The Protective Effect of Zige Lyophilized Powder for Injection Against the Microvascular Contraction Function After Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury of Rats in the Microcirculation

Yuan-hong SHANG; Jin-feng TIAN; Qing LIU; Min WANG; Xiao-yu XU

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2017.06.004

Objective To investigate the protective effect of Zige lyophilized powder for injection against the microvascular contraction function after cerebral ischemia-reperfusion injury of rats. Methods It made a cerebral ischemia-reperfusion model using the line in the left middle cerebral artery occlusion (MCAO) of rats in ischemia for 2 h and reperfusion for l d, 4 d, 7 d and 14 d, the model of rats was established by intravenous injection of drugs. Nitric oxide synthase (NOS), endothelin-1(ET-1), 6-ketone-prostaglandin F_1α (6-Ke-to-PG-F_1α) and thromboxane B2 (TXB₂) content of the brain microvessel in the lateral ischemic cerebral cortex was detected by enzyme immunoassay kits. Results In reperfusion for 4, 7 and 14 d, compared with model group, Zige lyophilized powder groups (16.40 mg/kg, 32.70 mg/kg and 65.40 mg/kg) had reduced significantly the level of TNOS, iNOS, ET-1, TXB₂ and TXB₂/6-Ke-to-PGF_1α in microvessel of the lateral ischemic cerebral cortex (p < 0.01), and had increased significantly the level of significantly cNOS and 6-Ke-to-PGF_1α(p < 0.01). Conclusion Zige lyophilized powder for injection can improve the effect of cerebral microcirculation. Zige lyophilized powder can protect cerebral ischemia-reperfusion injury by improving the microvascular contraction function.

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脑微血管是脑微循环的主要组成部分和物质交换场所，也是脑缺血损伤的最敏感部位^[1].在急性脑缺血/再灌注(Focal cerebral ischemia-reperfusion injury，I/R)病理损伤过程中，作为脑微循环结构载体血管内皮细胞受损是发病的基本原因，并与疾病发展、转归密切相关^[2]，而血管舒缩功能异常，易发生脑微循环障碍，进而加重病情.

一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一种易扩散、半衰期短暂而活泼的气体，NO能激活脑血管平滑肌中的鸟苷酸环化酶，增加颗粒膜蛋白(Granule membrane protein，GMP)合成，引起脑血管舒张参与脑血流的调节^[3].内皮素是较强的缩血管物质，其中作为人体中只能产生的血管收缩剂内皮素-1 (endothelin-1，ET-1)，主要由血管内皮细胞产生，且存在于大脑、心血管系统中^[4].其通过自分泌和旁分泌方式作用于内皮细胞和平滑肌细胞，诱导一氧化氮和前列腺素的释放，调节血管管径，抵抗扩血管物质造成的血管扩张，从而降低脑微循环血流量.前列腺素I₂ (prostacyclin，PGI₂)主要在血管内皮细胞内生成，具有抑制血小板聚集、舒张血管的作用；血栓素A₂ (Throm-boxane，TXA₂)主要形成于血小板，可诱导血小板聚集，收缩动脉.二者互为拮抗，构成动态平衡.一旦二者平衡失调，可引起血小板黏附、聚集，血管痉挛、阻塞，循环灌流障碍^[5].由于PGI₂和TXA₂两者性质不稳定，易于转化成稳态的终产物6-酮-前列腺素F_1α(6-ketone-prostaglandin F_1α，6-Ke-to-PGF_1α)和血栓素B₂(Thromboxane B₂，TXB₂)，因此多以其终产物间接反映PGI₂和TXA₂水平^[6].

梓葛冻干粉针为课题组自主研制的治疗缺血性脑卒中的中药单体复方制剂，主要由葛根素和梓醇组成.课题组已对其改善气虚血瘀证、血脑屏障通透性及脑微循环障碍的作用^[7]等进行了研究，但该制剂对改善脑部微循环是否与脑微血管舒缩功能相关，尚未有实验性的报道.本实验旨在观察梓葛冻干粉针对大鼠脑微血管舒缩功能是否具有改善作用，并为梓葛冻干粉针的临床应用提供参考.

1. 材料与方法

1.1. 实验动物

SD大鼠320只，雄性，体质量280±25 g，SPF级，由重庆医科大学实验动物中心供应[合格证号：SCXK(渝)2007-0001]，于西南大学药学院SPF级实验动物中心饲养[许可证号：SYXK(渝)2009-0002].

1.2. 实验主要药品及试剂

梓葛冻干粉针，西南大学中药研究所；葛根素注射液，成都天台山制药有限公司；尼莫地平，德国拜耳医药保健有限公司；NOS(Nitric oxide synthase)测定试剂盒，南京建成生物技术有限公司；ET-1测定试剂盒，Bio-Swamp有限公司；6-Ke-to-PGF_1α酶联免疫试剂盒，Bio-Swamp有限公司；TXB₂酶联免疫分析试剂盒，Bio-Swamp有限公司；BCA蛋白试剂盒，北京碧云天公司；葡聚糖-40，瑞典Pharmacia公司.其他常规化学试剂均为分析纯，购自于成都科龙化工试剂厂.

1.3. 实验仪器

光学显微镜，成都太盟科技有限公司；UV3010紫外分光光度计，日立高新技术；EL2046型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；台式高速低温离心机，艾本德中国有限公司；UF3410超低温冰箱，基因有限公司；脑切片模具，深圳市瑞沃德生命科技有限公司.

1.4. 动物分组及给药

取雄性SD大鼠320只，随机分为假手术组、模型组、葛根素注射液组、尼莫地平组和梓葛冻干粉针3个剂量组.假手术组32只，其余各组48只动物，线栓法复制大鼠I/R模型^[8]，再灌注时即刻给药(再灌注0 h)，尾静脉注射给药，每天1次(10 mL/kg，体质量)，造模后有4个考察时间点(缺血2 h再灌注l d，4 d，7 d和14 d)，每个时间点各组取材8只造模成功动物，假手术组和模型组给同等体积的生理盐水.

1.5. 样品采集及操作

1) 制备脑微血管蛋白样品：参照文献方法^[9]，制备脑微血管蛋白样品.

2) 脑组织NOS，ET-1，TXB₂和6-Ke-to-PGF_1α质量分数测定；BCA法测定蛋白浓度测定；按照相应试剂盒说明书的步骤测定.

1.6. 统计学分析

实验数据统计分析使用SPSS 17.0软件进行，统计结果以(x±s)表示.对实验数据进行正态性和方差检验，再将各组间的比较采用单因素方差分析ANOVA的Tukey检验分析，以p＜0.05为差异有统计学意义.

3. 讨论

3.1. 梓葛冻干粉针具有抑制脑缺血/再灌注大鼠缺血侧脑皮质层TNOS，iNOS酶活力升高和cNOS酶活力降低的作用

梓葛冻干粉针16.40 mg/kg，32.70 mg/kg和65.40 mg/kg均能抑制TNOS，iNOS活力的升高和cNOS活力的降低，进而减少NO的生成，有对脑缺血保护的作用，其可能作用机制为通过抑制激活iNOS的细胞因子的释放量，进而影响了iNOS的活化，减少TNOS的生成，降低NO的细胞毒性作用，改善了脑微循环，减轻了脑缺血/再灌注的病变部位的损伤程度，与文献报道相一致^[10]；同时，其也有可能抑制cNOS活力的降低，使eNOS阳性细胞增多，加强eNOS产生的NO有神经保护作用，产生的少量NO与鸟苷酸环化酶结合，使cGMP增加，导致脑血管扩张和抑制血小板聚集，改善了缺血区的侧支循环，增加了半暗带的血液灌注.实验表明，NOS与大鼠局灶性脑缺血/再灌注的损伤关系非常密切，特别是脑皮层的微血管中的NOS活性变化在脑缺血损伤中出现早，影响大，脑组织中NOS的活性变化也参与了脑损伤的过程.

3.2. 梓葛冻干粉针降低脑缺血/再灌注大鼠缺血侧脑皮质层微血管中ET-1质量分数

本实验的研究结果表明，在考察相对应的时间点1，4，7和14 d，与假手术组比较，模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中ET-1质量分数均呈升高，而ET-1质量分数逐渐增多，可加剧缺血大脑血管收缩，加重组织缺血缺氧，且损伤大脑组织也导致细胞内钙超载，Ca²⁺内流使血管平滑肌收缩，形成恶性循环，进一步加重梗死区的微血管的损伤程度，这与文献报道相一致^{[11, 12]}.而梓葛冻干粉针16.40 mg/kg，32.70 mg/kg和65.40 mg/kg组均能抑制ET-1质量分数的升高，说明其对脑缺血/再灌注的损伤具有保护作用，其可能的作用机制为通过调节微血管管径，解除微血管痉挛，减轻血管内皮的损伤，使内皮细胞产生ET-1减少，从而发挥其对脑的保护作用.

3.3. 梓葛冻干粉针降低脑缺血/再灌注大鼠缺血侧脑皮质层微血管中TXB₂和6-Ke-to-PGF₁质量分数

本实验中在考察相对应的时间点1，4，7和14 d，梓葛冻干粉针16.40 mg/kg，32.70 mg/kg和65.40 mg/kg均能显著抑制大鼠脑缺血/再灌注引起的缺血侧脑皮质层微血管中TXB₂质量分数的升高；在脑缺血/再灌注1 d和4 d时，梓葛冻干粉针32.70 mg/kg和65.40 mg/kg能显著升高大鼠缺血侧脑皮质层微血管中6-Ke-to-PGF_1α质量分数；在脑缺血/再灌注7 d和14 d时，梓葛冻干粉针16.40 mg/kg，32.70 mg/kg和65.40 mg/kg均能显著升高大鼠缺血侧脑皮质层微血管中6-Ke-to-PGF_1α质量分数；同时，梓葛冻干粉针16.40 mg/kg，32.70 mg/kg和65.40 mg/kg也均能显著降低TXB₂/6-Ke-to-PGF₁比值.提示梓葛冻干粉针的作用机制可能是通过调节脑缺血/再灌注损伤时脑组织TXB₂和PGI₂平衡失调，抑制大鼠脑缺血/再灌注引起的缺血侧脑皮质层TXB₂质量分数的升高和6-Ke-to-PGF₁质量分数的降低，从而达到舒张血管和抑制血小板聚集、调节微血管管径、增加脑血流量、改善脑微循环、减轻脑组织损伤的作用.

Figure (2) Table (3) Reference (12)

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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