Influences of Elicitors on the Growth and Tropane Alkaloid Contents in the Hairy Roots of Atropa belladonna L.

本实验室保存在固体B5培养基的颠茄毛状根.

MJ，SA溶液的配制：将MJ，SA分别用无水乙醇助溶溶解后，再用蒸馏水定容，配制成20 μmol/L的母液，过0.22 μm滤膜除菌备用；AgNO₃溶液的配制：将AgNO₃用蒸馏水溶解定容，配制成100 μmol/L的母液，过0.22 μm滤膜除菌备用；YE溶液的配制：将YE用蒸馏水溶解定容后，配制成200 mg/mL的母液，高压灭菌锅灭菌备用.

将长势一致的新鲜颠茄毛状根0.5 g接于150 mL无激素的B5液体培养基的250 mL三角瓶中，置于恒温振荡培养箱110 r/min，(25±1) ℃避光培养12 d后，将原有液体培养基倒掉，换成添加诱导子的新鲜液体培养基.诱导子所用的浓度在预实验所得出的较为合适的浓度范围，使MJ，AgNO₃，SA终浓度均分别为25，50，100，150，200 μmol/L，YE终质量浓度为100，200，300，400，500 mg/mL.在相同条件下培养2 d，采样后测定颠茄毛状根的鲜质量、干质量及东莨菪碱、莨菪碱的质量分数.

收获用不同诱导子处理过的颠茄毛状根后，用蒸馏水冲洗残留的液体培养基，并用吸水纸吸干水分后称重，进行毛状根鲜质量的测量.将称量过鲜质量的毛状根于60 ℃烘箱中烘干至恒质量，称量颠茄毛状根干质量，并计算单瓶毛状根TAs产量，计算公式^[5]如下：

式中：Y表示单瓶毛状根TAs产量(mg)，Y₁表示东莨菪碱产量(mg)，c₁表示东莨菪碱质量分数(mg/g)，Y₂表示莨菪碱产量(mg)，c₂莨菪碱质量分数(mg/g)，m表示单瓶毛状根干质量(g).

精密称取莨菪碱、东莨菪碱标准品分别配制成浓度为100 μg/mL，200 μg/mL，300 μg/mL，400 μg/mL，500 μg/mL的标准品，按照HPLC检测条件测定，以峰面积为Y轴、标准品浓度为X轴绘制标准曲线，并分别计算线性回归方程.

参照ZÁRATE R等^[6]的提取方法，略有改动.将颠茄毛状根于烘箱中60 ℃烘干至恒质量，充分研磨后过50目筛；称取0.100 0 g干粉加入10 mL提取液(CHCl₃-MeOH-NH₄OH(15:5:1))，超声提取30 min后室温放置10 h过夜，滤纸过滤，用2 mL CHCl₃冲洗残渣，合并所有过滤的滤液；将滤液40 ℃真空浓缩至干，残留物用2 mL 1 mol/L H₂SO₄和5 mL CHCl₃溶解，静置分层后收集硫酸相于冰浴中并用浓氨水调pH值至10，再分2次加入4 mL CHCl₃提取，静置；静置分层后取下层于40 ℃真空浓缩至干，残留物用1 mL甲醇溶解，为样品液.样品液0.22 μm滤膜过滤，-4 ℃保存备用.

色谱柱：Ultimate XB-C18色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)；流动相:甲醇：0.05 mol/L醋酸铵(pH值为4.6)=58:42，0.002 5 mol/L SDS；流速：1.0 mL/min；检测波长：215 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL.

所有指标均重复测定3次，采用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0对数据进行统计分析和方差检验，数据均以x±s表示.

由表 1可以看出，与对照组相比，在不同浓度MJ处理下，颠茄毛状根的鲜质量与干质量均受到了显著性抑制，并在试验浓度范围内随着浓度增加抑制程度也增加，而且在浓度为200 μmol/L时均略有回升，但干质量对浓度的响应并不具有显著性.东莨菪碱与莨菪碱质量分数的抑制程度均随试验浓度增加呈现出先上升后降低的趋势，且在100 μmol/L时出现了转折点，质量分数分别为0.129 mg/g，0.111 mg/g；对于托品烷类生物碱的产量，随着诱导子实验浓度增加，托品烷类生物碱的产量均先降低后上升，整体呈下降趋势，且与对照具有显著性.

从表 2可以得出，AgNO₃作为诱导子抑制了颠茄毛状根的生长，毛状根鲜质量随试验浓度增加逐渐减少，且在100 μmol/L后抑制作用与对照相比具有显著性.同时，毛状根的干质量也受到了抑制且各浓度均具有显著性，最高浓度时抑制效果最明显，仅为对照的73.64%.虽然颠茄毛状根的生长受到了抑制，但其托品烷类生物碱的质量分数却提高，东莨菪碱的质量分数在中间浓度(50，100，150 μmol/L)时与对照相比有显著性增加，在100 μmol/L时质量分数达到1.912 mg/g，是对照的2.5倍.与对照组相比，试验浓度内莨菪碱的质量分数均增加且均具有显著性，其在50 μmol/L时与其他处理组均具有显著性，质量分数达到0.925 mg/g.对于托品烷类生物碱的产量来说，虽然AgNO₃对颠茄毛状根的生长产生了抑制作用，但却促进了托品烷类生物碱的积累.中间浓度(50，100，150 μmol/L)处理与对照相比依然提高了托品烷类生物碱的产量，且均具有显著性，其中100 μmol/L的处理效果最好，比对照增加了119.94%.

由表 3可以看出，在不同浓度SA处理下，各试验浓度对颠茄毛状根的生长虽然有影响，但均无显著性差异.但是，各处理组的干质量较对照都有显著性降低；诱导子的添加使东莨菪碱的质量分数增加，且在低浓度处理下(25，50 μmol/L)东莨菪碱的质量分数较对照有显著性增加，50 μmol/L时是对照的1.58倍.对于莨菪碱的质量分数，各处理组较对照均显著地抑制了其质量分数的积累，其质量分数整体下降，且随试验浓度增加抑制程度呈先下降后上升的趋势.

从表 4可以看出，与对照组相比，各试验浓度处理均显著性提高了毛状根的鲜质量，同时高浓度(300，400，500 mg/L)处理也显著提高了颠茄毛状根的干质量.随着YE浓度升高，托品烷类生物碱质量分数也逐渐升高，其中各实验组与对照组莨菪碱质量分数均具有显著性差异，500 mg/L处理时莨菪碱质量分数达到0.781 mg/g，是对照组的1.35倍.托品烷类生物碱的产量与对照相比均有提高，且除低浓度(100 mg/L)外，其他各浓度对托品烷类生物碱的提高均具有显著性.托品烷类生物碱的提高与YE浓度呈正相关性，说明YE在一定浓度梯度范围内，YE浓度越高，越有利于颠茄毛状根中TAs的积累.

诱导子通常可以作为一种信号而被植物细胞膜上的受体所识别并与其结合，结合后引起细胞膜及细胞内发生一系列级联反应，合成与植物素有关的酶或使其活性发生变化，使植物基因表达发生变化从而导致植物素的合成与积累^[7].诱导子在与植物相互作用时，能够选择性、快速、高度专一地诱导植物特定基因的表达，从而积累特定的次生代谢产物^[8].因此，可以使用相对应诱导子来提高所需的植物次生代谢产物质量分数.

茉莉酸及衍生物(如MJ)被认为在植物次生代谢过程中可以起诱导信号转导的作用.研究发现，外源茉莉酸类化合物可以有效刺激植物次生代谢产物的合成并可引起植物次生代谢产物(萜类、黄酮类、生物碱类等)有效成分的迅速积累.本实验研究发现，与对照组相比，颠茄毛状根的鲜干质量均受到了抑制.这与孙际薇^[9]对曼陀罗毛状根的研究相同.究其原因可能是因为MJ作为一种非生物诱导子，刺激了植物细胞的多种逆境反应，引起细胞抗逆反应产物的表达，破坏了细胞结构从而抑制了毛状根的生长.同时，颠茄托品烷类生物碱质量分数也受到了抑制，这与MJ对丹参次生代谢产物的影响不同^[10]，可能是因为颠茄与丹参次生代谢合成的途径不同，并且丹参合成途径中关键酶基因c4h，pal，tat等对MJ的敏感性较强.李琳琳^[5]研究发现MJ可以提高颠茄毛状根中托品烷类生物碱的积累，这与本实验的研究结果不同，可能是由于诱导子添加方式不同或者诱导时间的差异所导致.

重金属离子作为一种非生物诱导子，适量的重金属离子可以诱导植物体内的氧化胁迫，从而对植物的生长及代谢产生较大的影响^[11].本实验研究发现，AgNO₃可显著抑制毛状根的生长.原因可能是AgNO₃的添加破坏了植物细胞的结构，导致植物生长过程中所需的初级代谢产物不能正常合成，也有可能是对植物的呼吸作用、光合作用及营养吸收等生物学进程产生干扰^[12].虽然颠茄毛状根的生长受到了抑制，但其托品烷类生物碱的质量分数却有所提高，这可能是AgNO₃会诱导颠茄托品烷类生物碱代谢过程中关键酶基因的表达. Ying等^[13]用Ag⁺处理丹参毛状根后，在mRNA水平上检测到第6 d时pal转录达到最高峰.

SA作为一种常用的诱导子，不仅可诱导多种植物对病毒、细菌等产生抗性，还可诱导有关生物合成及次生代谢相关基因的表达.本研究发现，诱导子SA对颠茄毛状根的生长情况影响并不显著. SA是植物体内存在的一种信号分子，调节植物体内的代谢，而外源SA的添加可能存在浓度差异或者诱导时间太短，所以对毛状根的生长影响不是很明显.也有研究发现SA对同一细胞系内不同化合物的影响也不相同，如有研究发现SA作为诱导子添加到东莨菪碱植物中，可以提高细胞培养体系中东莨菪碱的质量分数，但对莨菪碱的合成影响不是很大^[14]，这与本文研究的结果相似.本实验在低浓度处理下(25，50 μmol/L)东莨菪碱质量分数较对照有显著性增加，但同时也有研究发现SA的添加可以显著提高红豆杉中紫杉醇的质量分数^[15].这可能是因为不同植物的次生代谢合成途径对诱导子SA的响应不同.

YE可通过活化次生代谢产物相关酶的活性来提高植物特定次生代谢产物的产量积累^[16].本实验研究发现，不同浓度YE对颠茄毛状根的生长均有促进作用. YE的添加使植物在初生代谢过程中G6PDH活性增加，G6PDH是磷酸戊糖途径的第一个关键酶，该酶在诱导子对植物生长的影响作用方面表现为可以提供更多的NADPH，促进植物初生代谢，从而使植物生长量增加^[17]. NADPH也可以降解对细胞有伤害的活性氧或过氧化物，磷酸戊糖途径加快也可以促进活性氧的降解^[18].本实验结果表明，YE添加促使颠茄毛状根托品烷类生物碱的积累，并且各处理组与对照组莨菪碱的质量分数均具有显著性差异.另一方面，YE本身就是一类含有氨基酸、核苷酸、B族维生素、微量原子的化合物，这些物质对植物生长及次生代谢产物的积累都有益^[19].

通过添加上述4种不同的诱导子发现，AgNO₃是提高颠茄毛状根中TAs质量分数的最佳诱导子，而YE是对颠茄毛状根生长的最佳诱导子，且在一定浓度范围内，颠茄毛状根中TAs质量分数的积累与YE浓度呈正相关.不同的诱导子对颠茄毛状根的生长及托品烷类生物碱合成的影响均不相同，这可能是因为不同的诱导反应与植物细胞的自身结构或细胞膜上的受体种类、数量、分布及生长状态均有关系.多种诱导子对颠茄毛状根复合处理的影响与作用机制，还有待进一步研究.