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2020 Volume 42 Issue 9
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Yuan-feng DAI, Hong ZHU, Yong-zhi ZHANG, et al. Detection and Strain Analysis of 3 Tobacco Viruses in Bijie Area[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2020, 42(9): 63-70. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.09.007
Citation: Yuan-feng DAI, Hong ZHU, Yong-zhi ZHANG, et al. Detection and Strain Analysis of 3 Tobacco Viruses in Bijie Area[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2020, 42(9): 63-70. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.09.007
shu

Detection and Strain Analysis of 3 Tobacco Viruses in Bijie Area

  • 1.

    Bijie Monopoly Administration of Guizhou Province Tobacco Monopoly Administration, Bijie Guizhou 551700, China

  • 2.

    School of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 3.

    Sichuan Province Tobacco Monopoly Administration, China Tobacco Corporation, Chengdu Sichuan 610000, China

  • 4.

    Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao Shandong 266101, China

  • 5.

    Zhaotong Monopoly Administration of Yunnan Province Tobacco Monopoly Administration, Zhaotong Yunnan 657000, China

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  • Corresponding author: Xian-chao SUN
  • Received Date: 10/08/2019
    Available Online: 20/09/2020

  • MSC: S432.4+1:S572

  • In this study, RT-PCR detection system was used for disease detection and strain identification of CMV, TMV and PVY viruses in the tobacco-growing areas in Bijie of Guizhou Province. The results of sample detection showed that the disease caused by TMV was most prevalent, with a detection rate of 64.13%. In contrast, the detection rates of PVY and CMV were 40.22% and 31.52%, respectively. The results of strain analysis showed that all the CMV isolates from the Bijie tobacco-growing area belonged to SubgroupIB, TMV isolates to Population Iand PVY isolates to PVYN:O strain, and there was no obvious regional difference among the strains.MQG1 and MQG2, the isolates from potato plants adjacent to the tobacco fields, were found to be close to the isolates of CMV, TMV and PVY on tobacco. It is, therefore, speculated that the potatoes around the tobacco field may be the main source of the three viruses.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Detection and Strain Analysis of 3 Tobacco Viruses in Bijie Area

    Corresponding author: Xian-chao SUN
  • Received Date: 10/08/2019
  • Available Online: 20/09/2020

Abstract: In this study, RT-PCR detection system was used for disease detection and strain identification of CMV, TMV and PVY viruses in the tobacco-growing areas in Bijie of Guizhou Province. The results of sample detection showed that the disease caused by TMV was most prevalent, with a detection rate of 64.13%. In contrast, the detection rates of PVY and CMV were 40.22% and 31.52%, respectively. The results of strain analysis showed that all the CMV isolates from the Bijie tobacco-growing area belonged to SubgroupIB, TMV isolates to Population Iand PVY isolates to PVYN:O strain, and there was no obvious regional difference among the strains.MQG1 and MQG2, the isolates from potato plants adjacent to the tobacco fields, were found to be close to the isolates of CMV, TMV and PVY on tobacco. It is, therefore, speculated that the potatoes around the tobacco field may be the main source of the three viruses.

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  • 烟草病毒病是烟草上的重要病害之一，是一类分布广泛、危害严重的侵染性病害.烟草病毒病的发生严重影响了烟草的产量和品质，对烟草行业造成巨大的经济损失[1].贵州省是我国烤烟生产第二大省，常年植烟面积在13.33万hm2以上，烟草侵染性病害有31种，平均每年由烟草病虫害造成的产值损失约1.5亿元.目前，我国在烟草上已发现的病毒有17种，危害较严重，发生较普遍的主要有烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY). TMV，CMV和PVY侵染所致的病毒病在贵州烟区分布最广、危害最大，也是毕节烟区的主要病害.据统计，毕节烟区TMV发生情况最为严重，烟草蚜传病毒CMV和PVY发生程度差别较大，这3种病毒造成毕节烟区的年均产值损失约0.78亿元[2-6].目前针对这3种病毒的检测方法主要有指示植物法、电镜诊断法、血清学检测法、核酸分子杂交方法和以PCR为基础的分子生物学方法等[7-9].血清学检测方法特异性差，容易受到外界因素的影响，检测过程花费时间较长，且抗体价格较高[10]；传统的分子生物学方法需要提取植物总RNA，在提取过程中RNA易降解[11]，且提取时间长，成本高.为了加快检测速度，提高检测效率，降低检测成本，本研究利用已建立的浸提液RT-PCR检测体系[12]对采自贵州省毕节市5个烟区的92份样品进行检测，针对3种主要病毒(CMV，TMV和PVY)进行检测和株系鉴定，为毕节烟草病毒病防控提供参考.

1.   材料与方法

    1.1.   样品来源

  • 采自贵州毕节烟区(青岗、寨乐、对坡、核桃乡、田桥坝)表现典型病毒病症状的烟草和马铃薯，合计92份，采集后置于实验室-80 ℃超低温冰箱保存备用.

    • 1.2.   试剂耗材

  • RNA酶抑制剂RRI、Ex TaqTM DNA聚合酶、逆转录酶M-MLV、10 mmol/L dNTPmix和Trizol等购自大连宝生物公司(TaKaRa)；限制性内切酶购自Promega公司；DNA Marker和DNA纯化试剂购自BioFlux；DNA琼脂糖凝胶试剂盒和pGEM-T载体购自天根科技有限公司.

    • 1.3.   样品浸提液制备

  • 取0.5 g叶片于研钵内，加入1 mL PBS充分研磨；将研磨液转移至2.0 mL离心管内，12 000 r/min离心5 min；取5 μL上清液点样于1 cm2大小的PVDF膜上，置于通风橱内晾干，约10 min；将1 cm2的PVDF膜放入2.0 mL离心管内，加入100 μL ddH2O，充分涡旋，置于冰上备用.

    • 1.4.   引物的设计与合成

  • 引物根据NCBI已发表基因序列设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，引物序列见表 1.

    • 1.5.   反应体系

  • 反转录反应体系和条件：20 μL反应管中加入2 μL模板，95 ℃变性3 min，依次加入5×buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mix 0.5 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、引物PVY-R(TCACATGTTCTTGACTCCAAGT) 0.5 μL、反转录酶M-MLV 0.5 μL和ddH2O 12 μL，42 ℃温浴30 min.

    PCR反应体系：10×Ex TaqTM Buffer 2 μL，dNTP mix 1 μL，MgCl2 1 μL，引物PVY-F(GCAAATGACACAATGGCATGCAG) 0.5 μL，PVY-R 0.5 μL，Ex TaqTM DNA聚合酶0.25 μL，反转录产物cDNA 1 μL，ddH2O 13.75 μL，共计20 μL.反应条件为：在94 ℃变性4 min，然后依次在94，50，72 ℃的条件下反应30，30，45 s，共计反应35个循环，最后在72 ℃条件下延伸10 min.

    • 1.6.   克隆、测序及序列分析

  • 回收RT-PCR产物，与pGEM-T载体连接，转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，将克隆后经PCR鉴定呈阳性的菌液送至华大基因公司测定序列，对所得的核苷酸序列在GenBank上进行BLAST比对，从NCBI中下载CMV，TMV和PVY各株系代表序列，并且应用MEGA5，DNAMAN和DNAstar等软件对所得序列进行分析.利用DNAstar中的MegAlign软件对CMV CP，TMV CP和PVY CP的核苷酸和氨基酸序列与所下载的代表序列进行同源性比对.采用Neighbor-Jioning法构建系统发育树.

2.   结果与分析

    2.1.   CMV，TMV和PVY 3种病毒CP的浸提液RT-PCR检测结果

  • 分别利用设计的CMV，TMV和PVY 3种病毒CP特异性引物，对烟草样品进行浸提液RT-PCR检测，产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，在Marker 500 bp和750 bp之间分别出现了预期大小为671 bp和701 bp的CMV和TMV CP条带(图 1a和图 1b).在Marker 750 bp和1 000 bp之间出现了预期大小为802 bp的PVY CP条带(图 1c)，所有结果都与阳性结果一致，而阴性对照中没有产生任何特异性条带.

    • 2.2.   毕节田间样品病毒种类的统计与分析

  • 对采集的92株疑似携带病毒病的烟草用RT-PCR检测.结果显示，毕节地区的烟草病毒主要为TMV，CMV和PVY.其中，TMV检出率最高，为64.13%；其次是PVY，检出率为40.22%；CMV发生情况较轻，检出率为31.52%. 5个烟区中，PVY在青岗发生最严重，检出率为93.75%；CMV在寨乐发生最严重，检出率为85.00%；TMV在核桃乡发生最严重，检出率为92.86%；对坡镇只检测到TMV的发生(表 2).

    • 2.3.   毕节烟草病毒株系分析

    2.3.1.   CMV株系分析

  • 测序结果表明，贵州省毕节市CMV分离物ZL8，TQB7，HTX7，QG3，MQG1和MQG2的CP长度均为671 bp(MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的CMV分离物).毕节CMV分离物与各代表株系核苷酸同源性比较，分离物与Ⅱ组核苷酸序列的同源性仅为74.1%~76.3%，与IA亚组的核苷酸序列同源性为90.6%~95.1%，与IB亚组的核苷酸序列同源性为92.1%~94.5%.结合进化树可以看出，毕节CMV分离物ZL8，TQB7，HTX7，MQG1和MQG2与来自印度的分离物同源性最高，亲缘关系最近，QG3与来自中国的分离物同源性最高，亲缘关系最近，这6种分离物属于IB亚组(图 2).

    • 2.3.2.   TMV株系分析

  • 测序结果表明，贵州省毕节市TMV分离物ZL5，DP1，HTX4，HTX7，MQG1和MQG2的CP长度均为701 bp，与各代表株系核苷酸同源性相比较，与种群I的核苷酸同源性为95.7%~97.3%，与种群Ⅱ的核苷酸同源性为73.6%~75.6%.株系进化树分析得出，毕节TMV分离物聚在一个分支，与AF395127(China，Fujian)，AF395128(China)和AF395129(China)的亲缘关系较近，同属于种群I(图 3).

    • 2.3.3.   PVY株系分析

  • 测序结果表明，贵州省毕节市PVY分离物DP9，HTX4，ZL10，TQB6，MQG1和MQG2的CP长度均为804 bp，与各代表株系核苷酸同源性相比较，与PVYN:O株系核苷酸同源性为98.8%~99.8%，与PVYO株系核苷酸同源性为97%~99.3%，与PVYC株系核苷酸同源性为91.9%~92.8%，与PVYNTN株系核苷酸同源性为90.6%~91.6%，与PVYN株系核苷酸同源性为88%~89.9%，与PVYN:O株系的同源性关系最为密切.结合进化树可以看出，毕节PVY分离物都聚在一个分支，与来自蒙古的分离物同源性最高，属于PVYN:O株系(图 4).

3.   讨论

  • 病毒的CP序列比较保守，一定程度上其亲缘性可以代表分离物之间的亲缘关系，CP序列的亲缘性越近，分离物的亲缘性越高，划分为同一株系的趋势就越强[13].本研究利用浸提液RT-PCR检测体系，对采自贵州省毕节市5个烟区的92份样品，针对CMV，TMV和PVY进行病害检测和株系鉴定.结果表明，毕节烟区CMV均属于IB亚组，TMV均属于种群I，PVY均属于PVYN:O株系.

    CMV株系变异较多，根据抗原特性和核酸序列相似性各株系被分为两个亚组，即亚组I及亚组Ⅱ，同一亚组内分离物CP基因核酸序列相似率达到90%以上，但在两个亚组间分离物的CP基因核酸序列相似率只有70%~80%[14-15].本研究中毕节CMV分离物ZL8，TQB7，HTX7，MQG1和MQG2与来自印度的分离物同源性最高，亲缘关系最近，QG3与来自中国的分离物同源性最高，亲缘关系最近，同属于IB亚组.其中MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的CMV分离物，在毕节市多数的烟地周围种植马铃薯，而马铃薯部分生长季节与烟草的生长季节部分重叠，且70%的马铃薯地都发生病毒病.由此推测，烟田周边马铃薯可能是烟田CMV的主要毒源.

    TMV有很多株系，传统方法是依据寄主症状和寄主范围区分，但TMV分离物在同一寄主上的症状差异可能与环境条件有关，不同分离物的寄主范围，可能由复制酶基因和移动蛋白基因突变决定，因此难以作出具体的划分[16-17].本研究将从NCBI库中选取的不同代表株系划分为两个种群，即种群I和种群Ⅱ.研究结果显示毕节TMV分离物聚在同一分支，与种群I的核苷酸同源性最高，均属于种群I.其中MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的TMV分离物，与烟草上的TMV分离物亲缘关系较近.据报道，在黑龙江省和重庆市的马铃薯上检测到TMV侵染，而在贵州省引起马铃薯病毒病的主要是马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯Y病毒(PVY)和马铃薯X病毒(PVX)等[18-21]，鲜有TMV侵染马铃薯的报道.由此推断，烟田周边马铃薯可能是烟田TMV的毒源.

    PVY株系鉴定应用广泛的有鉴别寄主法和基于RT-PCR方法.竞争性荧光RT-PCR鉴定PVYN和PVYC株系.由于PVYN:O和PVYNTN株系是由PVYN和PVYO株系重组或突变而来，因此鉴定PVYN:O和PVYNTN株系应用广泛的方法是普通RT-PCR方法和单克隆抗体[22-23].本研究中，毕节PVY分离物聚在一个分支，与来自蒙古的分离物亲缘关系最近，与PVYN:O株系的核苷酸同源性最高，均属于PVYN:O株系，株系分化不明显，与四川烟区PVY株系分布明显不同[24].其中MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的PVY分离物，与烟草上的PVY分离物亲缘关系较近，在毕节的纳雍县烟草基地，临近马铃薯的田块的烟草感染PVY的比率明显较高，由此可以推测，烟田周边的马铃薯也可能是烟田PVY的主要毒源.

    综上，切断烟田周围作物至烟草的传播途径对防治毕节市烟草CMV，TMV和PVY 3种病毒病具有重要意义.

Figure (4)  Table (2) Reference (24)

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