Effect of Liver-Protection Oral Liquid on Liver Protection of Acute Hepatic Injury Induced by CCl₄ in Mice

四川农业大学动物医学院药学系实验室及动物房.

健康SPF级昆明小鼠40只(雌雄各半)，体质量(20±2) g，由达硕实验动物中心提供(动物许可证号：SYXK(川)2014-189).

保肝口服液由茵陈蒿30 g、柴胡30 g、党参20 g、淫羊藿20 g、熟地20 g、牛膝10 g、益母草10 g为组方，由水煎醇沉法制备得来，其为一种褐色液体，生药质量浓度为1.03 g/mL；复方蛋氨酸胆碱片(东宝肝泰片)由通化东宝药业股份有限公司出品(批号20171201).CCl₄(分析纯)；橄榄油；生理盐水；电子天平，高速冷冻离心机，光学显微镜(均为Eppendorf公司产品)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(均购自北京天根生化科技有限公司).

让小鼠自由饮水进食，在温度为18~22 ℃且明暗各12 h的动物实验室内进行饲养.于试验环境下进行1周适应性正常喂养后^[3]，按照体质量将40只小鼠随机分为4组，每组10只.空白对照组与模型组：灌服两组小鼠生理盐水，剂量为0.2 mL/10 g；保肝口服液组：对该组小鼠灌服保肝口服液，剂量为每日每只小鼠每10 g体质量灌服生药量为0.206 g；阳性组(复方蛋氨酸胆碱片)：对该组小鼠灌服复方蛋氨酸胆碱片(复方蛋氨酸胆碱片溶液浓度为35 mg/100 mL)，剂量为每日每只小鼠每10 g体质量灌服0.07 mg.

各组小鼠1次/d灌胃，各组均灌胃15 d.第15 d结束后对模型组、阳性组、保肝口服液组单次腹腔注射0.1%(用橄榄油稀释)的CCl₄(0.1 mL/10 g)^[4]，建立急性肝损伤模型.试验期间，给小鼠正常饲喂水和基础饲料(主要营养成分及比例：含水量7.5%，粗纤维3.5%，粗灰分8.6%，磷0.7%，钙1.16%，粗蛋白24.3%，粗脂肪7.5%)^[5].记录每组的死亡率.在注射CCl₄后禁食不禁水16 h，称量各组小鼠体质量后，用镊子摘除小鼠眼球，在眼眶静脉丛处取血，并分离小鼠肝脏，称量肝脏质量及检测各项生化指标.

观察试验过程中各组小鼠的一般情况，包括精神、活动状况，饮食饮水状况，排便状况及皮毛色泽光泽状况等^[6].

颈椎脱臼处死小鼠后，取小鼠肝脏，用冰生理盐水冲洗，取滤纸吸干水分，观察肝脏组织大体形态后测其质量，根据肝脏质量和体质量来计算肝脏指数.(肝脏指数计算公式为肝脏指数(%)=肝脏质量(g)/质量(g)×100%)

镊子摘取各组小鼠的肝脏左叶，使用温度为4 ℃左右的生理盐水，将摘取的肝脏样品上黏着的血液及其他异物清洗干净，然后取滤纸吸干附在样品表面的水分.沿着所取的肝脏样品边缘剪一小块肝脏组织，立即泡在10%甲醛溶液中，固定12 h.接着制作肝脏切片，其步骤为脱水、透明、浸蜡等，最终将其制作成直径为6 μm左右的的肝脏切片.最后对所制得的肝脏切片进行HE染色，在光学显微镜下观察各组小鼠的肝脏病理结构^[7].

采集各组小鼠眼球血样后，离心10 min(3 000 r/min，4 ℃)，分离出上层血清，在-20 ℃条件下冷藏保存备用，测定各组小鼠血清中ALT，AST的含量.

摘取各组小鼠的肝脏右叶，称取约1 g，将其制成肝脏组织匀浆，浓度为100 g/L(m_生理盐水∶m_肝组织=1∶9).离心(3 000 r/min)，取其上清液，冷藏(-80 ℃)保存备用，测定肝脏组织中SOD和MAD的含量^[8].

统计软件为SPSS 20.0.对计算得到的各组小鼠肝脏指数，及检测得到的ALT，AST，MAD及SOD含量等试验数据进行统计学分析.所有数据均用Mean±SD的形式来表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的方法对组间均数进行比较，单因素分析可采用LSD法^[8].以P < 0.05结果为有统计学意义.

急性肝损伤模型建立成功后，口服液组、阳性组和空白组小鼠活动状况正常，饮食饮水正常，皮毛颜色正常且有光泽；模型组的小鼠精神出现萎靡不振的情况，并且饮食饮水量也明显减少，皮毛色泽暗沉.

空白对照组的死亡率为0，CCl₄模型组的死亡率为30%，阳性组的死亡率为10%，保肝口服液组的死亡率为20%(表 1).与空白对照组相比较，模型组、阳性组及保肝口服液组的小鼠均出现不同程度的死亡现象，出现明显死亡现象的是CCl₄模型组的小鼠，结果表明腹腔注射CCl₄会对小鼠造成明显死亡；与CCl₄模型组比较，阳性组和保肝口服液组小鼠死亡程度减轻，表明阳性组药物(复方蛋氨酸胆碱片)和保肝口服液能降低CCl₄所致肝损伤小鼠的死亡率；与阳性组相比，保肝口服液组小鼠的死亡率稍有上升，表明保肝口服液对CCl₄所致肝损伤小鼠的保护作用稍低于阳性组药物(复方蛋氨酸胆碱片).

与空白组相比，模型组小鼠的肝脏指数明显增加(P < 0.01)，由此推测，模型组小鼠的肝脏可能出现肿胀、发炎等病变状况，结果表明CCl₄对小鼠肝脏造成明显损伤.与模型组相比，保肝口服液组和阳性组小鼠肝脏指数减小，具有统计学意义(P < 0.05)，表明保肝口服液和复方蛋氨酸胆碱片对急性肝损伤有一定的保护作用(表 2).

图 1-图 4为光学显微镜下放大200倍的图片.

空白对照组(图 1)其肝细胞结构清晰，无病变情况.

模型组(图 2)，其病变情况除肝小叶结构消失，肝脏细胞肿大且大小程度不均匀以外，还伴有肝细胞胞浆内的脂滴大小不相同(主要呈小泡性的脂肪滴)，肝窦略狭窄以及轻度的肝细胞水样变形的病变状况出现.模型组呈现的肝索模糊、肝细胞核模糊、溶解，出现坏死情况，表明了CCl₄对小鼠肝脏能造成明显损伤.

保肝口服液组(图 3)和阳性组(图 4)，与模型组比较，这两组小鼠的肝脏病变情况均有不同程度的改善.肝脏细胞的颜色和形态均较为正常：颜色没有明显变化，形态也比较正常，大小无不均匀情况出现.此外，虽然偶见肝脏细胞出现坏死和水样变形，但肝内脂肪滴的数量也见减少.结果表明本试验研制的保肝口服液对CCl₄所致小鼠肝细胞损伤有一定的保护作用.

与空白对照组相比较，腹腔注射CCl₄溶液后，CCl₄模型组小鼠的ALT，AST及MDA活性有显著增高趋势(P < 0.01)，而肝脏组织SOD活性则呈显著降低趋势(P < 0.01)，说明CCl₄使模型组小鼠肝细胞出现氧化损伤，证明急性肝脏损伤模型建造成功.

与CCl₄模型组相比较，阳性组和保肝口服液组小鼠的ALT和AST活性呈现显著降低趋势(P < 0.05)，说明该试验采用的阳性组药物和保肝口服液具有对抗CCl₄所致急性肝损伤小鼠异常增高ALT和AST的作用，证明阳性组药物和保肝口服液能有效减轻CCl₄对肝细胞造成的损伤，保护肝脏细胞膜，明显减少细胞内酶的释放；与CCl₄模型组相比较，阳性组和保肝口服液组的肝脏组织MDA活性显著降低(P < 0.05)，SOD活性显著增高(P < 0.05)，表示该试验采用的阳性组药物和保肝口服液能提高SOD活性，具有清除氧自由基而降低MDA活性的作用，说明阳性组药物和保肝口服液对CCl₄所致急性肝损伤具有明显的保护作用.

与阳性组相比较，保肝口服液组ALT，AST，MDA和SOD的活性差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明由CCl₄所致急性肝损伤的保肝口服液组的保肝作用和提高抗氧化损伤能力与阳性药物组相当(表 3).

本试验采用CCl₄ 0.2 mL/10 g成功地建造了小鼠急性肝损伤模型.近年来，由肝损伤动物模型的建立依据来分，可主要分为4类：①化学性肝损伤模型，可采用CCl₄、硫代乙酰胺(TAA)和D-氨基半乳糖(D-Gal N)等化学试剂来造模.②药物性肝损伤模型，可由氯丙嗪、乙酰氨基酚、四环素和异烟肼等药物来造模.③免疫性肝损伤模型，可使用卡介苗加脂多糖(BCG+LPS)和刀豆蛋白A(Con A)来建立这种肝损伤模型.④酒精性肝损伤模型^[9].作为亲肝毒物中最为经典的一种，CCl₄引发毒性的主要部位是呼吸道和消化道.CCl₄进入体内之后，能够导致人和动物的肝脏出现不同程度的损伤情况.有相关文献报道，由CCl₄诱导的急性肝损伤模型不仅已经广泛用于肝坏死及肝硬化的病因学、组织学研究和肝功能变化研究中，而且广泛应用于药用植物提取物、保肝药物的评价^[10-11].

本试验所得的结果表明保肝口服液能明显对病变小鼠的ALT，AST，MDA及SOD含量水平产生影响.CCl₄引发肝脏毒性的机理为：当CCl₄进入小鼠的体内之后，CCl₄会被名为P₄₅₀的这种细胞色素分解为CCl₃自由基团.而CCl₃自由基团能引起脂质的过氧化反应，从而破坏肝脏细胞的细胞膜，使肝细胞发生变形，严重者则能导致肝细胞坏死.病变肝脏细胞的细胞膜被裂解后，肝脏细胞内的转氨酶及自由基更加容易渗入到血液中，导致活性升高.因此血清中ALT和AST可以作为肝脏损伤的敏感指示标志，它们的升高数值也反映了肝脏受到损伤的不同轻重程度^[12].另外，大量研究也表明，MDA均会抑制线粒体呼吸功能、丙酮酸脱氢酶活力及α-酮戊二酸脱氢酶的生成^[13].故肝组织内MDA含量可作为机体内的脂质过氧化水平的直观反映，可直接作为氧化损伤的生物标志物^[14-15].SOD通过清除超氧阴离子自由基，达到保护细胞免受损伤的目的.由大量的临床和动物实验证实^[16]可知，若动物肝脏发生病变情况，那么其肝组织中SOD活性会呈现比正常组明显降低的趋势，这样的结果表明在肝细胞发生炎症坏死等过程中SOD对肝脏起着不可或缺的保护作用.

本试验选用的保肝口服液是由茵陈蒿、柴胡、党参、熟地、淫羊藿、牛膝、益母草为组方经过工艺优化制得.据相关文献报道^[17-18]，腹腔注射柴胡皂苷能显著降低血清AST和ALT活性，这是因为柴胡皂苷可以抑制由D-半乳糖胺这一化学物质引起的小鼠肝损害；如果给小鼠灌胃茵陈蒿的水煎剂溶液，连续7日，能防治CCl₄引起的肝损伤，降低丙氨酸氨基转化酶和血清胆固醇；党参则具有以下一些作用：增强机体对外界刺激物的应变能力、增强机体的免疫功能、延缓机体衰老速度、抗溃疡和补血等；熟地黄有抑制血栓形成的作用，尤其是对脂肪含量较高的食物引起的高脂血症、脂肪肝，以及对由小鼠内毒素而引起的肝静脉出血症有较好的治疗作用.通过本试验结果可知，根据该中药组方研制的保肝口服液确实具有降低ALT，AST和MDA水平及升高SOD水平的作用，有一定的护肝功效.可见，本试验选用的中药组方一方面继承了传统的中医理论基础，另一方面也紧密结合了临床实际，提高了疗效，但很难阐释其护肝机理，这点疑问尚未被解释清楚，所以仍有必要继续进一步更加深入研究其作用及其护肝作用机制.

从各试验组小鼠死亡率、肝脏组织病理学、血清ALT和AST水平、肝脏MDA和SOD水平进行比较分析，可以看出本试验的受试药物保肝口服液不但能够降低CCl₄所致急性肝损伤小鼠的死亡率，而且还能降低血清中ALT和AST水平和肝脏MDA水平，以及升高肝脏SOD水平，证明该口服液对CCl₄所致肝损伤有一定保护作用，对动物肝损伤药物的开发提供了可行性依据.