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枣(ZiziPhus jujuba Mill.)是原产我国且独具特色优势的重要果树[1]，是一种以无性繁殖为主的树种.武隆猪腰枣因产自武隆、形似猪腰(猪肾)而得名，是重庆市目前唯一通过省级审定的适合南方栽培的早熟鲜食优良枣品种[2]，颇受消费者青睐，2011年荣获国家农产品地理标志认定[3]，种植面积逐年增加.但在生产上，由于长期采用根蘖繁殖，出现了株系之间良莠不齐、枣疯病频发和枣果变小等问题[2]；同时，猪腰枣花小、座果率低、胚败育率高，传统杂交育种难以实现种质创新.因此，品种的提纯复壮与改良，进而为生产上提供优质种苗，已成为猪腰枣产业可持续发展的关键所在.
组织培养是植物脱毒复壮和快繁种苗的有效手段.目前，红枣、金丝小枣和酸枣等枣属植物的组织培养已获成功[4]，而猪腰枣的研究基础十分薄弱，仅有其分布状况、品种特性、栽培技术、优良单株筛选和遗传多样性分析等方面的研究[2, 5-7]，尚无组织培养的相关报道.本试验开展了猪腰枣的组织培养研究，以期建立其离体再生体系，为猪腰枣的离体快速繁殖和品种改良奠定基础.
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试验材料为武隆猪腰枣(Zizyphus jujuba Mill. cv. Wulongzhuyaozao)枝条，采自西南大学果树学重点实验室种质资源圃.
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选取生长健壮、无病虫害的一年生枝条为试材.将采集的枝条，用0.1%洗涤剂溶液浸泡15 min，自来水洗净，剪成长约10 cm的枝段.无菌条件下，枝条去叶，剪取长1~2 cm的茎尖、带芽茎段和节间，幼叶剪成0.5×0.5 cm2 叶片.然后将茎尖、带芽茎段、节间和叶片等4种外植体分别用75%乙醇和0.1% HgCl2消毒不同时间(表 1)，无菌水冲洗4~5次，沥干后接种到1/2 MS培养基上培养.每个处理接种不同外植体10个，重复3次. 20 d后统计污染率和成活率，未被污染的外植体转入初代培养.
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预试验结果表明，带芽茎段在B5和MS基本培养基中比在1/2 MS培养基中萌芽慢、长势弱、愈伤少.因此，本试验初代培养中，以1/2 MS为基本培养基.初代培养基由1/2 MS添加不同浓度的BA、NAA和2，4-D组成(表 2).每个培养基接种茎尖等外植体各10个，重复3次. 30 d后统计愈伤组织诱导率(出愈率)、芽萌动率和不定芽再生率(再生率).
出愈率(%)=产生愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%
芽萌动率(%)=侧芽萌发的外植体数/成活的外植体数×100%
再生率(%)=愈伤组织产生不定芽的外植体数/接种外植体数×100%
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无菌条件下，将初代培养获得的不定芽幼茎(长1~2 cm)切成长0.5~1.0 cm的单个不定芽，分别接种到含不同浓度BA和IBA的MS培养基(表 3)培养.每个培养基接种不定芽10个，重复3次. 30 d(形成丛芽)后统计繁殖系数.
繁殖系数(倍)=分化产生的总芽数/接种外植体数
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无菌条件下，分离、切割丛芽.选取长势良好、长3~4 cm的健壮不定芽接入含不同浓度IBA及活性炭(AC)的1/2 MS培养基中(表 4).每个培养基接种不定芽10个，3次重复.培养30 d后统计生根率、平均根数和根长.
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将试管苗培养瓶从光照培养箱中取出，置于温度为25 ℃左右、相对湿度为70%~80%的实验室内，逐渐揭开封口炼苗5~7 d，随后洗净试管苗根部琼脂，移栽到盛蛭石和腐殖质土(体积比为1：1) 的营养钵中，30 d后统计成活率.
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培养基中添加蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L；培养温度为25±2 ℃，光照强度为2 500~2 600 lx(14 h/d)，相对湿度70%~80%.
采用SPSS 12.0软件对试验数据进行统计分析.
1.1. 材料
1.2. 方法
1.2.1. 外植体的表面消毒
1.2.2. 初代培养基的筛选
1.2.3. 不定芽继代培养基的筛选
1.2.4. 不定芽生根培养基的筛选
1.2.5. 试管苗的炼苗与移栽
1.2.6. 培养条件与数据处理
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采用不同浓度的表面消毒剂处理，随着消毒时间的延长，外植体的污染率降低，但成活率也随之降低(表 1).在不同消毒处理中，节间和茎尖外植体以75%乙醇10 s+0.1% HgCl2 8 min效果最好，成活率分别达90%和60%；带芽茎段以0.1% HgCl2 10 min、75%乙醇10 s+0.1% HgCl2 8 min或75%乙醇20 s+0.1% HgCl2 5 min效果最好，成活率达53.3%~66.7%；叶片以0.1% HgCl2 5 min和75%乙醇10 s+0.1% HgCl2 5 min效果最好，成活率达46.7%~56.7%.
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在不同初代培养基中，叶片外植体在转接2 d后开始大量黄化，10 d后全部死亡；茎尖15 d后全部死亡.而节间和带芽茎段培养30 d后能够产生愈伤组织和再生不定芽(表 2).其中，带芽茎段在1/2 MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA培养基中，侧芽萌动率达83.3%，且76.7%的外植体在切口或表皮产生大量愈伤组织，并有53.3%的外植体能由其愈伤组织再生不定芽.因此，猪腰枣组织培养的最佳外植体为带芽茎段，其适宜初代培养基为1/2 MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA.
在初代培养过程中，茎尖4 d后开始缢缩白化(图 1-a)，15 d后全部死亡；部分节间15 d后表皮和切口可形成大量愈伤，但未见不定芽的再生(表 2)；带芽茎段5 d左右侧芽开始萌动，15 d可长至2~3 cm(图 1-b，c)，部分外植体在表皮和切口形成大量愈伤，15 d左右开始抽生不定芽(图 1-d)，30 d后可长至1 cm左右(图 1-e，f).
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不定芽在继代培养过程中，7~10 d开始伸长，基部长出愈伤组织，15~20 d愈伤组织产生淡绿色芽点，并逐渐分化出不定芽，30 d形成明显丛芽.
1代(30 d)的继代培养表明，不同继代培养基之间不定芽的繁殖系数间差异极显著(p≤0.01)，丛芽生长状况存在差异(表 3).其中，以MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA培养基继代效果最好，平均繁殖系数达3.77，且不定芽生长健壮，叶色深绿(图 2-a).因此，猪腰枣不定芽继代培养的最佳培养基为MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA.
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将长3~4 cm的单个不定芽接种到生根培养基后，7~10 d不定芽基部开始产生不定根，30 d可达3 cm以上.
试验结果表明，生根培养基中IBA和AC含量对不定芽生根有显著影响(表 4).其中，1/2 MS+0.3 mg/L IBA+10 g/L AC培养基和1/2 MS+0.3 mg/L IBA培养基效果最好，生根率达90%~96.67%，不定根数量平均3条，不定根长度平均3.4 cm以上，但二者间差异不极显著(p＞0.01).因此，猪腰枣不定芽生根的适宜培养基为1/2 MS+0.3 mg/L IBA+10 g/L AC，或1/2 MS+0.3 mg/L IBA.
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经炼苗、洗苗后的试管苗移栽到营养钵后，30 d成活率达85%以上，生长正常.植株叶平展、色浓绿，株高增加，部分抽生新叶(图 2-d).
2.1. 外植体表面消毒
2.2. 初代培养基筛选
2.3. 不定芽继代培养基筛选
2.4. 不定芽生根培养基筛选
2.5. 试管苗炼苗及移栽
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枣树组织坚硬、生长量小、增粗缓慢，组织培养较为困难[8].近年来，枣树的组织培养及应用研究进展迅速.人们在30余个品种的无菌短枝扦插、近30个品种的器官发生、少数品种的体胚发生[4]、花药培养[9]、胚乳培养[10]、离体多倍体诱导[11-13]和人工种子[14]研究等方面均取得了可喜进展.随着枣全基因组测序的完成[15]，采用基因工程技术将加速枣的种质创新和新品种选育.而离体再生体系的建立是植物基因工程的基础与前体.目前，枣不同基因型、不同外植体的再生体系尚不稳定，培养基、培养条件需要优化.同时，通过外植体经愈伤组织直接再生植株的报道不多，这对提高枣的离体繁殖效率有一定限制.
同一植物中由于组织成熟度不同，脱分化能力也存在一定差异，一般越幼嫩的组织较成熟组织容易脱分化.因此，枣茎段培养时一般是取幼嫩茎段作外植体.枣的初代培养多采用MS培养基为基本培养基，而不同品种组织培养所需激素存在差异，灰枣的幼嫩茎段添加1.0 mg/L6-BA即可获得较高出愈率，俊枣却需要添加4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA[16].在猪腰枣的组织培养预试验中，1/2MS培养基培养效果较好，而在添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的条件下能获得较高出愈率及芽萌动率，与酸枣启动率相当(83.33%)[17]，高于贵妃枣(71.93%)[18].本试验中虽生根率可达90%以上，与金丝小枣的研究结果相同[19]，明显高于坛坛枣(75%)[20]，但增殖系数较金丝枣(4.5)[19]、梨枣(6.0)[21]、贵妃枣(9.3)[18]均较低.
本研究初步建立了猪腰枣的离体再生体系，获得了不同培养阶段的适宜培养基，这为猪腰枣的离体快繁、无毒苗繁殖和种质创新后续奠定了基础.但在本试验中，不定芽的再生率、继代培养代次(1代)和繁殖系数(3.77)还较低，不定芽诱导和继代培养基还需进一步筛选，培养条件还需优化，继代代次还需增加，以提高若干无性世代的平均繁殖系数和再生体系的繁殖效率.另外，本研究还发现，猪腰枣茎段可通过形成愈伤，再形成不定芽的方式进行增殖，在民勤小枣[22]及金丝小枣[23]上也有相同报道，该发生方式对于构建转化体系具有重要意义.
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