Cloning and Expression Analysis of the NAC Transcription Factor Gene <i>MtNAC47</i> in <i>Medicago truncatula</i>

YANG Chun; SHEN Liangying; LI Shuwen; JIA Wei; CHAO Yuehui

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2026.02.009

2026 Volume 48 Issue 2

Article Contents

Previous Article Next Article

YANG Chun, SHEN Liangying, LI Shuwen, et al. Cloning and Expression Analysis of the NAC Transcription Factor Gene MtNAC47 in Medicago truncatula[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2026, 48(2): 98-110. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2026.02.009

Citation:

YANG Chun, SHEN Liangying, LI Shuwen, et al. Cloning and Expression Analysis of the NAC Transcription Factor Gene MtNAC47 in Medicago truncatula[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2026, 48(2): 98-110. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2026.02.009

Cloning and Expression Analysis of the NAC Transcription Factor Gene MtNAC47 in Medicago truncatula

1.
School of Grassland Science, Beijing Forestry University, Beijing 100083
2.
Beijing Middle School, Beijing 100018

More Information

Corresponding author: CHAO Yuehui
Received Date: 17/04/2025
Available Online: 20/02/2026
MSC: S326

Abstract

Plant NAC proteins constitute a crucial family of transcription factors involved in plant growth, development, and stress responses. This study cloned the MtNAC47 gene from Medicago truncatula 'R108' and preliminarily investigated its function through bioinformatics analysis, subcellular localization, transcriptional self-activation assays, and expression pattern analysis. The results showed that the full-length of MtNAC47 gene was 1 023 bp, encoding 340 amino acids, and it exhibited the closest phylogenetic relationship with TpNAC47 from Trifolium pratense. Subcellular localization revealed that MtNAC47 was localized in both the nucleus and cytoplasm. Yeast self-activation assays demonstrated that MtNAC47 possessed self-activation activity. Expression pattern analysis indicated that the expression levels of MtNAC47 in different tissues of Medicago truncatula were sequentially as follows: flowers, roots, stems, leaves, and pods. Abscisic acid (ABA), methyl jasmonate (MeJA), salicylic acid (SA), gibberellic acid (GA), and low-temperature stress all regulated the expression of MtNAC47. Under ABA, SA, and GA treatments, expression levels initially increased and then decreased. MeJA treatment inhibited expression, while low-temperature stress caused an initial decrease followed by an increase. These findings suggest that the MtNAC47 gene may play a significant role in plant growth and development, as well as in environmental stress responses.
- Medicago truncatula,
- MtNAC47,
- self-activation detection,
- subcellular localization,
- expression pattern analysis

References

[1]	SINGH K B, FOLEY R C, OÑATE-SÁNCHEZ L. Transcription Factors in Plant Defense and Stress Responses[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2002, 5(5): 430-436. doi: 10.1016/S1369-5266(02)00289-3 CrossRef Google Scholar
[2]	CHRISTIANSON J A, DENNIS E S, LLEWELLYN D J, et al. ATAF NAC Transcription Factors: Regulators of Plant Stress Signaling[J]. Plant Signaling & Behavior, 2010, 5(4): 428-432. Google Scholar
[3]	SOUER E, VAN HOUWELINGEN A, KLOOS D, et al. The No Apical Meristem Gene of Petunia Is Required for Pattern Formation in Embryos and Flowers and Is Expressed at Meristem and Primordia Boundaries[J]. Cell, 1996, 85(2): 159-170. doi: 10.1016/S0092-8674(00)81093-4 CrossRef Google Scholar
[4]	LIU H J, CHEN S S, WU X M, et al. Identification of the NAC Transcription Factor Family during Early Seed Development in Akebia trifoliata (Thunb. ) Koidz[J]. Plants, 2023, 12(7): 1518. doi: 10.3390/plants12071518 CrossRef Google Scholar
[5]	AIDA M, ISHIDA T, FUKAKI H, et al. Genes Involved in Organ Separation in Arabidopsis: An Analysis of the Cup-Shaped Cotyledon Mutant[J]. The Plant Cell, 1997, 9(6): 841-857. doi: 10.1105/tpc.9.6.841 CrossRef Google Scholar
[6]	HU R B, QI G, KONG Y Z, et al. Comprehensive Analysis of NAC Domain Transcription Factor Gene Family in Populus Trichocarpa[J]. BMC Plant Biology, 2010, 10(1): 145. doi: 10.1186/1471-2229-10-145 CrossRef Google Scholar
[7]	NURUZZAMAN M, MANIMEKALAI R, SHARONI A M, et al. Genome-Wide Analysis of NAC Transcription Factor Family in Rice[J]. Gene, 2010, 465(1-2): 30-44. doi: 10.1016/j.gene.2010.06.008 CrossRef Google Scholar
[8]	LI J, GUO G H, GUO WW, et al. miRNA164-Directed Cleavage of ZmNAC1 Confers Lateral Root Development in Maize (Zea mays L. )[J]. BMC Plant Biology, 2012, 12(1): 220. doi: 10.1186/1471-2229-12-220 CrossRef Google Scholar
[9]	ZHANG L, YAO L, ZHANG N, et al. Lateral Root Development in Potato Is Mediated by Stu-mi164 Regulation of NAC Transcription Factor[J]. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 383. doi: 10.3389/fpls.2018.00383 CrossRef Google Scholar
[10]	YANG X F, KIM M Y, HA J, et al. Overexpression of the Soybean NAC Gene GmNAC109 Increases Lateral Root Formation and Abiotic Stress Tolerance in Transgenic Arabidopsis Plants[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10: 1036. doi: 10.3389/fpls.2019.01036 CrossRef Google Scholar
[11]	张兆冉, 王利娜, 朱博艺, 等. NAC转录因子: 参与植物诸多生命过程的调控因子[J]. 安徽农业科学, 2024, 52(15): 22-29. Google Scholar
[12]	DIAO P F, CHEN C, ZHANG Y Z, et al. The Role of NAC Transcription Factor in Plant Cold Response[J]. Plant Signaling & Behavior, 2020, 15(9): 1785668. Google Scholar
[13]	LI X D, ZHUANG K Y, LIU Z M, et al. Overexpression of a Novel NAC-Type Tomato Transcription Factor, SlNAM1, Enhances the Chilling Stress Tolerance of Transgenic Tobacco[J]. Journal of Plant Physiology, 2016, 204: 54-65. doi: 10.1016/j.jplph.2016.06.024 CrossRef Google Scholar
[14]	MA NN, ZUO Y Q, LIANG X Q, et al. The Multiple Stress-Responsive Transcription Factor SlNAC1 Improves the Chilling Tolerance of Tomato[J]. Physiologia Plantarum, 2013, 149(4): 474-486. doi: 10.1111/ppl.12049 CrossRef Google Scholar
[15]	SAMARINA L S, MALYUKOVA L S, EFREMOV A M, et al. Physiological, Biochemical and Genetic Responses of Caucasian Tea(Camellia sinensis (L. ) Kuntze) Genotypes under Cold and Frost Stress[J]. PeerJ, 2020, 8: e9787. doi: 10.7717/peerj.9787 CrossRef Google Scholar
[16]	HE X J, MU R L, CAO W H, et al. AtNAC2, a Transcription Factor Downstream of Ethylene and Auxin Signaling Pathways, Is Involved in Salt Stress Response and Lateral Root Development[J]. The Plant Journal, 2005, 44(6): 903-916. doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02575.x CrossRef Google Scholar
[17]	BALAZADEH S, SIDDIQUI H, ALLU A D, et al. A Gene Regulatory Network Controlled by the NAC Transcription Factor ANAC092/AtNAC2/ORE1 during Salt-Promoted Senescence[J]. The Plant Journal, 2010, 62(2): 250-264. doi: 10.1111/j.1365-313X.2010.04151.x CrossRef Google Scholar
[18]	WEI K, YU S P, QUAN Q L, et al. An Integrative Analysis of Metabolomics, DNA Methylation and RNA-Seq Data Reveals Key Genes Involved in Albino Tea'Haishun 2'[J]. Beverage Plant Research, 2022, 2(1): 1-9. Google Scholar
[19]	KIM J H, WOO H R, KIM J, et al. Trifurcate Feed-Forward Regulation of Age-Dependent Cell Death Involving miR164 in Arabidopsis[J]. Science, 2009, 323(5917): 1053-1057. doi: 10.1126/science.1166386 CrossRef Google Scholar
[20]	CHEN X, LU S C, WANG Y F, et al. OsNAC2 Encoding a NAC Transcription Factor that Affects Plant Height through Mediating the Gibberellic Acid Pathway in Rice[J]. The Plant Journal, 2015, 82(2): 302-314. doi: 10.1111/tpj.12819 CrossRef Google Scholar
[21]	HAN K J, ZHAO Y, SUN Y H, et al. NACs, Generalist in Plant Life[J]. Plant Biotechnology Journal, 2023, 21(12): 2433-2457. doi: 10.1111/pbi.14161 CrossRef Google Scholar
[22]	XIE C T, DING Z J. NAC1 Maintains Root Meristem Activity by Repressing the Transcriptionof E2Fa in Arabidopsis[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(20): 12258. doi: 10.3390/ijms232012258 CrossRef Google Scholar
[23]	张海娟, 吴剑锋, 胡帅, 等. 芜菁NAC转录因子BcNAC2基因的分离及其表达[J]. 园艺学报, 2011, 38(6): 1089-1096. Google Scholar
[24]	魏臻武, 盖钧镒. 豆科模式植物——蒺藜苜蓿[J]. 草业学报, 2008, 17(1): 114-120. Google Scholar
[25]	杨春, 王晓倩, 王红军, 等. 蒺藜苜蓿MtZHD4基因克隆、亚细胞定位及表达分析[J]. 生物技术通报, 2025, 41(5): 244-254. Google Scholar
[26]	XIONG H Y, HE H D, CHANG Y, et al. Multiple Roles of NAC Transcription Factors in Plant Development and Stress Responses[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2025, 67(3): 510-538. doi: 10.1111/jipb.13854 CrossRef Google Scholar
[27]	OLSEN A N, ERNST H A, LEGGIO LL, et al. NAC Transcription Factors: Structurally Distinct, Functionally Diverse[J]. Trends in Plant Science, 2005, 10(2): 79-87. doi: 10.1016/j.tplants.2004.12.010 CrossRef Google Scholar
[28]	HU P, ZHANG K M, YANG C P. BpNAC012 Positively Regulates Abiotic Stress Responses and Secondary Wall Biosynthesis[J]. Plant Physiology, 2019, 179(2): 700-717. doi: 10.1104/pp.18.01167 CrossRef Google Scholar
[29]	郑林, 王帅, 刘语诺, 等. 柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析[J]. 园艺学报, 2022, 49(7): 1441-1457. Google Scholar
[30]	曲硕, 刘芳, 孙浩文, 等. 大豆NAC转录因子生物信息学分析及GmNAC-1克隆和亚细胞定位[J]. 大豆科学, 2024, 43(5): 523-538. Google Scholar
[31]	CAO Y, HE L M, LU S D, et al. Function of the NAC1 Gene from Fraxinus Mandshurica in Cold Resistance and Growth Promotion in Tobacco[J]. Forests, 2024, 15(8): 1405. doi: 10.3390/f15081405 CrossRef Google Scholar
[32]	HOU X M, ZHANG H F, LIU S Y, et al. The NAC Transcription Factor CaNAC064 Is a Regulator of Cold Stress Tolerance in Peppers[J]. Plant Science, 2020, 291: 110346. doi: 10.1016/j.plantsci.2019.110346 CrossRef Google Scholar
[33]	PEI H X, MA N, TIAN J, et al. An NAC Transcription Factor Controls Ethylene-Regulated Cell Expansion in Flower Petals[J]. Plant Physiology, 2013, 163(2): 775-791. doi: 10.1104/pp.113.223388 CrossRef Google Scholar
[34]	柳展基, 邵凤霞, 唐桂英, 等. 一个新的玉米NAC类基因(ZmNAC1)的克隆与分析[J]. 遗传, 2009, 31(2): 199-205. Google Scholar

Access History

通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

Figures(7) / Tables(2)

Export Citation

PDF

XML

Article Metrics

Article views(542) PDF downloads(93) Cited by(0)

Access History

Other Articles By Authors

on this site
on Google Scholar

HTML

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
转录因子(Transcription Factor，TF)是一类通过与特定顺式作用元件结合来调控基因表达的蛋白质，在植物应对非生物胁迫、激素信号转导以及生长发育过程中发挥着重要作用^[1-2]。已知NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)结构域蛋白是在多种植物发育过程中具有不同功能的植物特异性转录因子。首个NAC转录因子是从矮牵牛(Petunia hybrida)中发现的NAM(No Apical Meristem)基因，它与矮牵牛胚胎的生长和发育密切相关^[3]，因携带NAM突变的矮牵牛胚胎无法发育出顶端分生组织，导致幼苗缺乏根和叶^[4]。随后，在拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)中也发现了两个相关的NAC转录因子ATAF1/2和CUC2^[5-6]，NAC转录因子的名称由“NAM” “ATAF” “CUC”3个基因的首字母组成。NAC转录因子由N末端的靶结合域和与其他蛋白质相互作用的高度保守的C末端域组成。N末端的保守结构域最初在4个基因(NAM、ATAF1、ATAF2和CUC2)中被发现，随后进一步将其划分为5个亚结构域(A至E)。其中，A、C和D结构域在不同物种的NAC成员中高度保守，而B和E结构域则表现出更多的多样性^[2]。

NAC蛋白作为植物特异性转录调节因子中最大的一类，目前已在水稻(Oryza sativa L.)^[7]、玉米(Zea mays L.)^[8]、马铃薯(Solanum tuberosum L.)^[9]等多种植物中得到鉴定。研究表明，NAC蛋白在植物应对各种逆境胁迫时发挥着独特的功能，能够直接或间接调控转录因子下游的应激相关基因，或通过与其他蛋白质相互作用，使植物响应外界环境的各种胁迫。例如，大豆(Glycine max (L.) Merr.)中与拟南芥ATAF1同源的GmNAC109在盐胁迫下能够显著诱导其表达^[10]；花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)的多个NAC转录因子(如ZbNAC7/18/47/72/79)在抗旱过程中起着关键作用^[11]。此外，NAC转录因子还会在冷胁迫下受到诱导，参与植物对低温胁迫的反应^[12]。番茄(Solanum lycopersicum L.)的SlNAM1和SlNAC1在低温胁迫下表达上调，有助于提高转基因植物的抗寒能力^[13-14]；茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)的CsNAC17/26/30在低温胁迫下的表达逐渐增加，其中CsNAC17和CsNAC26的诱导作用尤为显著，常用作茶树的抗冻性分子标记进行性状鉴定^[15]。

NAC转录因子除参与植物应激反应外，还广泛参与根系生长、花器官发育、种子萌发、植物衰老和诱导细胞死亡等生物学过程^[16-19]。水稻OsNAC2通过调控赤霉素(Gibberellic Acid，GA)途径影响植株高度和开花时间，OsNAC54能够直接调节CGGs基因活性并促进ABA INSENSITIVE 5(ABI5)的表达，从而间接影响叶片衰老^[20-21]；拟南芥AtNAC1通过抑制细胞分裂、DNA修复和细胞分化的关键调节因子E2Fa的转录，来维持根分生组织的功能和促进根生长^[22]；芜菁(Brassica campestris L.) BcNAC2经组织原位杂交后在胚囊中高度表达，说明NAC转录因子与种子或胚胎发育有关^[23]。以上研究表明，NAC转录因子可通过外界胁迫或植物信号调控其表达，进而参与多种生物学过程。

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是豆科(Leguminosae)苜蓿属(Medicago L.)的一年生植物，因其具有基因组小、自花授粉、生长周期短和遗传转化效率高等优点，被广泛用作研究豆科植物的模式植物。目前，蒺藜苜蓿的全基因组数据已经公布，这为深入研究其基因调控、挖掘潜在遗传信息创造了有利条件^[24]。对蒺藜苜蓿的研究不仅有助于理解豆科植物在生长发育过程、激素调控、信号转导及逆境胁迫响应等方面的理论，还具有重要的应用价值。NAC转录因子尽管在拟南芥和水稻等模式植物中已有相关研究，但在蒺藜苜蓿中的研究相对较少。本研究基于课题组前期的蛋白互作筛选，在蒺藜苜蓿MtUFO上游调控因子中鉴定出MtNAC47基因，克隆了蒺藜苜蓿MtNAC47基因，并进行了生物信息学分析、亚细胞定位、转录自激活检测及表达特征分析，旨在为该基因功能的进一步研究奠定理论基础。

1. 材料与方法

1.1. 材料

试验材料为蒺藜苜蓿野生型(M. truncatula ‘R108’)，由北京林业大学草业与草原学院分子实验室提供。试验耗材RNA提取试剂盒(CW0598S)购于北京康为世纪生物公司，2× RapidTaq Master mix(P222)购于南京诺唯赞公司，OMEGA PCR纯化试剂盒(D6492)购于广州飞扬生物工程有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α(KTSM101L)购于北京康体生命公司，反转录试剂盒(AG11728)、qRT-PCR试剂盒(AG11733)购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，Minimal SD Base(PM2030)、DO Supplement-Trp(PM2250)、X-α-gal(CX11922)、金担子素(Aureobasidin A)(CA2332)购自北京酷来搏科技有限公司，农杆菌感受态EHA105、酵母菌株Y2HGold、酵母诱饵表达载体pGBKT7及植物表达载体3302Y均为实验室保存。

1.2. 方法

1.2.1. 引物设计

使用Primer Premier 5.0软件进行引物设计(表 1)，MtNAC47-F/R用于克隆MtNAC47基因；3302Y-MtNAC47-F/R用于构建亚细胞定位植物表达载体；pGBKT7-MtNAC47-F/R用于构建酵母表达载体；T7 promoter和3′BD用于检测酵母表达载体；MtNAC47-RT-F/R用于MtNAC47基因的表达分析，MtActin-F/R用于内参基因MtActin的表达分析^[25]。

1.2.2. MtNAC47基因克隆

以蒺藜苜蓿‘R108’为植物材料，使用RNA提取试剂盒提取植物总RNA，随后反转录为cDNA。以MtNAC47-F/R为引物，蒺藜苜蓿cDNA为模板，利用2× RapidTaq Master mix进行PCR扩增，反应体系为20 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，34个循环，72 ℃延伸5 min，12 ℃保温。反应结束后利用琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，并借助PCR纯化试剂盒回收目的条带连接至克隆载体pMD19-T。使用大肠杆菌感受态细胞DH5α对连接产物进行转化，吸取适量菌液涂布在含有氨苄青霉素(100 mg/L)的固体LB培养基上，倒置于37 ℃培养箱中12 h。挑取单克隆菌落进行PCR检测，将符合目的基因片段大小的菌液送至北京睿博兴科生物公司测序，将测序正确的质粒命名为pMD-MtNAC47。

1.2.3. MtNAC47的生物信息学分析

在NCBI网站对MtNAC47蛋白序列进行Blast比对，并下载同源蛋白序列。通过MEGA7.0软件的邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，Bootstrap重抽样次数默认为1 000次，以评估系统发育树的可靠性。利用DNAMAN 9.0对MtNAC47及其他物种同源蛋白序列进行多序列比对分析。根据SOPMA(https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/QdTzAC/models/)网站预测蛋白质的二级和三级结构。使用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析MtNAC47蛋白的理化性质，使用SignalP 4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1)预测信号肽。在TMHMM网站(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php TMHMM-2.0)预测MtNAC47的跨膜结构域，并通过Expasy网站(https://www.expasy.org/)分析其亲疏水性。借助NetPhos(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php NetPhos-3.1)进行磷酸化位点预测。从蒺藜苜蓿基因组数据库中选择MtNAC47上游的2 000 bp作为启动子序列，通过PlantCARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)进行启动子分析，并用TBtools进行数据可视化。从NCBI下载13个同源蛋白物种的基因组文件，分析NAC基因家族的基因结构，并在NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)获取NAC结构域可视化分析结果。使用MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)分析NAC蛋白的保守基序，最后利用TBtools的Gene Structure View进行基因结构、保守基序和结构域的可视化。

1.2.4. 表达载体构建及亚细胞定位

从测序正确的菌液中提取质粒，使用特异性引物3302Y-MtNAC47-F/R，以pMD-MtNAC47作为模板进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳鉴别后，回收纯化符合预期条带的PCR产物。用限制性内切酶Nco Ⅰ对表达载体3302Y进行酶切，随后采用无缝克隆技术按1∶1比例连接纯化后的PCR产物及酶切产物，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，吸取并将菌液涂布在LB固体培养基(含50 mg/L卡那霉素)上，37 ℃培养箱中倒置过夜培养后挑取单菌落进行PCR检测并测序验证，测序正确的质粒命名为3302Y-MtNAC47。将质粒3302Y-MtNAC47转入农杆菌感受态EHA105中，进行农杆菌菌液摇菌，在培养箱中避光震荡2~3 d，直至OD 600为0.6~0.8时，将重悬菌液注射到1月左右生长良好的烟草叶片细胞下表皮中，避光培养48 h，之后借助激光共聚焦显微镜(SP8)观察MtNAC47在细胞中的位置。

1.2.5. BD-MtNAC47酵母表达载体构建及Y2HGold酵母感受态细胞的转化

以pMD-MtNAC47质粒为模板，BD-MtNAC47-F/R为引物，进行PCR扩增，同时使用限制性内切酶EcoR I对酵母表达质粒pGBKT7进行单酶切。将PCR产物和酶切后的质粒分别进行纯化，随后连接重组。连接产物通过大肠杆菌感受态转化、卡那霉素筛选及菌落PCR检测后，将含有目标条带的菌液送至生物公司进行测序分析。测序正确的质粒命名为BD-MtNAC47，提取质粒并利用PEG/LiAc转化质粒BD-MtNAC47至Y2HGold酵母感受态细胞中，吸取100~200 μL菌液均匀涂布在SD/-Trp固体培养基上，于30 ℃的酵母培养箱中培养2~3 d，挑取单菌落进行PCR验证。

1.2.6. 转录自激活作用检测

将含有BD-MtNAC47的酵母菌液使用0.9% NaCl稀释至10倍、100倍、1 000倍后，分别滴加在SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体培养基上。在酵母培养箱中倒置培养3~5 d。培养结束后观察酵母菌生长情况并进行拍照记录。

1.2.7. MtNAC47基因的表达模式分析

挑选健康饱满的蒺藜苜蓿种子，用砂纸轻微打磨种皮，使其破损。将种子置于有吸水滤纸的培养皿中，在4 ℃下进行春化处理3~4 d。随后，将种子放入光照16 h/25 ℃、黑暗8 h/23 ℃的培养箱中，直至根系发育。接着将其移栽到花盆中，并在光周期为光照16 h、黑暗8 h，明暗温度分别为25 ℃、23 ℃，湿度为56%的人工气候箱中继续培养。选取3月龄、长势良好一致的蒺藜苜蓿，分别取其根、茎、叶、花和果5部分组织，同时分别对单株的全部叶片喷施50 μmol/L的脱落酸(Abscisic Acid，ABA)、10 μmol/L的茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)、10 μmol/L的水杨酸(Slicylic Acid，SA)、10 μmol/L的GA进行激素诱导，并将单株植株置于4 ℃低温环境中进行胁迫处理。在0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h 7个时间点对叶片组织进行取样，每个处理进行3次生物学重复，样品用液氮速冻后放在超低温冰箱-80 ℃保存。对样品进行RNA提取并反转录获得cDNA，以MtActin作为内参基因，MtNAC47-RT-F/R为特异性引物，根据qRT-PCR试剂盒说明书使用荧光定量PCR仪器进行荧光定量，试验样品均采用3次生物学重复，所得数据采用2^-ΔΔCt法，使用Excel 2019进行分析处理。

3. 讨论与结论

3.1. 讨论

NAC转录因子家族是一类植物特异性调控蛋白，广泛存在于各种植物物种中，从模式植物拟南芥到重要作物如水稻和小麦(Triticum aestivum L.)，通常超过100个成员，在植物生长发育、胁迫应答、代谢途径等多种生物学过程中发挥不可或缺的作用^{[23, 26-27]}。本研究基于课题组前期的蛋白互做筛选，成功从蒺藜苜蓿MtUFO上游转录因子中鉴定出MtNAC47基因。前期研究已证明MtUFO在蒺藜苜蓿叶片和花器官发育中发挥重要作用，因此为探究MtNAC47基因在蒺藜苜蓿基因表达调控中的具体功能，克隆了蒺藜苜蓿中的MtNAC47基因，对其表达模式、转录自激活活性及亚细胞定位等进行分析，旨在为揭示该转录因子的功能和作用机制提供理论基础。

进化树分析发现，MtNAC47与红三叶TpNAC47亲缘关系最近，它们可能由共同的祖先进化而来，并具有相似的生物学功能；多序列比对显示MtNAC47蛋白与毒羊豆、蓖麻、红三叶等同源蛋白相似度较高，且具有相同的NAM保守结构域，NAM结构域是NAC转录因子家族的一个标志性特征，它与转录激活、植物生长调节以及逆境响应等生物学过程密切相关^[28]；基因结构的差异分析及蛋白保守基序分析表明，不同物种的NAC基因在转录调控、基因表达和功能上存在多样性，MtNAC47在进化过程中保持了较高的保守性，且在功能上具有相似性和较强的稳定性。亚细胞定位结果显示MtNAC47定位于细胞核和细胞质，与前人研究结果一致，说明MtNAC47主要在细胞核和细胞质中行使功能^[29-30]。蛋白亲疏水性分析表明，MtNAC47含有多个亲水区和疏水区，这可能与其在植物细胞中的功能和定位密切相关。磷酸化位点预测结果显示，MtNAC47蛋白共含有43个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点最多，发生磷酸化修饰的可能性最高，推测该蛋白可能通过调控这些特定的磷酸化位点在翻译后修饰其转录因子活性，影响下游基因的表达。转录因子通过与其他蛋白质的相互作用，直接或间接调控基因转录，在植物的应激反应、发育过程及其他重要生理过程中发挥着关键作用。本研究中的酵母自激活检测结果表明，MtNAC47具有自激活活性，这意味着MtNAC47能够在不依赖外部激活信号的情况下自行触发报告基因的表达。因此，MtNAC47不可直接应用于后续的酵母双杂交(Y2H)系统。

启动子预测有助于揭示基因表达的调控元件，为后续基因表达模式分析提供依据。通过对MtNAC47基因进行顺式作用元件分析，发现其具有低温胁迫响应元件以及GA、ABA等激素响应元件，因此对蒺藜苜蓿进行了相应的胁迫及激素处理。在SA、GA处理后的MtNAC47基因表达量为先上升后下降，这与水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.) FmNAC1的表达模式相类似^[31]。MeJA处理后的MtNAC47表达量呈显著下降趋势，与辣椒(Capsicum annuum L.)中的CaNAC064表达模式一致，推测MtNAC47在蒺藜苜蓿中可能通过相同或相似的方式来发挥作用^[32]。

组织表达分析结果显示，MtNAC47基因在花中表达量最高，而在果中最低，表明该基因在蒺藜苜蓿中具有组织特异性。已有研究表明，NAC转录因子在水稻^[20]、拟南芥^[21]和玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)^[33]等植物中参与根系生长、花瓣细胞扩增以及开花时间的调控，证明了NAC转录因子在植物生长发育过程中通过冗余或非冗余的方式发挥重要作用。因此，MtNAC47在花中的高表达说明该基因可能与蒺藜苜蓿的花发育、花器官形成或花期调控密切相关。此外，有研究报道指出，NAC转录因子在冷胁迫下会被诱导，参与植物对冷胁迫的反应；并在低温胁迫下可能通过ABA信号途径与NAC转录因子的调控网络相互作用，共同调控植物的应激反应^{[12, 34]}。本试验发现，在ABA和低温胁迫处理下，MtNAC47的表达量均表现为先下降后上升的趋势，变化趋势一致，说明ABA和低温胁迫均能诱导MtNAC47的表达。然而，MtNAC47是否通过ABA信号通路响应低温胁迫仍需通过后续实验进一步验证。

3.2. 结论

本研究成功克隆了蒺藜苜蓿MtNAC47基因，编码340个氨基酸，为非跨膜性蛋白，不具有信号肽，并且是一个亲水不稳定的碱性蛋白；MtNAC47在进化过程中具有高度保守性，亚细胞定位于细胞核和细胞质；该蛋白具有转录自激活活性，不能直接用于后续酵母双杂交实验。MtNAC47基因的表达量在SA、GA、MeJA、ABA激素诱导及低温胁迫下均有响应，在花组织中表达量最高，说明MtNAC47不仅在花器官发育中具有重要功能，还可能在植物对这些激素和逆境胁迫的应答过程中发挥调控作用。以上结果为进一步研究该基因的功能和机制提供了理论参考。

Figure (7) Table (2) Reference (34)

Name
	Name cannot be empty!
E-mail
	Mailbox cannot be empty! Mailbox cannot be empty!
Telephone
	Mobile number cannot be empty! Please enter a valid mobile number!
Title

Content
Verification Code

Message Board

Cloning and Expression Analysis of the NAC Transcription Factor Gene MtNAC47 in Medicago truncatula