H，NH)，7.57~7.35(m，4H，ArH)，6.98(t，J=8.2Hz，2H，ArH)，6.73(s，1H，ArH)，5.61(dd，J=21.9，9.4Hz，1H，NCH-P)，4.72~4.46(m，2H，2CH)，1.31(d，J=6.1Hz，3H，CH3)，1.27~1.22(m，6H，2CH3)，0.92(d，J=6.1Hz，3H，CH3)；13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ：162.1，145.4，143.7，131.6，130.4，130.3，130.3，122.0，115.6，115.4，108.7，72.6，72.5，49.2，24.3，24.2，23.9，23.2；19F NMR(376 MHz，CDCl3)δ：-113.9 mg/kg；31P NMR(162 MHz，CDCl3)δ：20.3 mg/kg；HRMS(ESI) C18H23FNO5P[M+H]+理论值：384.137 9，实际值：384.137 6.

    O，O'-二异丙基-α-(4-氟苯基)-α-(6-甲基-3-吡啶甲酰胺基)甲膦酸酯(A16)：2H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.94(s，1H，ArH)，8.33~8.18(m，1H，ArH)，7.99(dd，J=8.1，1.5Hz，1H，NH)，7.66~7.44(m，2H，ArH)，7.10(d，J=8.0Hz，1H，ArH)，6.95(t，J=8.1Hz，2H，ArH)，5.64(dd，J=21.8，9.2Hz，1H，NCH-P)，4.76~4.38(m，2H，2CH)，2.53(d，J=1.2Hz，3H，CH3)，1.27(dd，J=6.1，1.3Hz，3H，CH3)，1.24~0.86(m，9H，3CH3)；13C NM(101 MHz，CDCl3)δ：165.6，161.9，148.3，135.7，131.4，130.5，130.4，130.3，126.9，122.8，115.6，115.4，72.6，72.6，49.7，24.6，24.3.19F NMR(376 MHz，CDCl3)δ：-113.8 mg/kg；31P NMR(162 MHz，CDCl3)δ：19.9 mg/kg；HRMS(ESI) C20H26FN2O4P[M+H]+理论值：409.168 9，实际值：409.169 2.

    O，O'-二异丙基-α-苯基-α-(6-喹啉甲酰胺基)甲膦酸酯(A22)：2H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.96(dd，J=4.2，1.7Hz，1H，ArH)，8.34(d，J=1.6Hz，1H，ArH)，8.19~8.15(m，1H ArH)，8.13~8.10(m，2H ArH，NH)，7.87(dd，J=9.1，4.5Hz，1H，ArH)，7.62~7.57(m，2H，ArH)，7.44(dd，J=8.3，4.2Hz，1H，ArH)，7.36~7.27(m，3H，ArH)，5.77~5.67(m，1H，NCH-P)，4.782~4.34(m，2H，2CH)，1.31(d，J=6.2Hz，3H，CH3)，1.25(d，J=6.2Hz，3H，CH3)，1.19(d，J=6.2Hz，3H，CH3)，0.83(d，J=6.2Hz，3H，CH3)；13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ：166.4，152.1，149.4，137.3，135.6，132.0，129.9，128.7，128.7，128.7，128.6，128.3，128.3，128.1，127.7，127.6，122.0，72.7，50.7，24.3；31P NMR(162 MHz，CDCl3)δ：20.4 mg/kg；HRMS(ESI) C23H27N2O4P[M+H]+理论值：427.177 8，实际值：427.178 7.

    O，O'-二异丙基-α-(4-氟苯基)-α-(6-喹啉甲酰胺基)甲膦酸酯(A24)：2H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.97~8.93(m，1H，ArH)，8.34(s，1H，ArH)，8.12(m，4H，ArH，NH)，7.63~7.43(m，3H，ArH)，7.00(dd，J=12.1，4.8Hz，2H，ArH)，5.77~5.66(m，1H，NCH-P)，4.76~4.37(m，2H，2CH)，1.28(dd，J=6.2，1.6Hz，3H，CH3)，1.21(m，6H，2CH3)，0.88(dd，J=6.2，1.3Hz，3H，CH3)；13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ：166.6，152.1，149.3，137.3，131.9，131.6，131.5，130.5，130.4，129.8，128.3，127.6，122.0，115.7，115.5，72.7，72.6，49.9，24.3；19F NMR(376 MHz，CDCl3)δ：-113.6 mg/kg；31P NMR(162 MHz，CDCl3)δ：20.0 mg/kg；HRMS(ESI) C23H26FN2O4P[M+H]+理论值：445.169 8，实际值：445.169 2.

    O，O'-二乙基-α-(4-氟苯基)-α-(3-吲哚甲酰胺基)甲膦酸酯(A27)：2H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：9.60(s，1H，ArH)，8.04(d，J=7.4Hz，1H，NH)，7.78(s，1H，ArH)，7.50(d，J=6.7Hz，2H，ArH)，7.34 (d，J=7.6Hz，1H，ArH)，7.28~7.09(m，3H，ArH)，7.00(t，J=8.0Hz，2H，ArH)，5.77(dd，J=21.2，9.0Hz，1H，NCH-P)，4.20~3.75(m，4H，2CH2)，1.28~1.13 (m，6H，2CH3)；13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ：164.8，161.3，136.5，131.4，130.0，129.8，128.9，124.9，123.1，122.0，115.9，115.6，112.3，111.0，63.8，48.6，16.5，16.3；19F NMR(376 MHz，CDCl3)δ：-113.7 mg/kg；31P NMR(162 MHz，CDCl3)δ：23.0 mg/kg；HRMS(ESI) C20H22FN2O4P[M+H]+理论值：405.137 5，实际值：405.137 9.

    O，O'-二异丙基-α-(4-氟苯基)-α-(3-吲哚甲酰胺基)甲膦酸酯(A28)：2HNMR(400 MHz，DMSO)δ：9.56(s，1H，ArH)，8.03(d，J=7.0Hz，1H，NH)，7.76(s，1H，ArH)，7.50(d，J=6.8Hz，2H，ArH)，7.37(d，J=7.5Hz，1H，ArH)，7.30~7.17(m，3H，ArH)，7.00(t，J=7.9Hz，3H，ArH)，5.67(dd，J=21.3，8.5Hz，1H，NCH-P)，4.73~4.51(m，2H，2CH)，1.38~0.91(m，12H，4CH3)；13C NMR(101 MHz，DMSO)δ：163.2，161.3，136.5，132.0，130.1，128.6，124.8，123.1，120.0，115.7，112.1，111.6，72.6，72.2，49.3，24.3，23.9，23.3；19F NMR(376 MHz，DMSO)δ：-114.1 mg/kg；31P NMR (162 MHz，DMSO)δ：20.9 mg/kg；HRMS(ESI) C22H26FN2O4P[M+H]+理论值：433.169 1，实际值：433.169 2.

2.   生物活性测试

    2.1.   细菌活性测试

    2.1.1.   实验材料

  • 供试菌及来源：普通标准菌株大肠杆菌E.coli(ATCC25922)，铜绿假单胞杆菌P.aeruginosa (ATCC9027)，金黄色葡萄球菌S.aureus(ATCC6538)来源于广东省微生物保藏中心；多重耐药性细菌：N-E.coli-耐药性大肠杆菌(20151027074)，N-P.aeruginosa-耐药性铜绿假单胞杆菌(20151025026)，MRSA-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(20151027077)，均于贵州医科大学附属医院临床分离.

    培养基：肉汤MH(B).对照药：氨苄西林(Ampicillin).

    • 2.1.2.   实验操作

  • MIC测定，细菌培养基的制备：MH(B)营养肉汤分装后于121 ℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min.实验菌液的制备：以比浊管调整菌液浓度为1×106CFU/mL.微量稀释法：参照NCCLS标准采用微量稀释法进行.生物安全柜使用前紫外灭菌30min.在96孔板第1行中用移液枪加入20 μL药液与180 μL培养基MH(B)并混匀，2~6行每孔加入100 μL，从第1行中吸取100 μL加入第2行并混匀，以此类推，加到第6行，最后吸取100 μL打到废液中，得到2，4，8，16，32，64倍稀释的药物.第7行每孔加入氨苄西林10 μL+90 μL培养基作为阳性对照，第8行直接加入菌液作为阴性对照，同时设立药物稀释浓度梯度和培养基作为空白对照.加入菌液100 μL，37 ℃培养24 h后取出观察.将96孔板放在黑色背衬下观察，孔底呈圆点样的混浊沉淀为细菌生长，孔内液体不显混浊疑似细菌生长被抑制，每个化合物及阳性对照重复3次.实验操作见参考文献[23].

    • 2.2.   抗癌活性测试

    2.2.1.   实验材料

  • 细胞及来源：人肺癌细胞A549由贵州医科大学药学院本课题组前期保存；人结肠癌细胞HT29购于国家实验细胞资源共享服务平台；人肾小管正常细胞HK2购于上海复祥生物科技有限公司.

    培养基：RPMI-1640培养基(10%胎牛血清)，DMEM/F12培养基(10%血清).

    对照药：辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA).

    • 2.2.2.   实验操作

  • 按参考文献[24]采用MTS比色法对目标化合物A1-A28进行体外抗肿瘤活性测试.贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代.将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞数为5×104~1×105个/mL加于96孔培养板中，每孔100 μL，6个复孔，周围用PBS填充提供水分，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养. 12~24 h后，待细胞贴壁后，吸走旧的培养基，将待测化合物用DMSO溶解成所需的浓度，以培养基(10%胎牛血清)稀释成50 μmol/L，25 μmol/L，12.5 μmol/L，6.25 μmol/L，3.13 μmol/L，1.56 μmol/L的终浓度加入到相应的孔板中，每孔100 μL，并设置阳性对照与空白对照组(未经化合物处理的培养基).置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入5 μL MTS，继续于培养箱中培养3 h后，将96孔板于酶标仪(波长为490nm)中测试吸光度值(OD)，计算细胞抑制率及半抑制浓度IC50，实验重复3次.细胞抑制率计算公式如下：

    空白组：即未经化合物或阳性对照药处理；加药组：经化合物或阳性对照药处理.

3.   结果与讨论

    3.1.   合成条件优化

  • 结合前期工作[7, 9]及按照文献[9]方法，我们采用HBTU缩合剂，DIPEA为相转移催化剂，CH2Cl2为反应溶剂，在室温下搅拌反应24 h，产物A1收率仅为28.5%.可能是杂环羧酸酰化活性低、中间体4亲核力弱及空间位阻大等原因，加之反应时间长，副产物多，后处理及分离纯化十分困难.为了缩短反应时间，提高产物收率，我们以合成A1为例，考察不同催化剂及其用量，反应溶剂、温度、时间等参数对产物收率的影响，优化其合成条件.各反应参数对A1收率的影响如下：

    • 3.1.1.   催化剂及其用量对A1收率的影响

  • 在原料比为1:1(mmol)，设置反应温度50 ℃，反应时间为2 h，采用催化剂(C4H9)4NBr，溶剂5mL CH3CN，分别在催化剂与中间体4a(mmol)用量比为0.5:1，1.0:1，2.0:1，2.5:1的条件下制备目标产物A1.发现用量比为2.0:1和2.5:1时A1收率相对较高.为了提高产物收率，我们进一步考察了不同催化剂DIPEA，DCC，DMAP对A1收率的影响，实验结果见表 2.

    结果表明，DIPEA的催化效果最好，当用量比增至2.5:1时，产物收率增大的幅度极小，而DIPEA浪费较大，且过多DIPEA存在反应体系中不利于目标物的分离纯化，因此选择用量比为2.0:1.

    • 3.1.2.   溶剂、反应温度及反应时间对A1收率的影响

  • 在室温下，以催化剂DIPEA与中间体4a用量比为2:1，原料比为1:1(mmol)的条件下，分别溶于二氯甲烷(CH2Cl2)、四氢呋喃(THF)、乙腈(CH3COCH3)、丙酮(CH3CN)、甲苯(C6H5CH3)溶剂中搅拌反应体系2 h，TLC跟踪反应几乎无产物点.再分别保持各反应体系微沸腾回流并搅拌反应体系2 h制备目标产物，经分离纯化处理后，发现以THF为反应溶剂A1收率相对较高(50.8%).由此，我们进一步考察反应时间对A1收率的影响，实验结果见表 3.

    从表 3中看出：在THF(66 ℃)反应溶剂中，反应时间由2 h至7 h，A1收率从50.8%增加到80.4%，同时结合TLC显示，反应时间在6 h时副产物明显增加，不利于后处理纯化；延长反应至7 h产率反而降低，因此，确定5 h为最佳反应时间.同时，我们还重点考察对比5 h反应时间内不同溶剂回流状态及干燥THF溶液中A1收率对比；以及5~7 h内CH2Cl2与THF溶剂中A1收率对比.实验结果表明：用干燥处理的THF为反应溶剂，保持反应体系微沸腾(66 ℃)回流搅拌5 h获得A1收率为82.3%.

    • 3.2.   活性测试结果与讨论

    3.2.1.   抗菌活性

  • 以氨苄西林(Ampicillin)为阳性对照药，采用二倍稀释法对大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)及多重耐药菌：耐药大肠埃希菌(N-E.coli)、耐药性铜绿假单胞杆菌(N-P.aeruginosa)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)进行最低抑菌浓度MIC测试，实验结果见表 4.

    由表 4可知，部分化合物具有较好的抗菌活性，尤其对大肠杆菌(E.coli)及铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa)的抑制活性较明显，其中化合物A4，A8，A22，A24，A27，A28对E.coli的MIC分别为1，1，2，1，2，0.25mg/mL，与对照药氨苄西林(MIC=0.1mg/mL)接近或相当；A4，A22，A27，A28对P.aeruginosa的MIC分别为2，1，1，0.5 mg/mL，接近对照药的MIC.相比之下，大部分化合物对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和耐药菌不敏感，但化合物A27对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抑制效果较好，其MIC为4mg/mL，与对照药氨苄西林(MIC为2mg/mL)相当，其次是化合物A28对耐药性大肠杆菌(N-E.coli)、耐药性铜绿假单胞杆菌(N-P.aeruginosa)的MIC分别为8 mg/mL，4 mg/mL(阳性对照药分别为2，1 mg/mL).

    • 3.2.2.   抗癌活性

  • 以SAHA为阳性对照药，采用MTS比色法对人肺癌细胞(A549)，人结肠癌细胞(HT29)以及人肾小管正常细胞(HK2)进行体外抗癌活性测试，以化合物及阳性对照药(SAHA)浓度均为50 μmol/L进行初筛，实验结果见表 5.

    由表 5可知，部分化合物具有由中等至好的抗癌活性，其中化合物A16(R1=-F，R2=-iPr，R3=6-甲-3吡啶)抗肿瘤HT29的抑制率为73.9%；化合物A28(R1=-F，R2=-iPr，R3=(1H)-3-吲哚)抗肿瘤A549，HT29的抑制率分别为76.9%和69.6%，与对照药SAHA(抑制率81.6%，82.8%)接近；尤其是A24(R1=-F，R2=-iPr，R3=6-喹啉)抗HT29活性明显，抑制率为78.1%，与对照药抑制率接近.而化合物对人肾小管正常细胞(HK2)的抑制率为11.1%~28.5%.而对照药SAHA作用于HK2时存活率仅为22.8%，相比较之下，对照药SAHA对正常细胞(HK2)的损伤程度更大.整体来看，大多数化合物的抗肿瘤活性较差，但少数化合物对特定的肿瘤细胞显示不错的活性.

    我们进一步测试了化合物A16，A24和A28的IC50值，结果见表 6.实验结果表明，化合物A28对A549的抑制活性较好，其IC50值为17.1 μmol/L(对照药IC50为12.5 μmol/L)；化合物A24对HT29的IC50为18.0 μmol/L，与对照药IC50为14.1 μmol/L接近.化合物A24，A28对HK2IC50值均超过120 μmol/L(对照药IC50为33.7 μmol/L)，说明化合物对癌细胞有较好的抑制活性，并对人肾小管正常细胞的毒性较小.

    • 3.2.3.   结构与活性关系(SAR)

  • 从化合物结构与活性数据关系(SAR)分析来看(图 3)，当取代基R1=F，R2=Et或iPr，R3为呋喃、噻吩、喹啉或吲哚杂环时，大部分化合物抑制E.coli和P.aeruginosa的活性较明显.此外，当R1，R2不变，R3为喹啉或吲哚杂环时，部分化合物对肿瘤细胞A549和HT29的抑制活性较好.因此，对该类化合物进一步的结构改造与优化，为获得新型杂环膦酸酯抗菌、抗癌化合物单体，具有重要的理论和实验意义.

4.   结论

  • 通过反应条件优化合成了一系列新型杂环磷酸酯衍生物A1-A28，并测试了目标物生物活性.实验结果表明，部分化合物具有较好的抗菌、抗癌活性，如化合物A4，A22，A27，A28抗E.coli和P.aeruginosa抑制率与对照药氨苄西林(MIC=0.1mg/mL)接近或相当，尤其是化合物A27抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抑制效果明显.同时，化合物A24和A28抗肿瘤活性也明显，A24对HT29的IC50与对照药接近，A28对A549的IC50与对照药相当.值得注意的是，所有化合物对人肾小管正常细胞(HK2)的存活率超过70%，相比对正常细胞(HK2)的毒性弱于对照药SAHA，具有进一步的研究意义.

参考文献 (24)

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