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柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)，隶属于半翅目(Hemiptera)扁木虱科(Liviidae)[1]，以寄主植物韧皮部汁液为食，可对柑橘、柠檬、九里香等芸香科植物造成危害[2]。除了直接取食嫩梢，导致植株生长受阻、叶片卷曲及果实品质下降外，其若虫排泄的蜜露还可诱发杂菌繁殖，引发煤污病[3]。更重要的是，作为柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)致病因子(Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas)的主要传播媒介，柑橘木虱可通过吸食带病植株韧皮部汁液后再吸食健康植株来传播黄龙病[4-5]。由于柑橘感染黄龙病后目前尚无有效治疗方法，防控柑橘木虱成为遏制黄龙病蔓延的关键措施。
目前柑橘木虱的防控仍以化学防治为主。随着化学药剂使用量逐年增加，其残留不仅污染环境，还导致柑橘木虱抗性显著增强，同时对天敌昆虫的存活、捕食及繁殖产生负面影响[6-9]。近年来，新型杀虫剂以低剂量、高选择性、高特异性等优势逐步取代传统杀虫剂[10]。尽管如此，生物防治仍是最为生态友好的害虫防控策略。生物防治剂(Biocontrol Agents，BCAs)包括昆虫病原微生物、天敌昆虫及植物源农药等[11-12]。其中，微生物农药由于靶标特异性强且环境安全性高，越来越受到关注[13]。研究表明，将微生物菌剂与化学杀虫剂减量混用，可增强微生物药剂效果，同时显著降低化学药剂使用量[14]。天敌昆虫作为柑橘木虱绿色防控的重要手段之一，控制效果持久且环境友好，但通常作用速度不及化学药剂，在害虫暴发期防治效果有限。
柑橘木虱不同虫态对药剂敏感性存在差异。因此，明确主流药剂对柑橘木虱的毒力及防效，对于科学用药及抗性管理具有重要参考价值。吡虫啉(Imidacloprid)和吡丙醚(Pyriproxyfen)是当前防治柑橘木虱的常用主流药剂。烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic Acetylcholine Receptors，nAChRs)是新烟碱类(Neonicotinoids，NNs)杀虫剂的作用靶标，在昆虫神经系统中发挥重要作用[15]。吡虫啉作为新烟碱类杀虫剂，是一种nAChRs激动剂，通过与nAChRs结合破坏昆虫中枢神经信号传导，具有内吸性和触杀活性[16]。研究表明，在亚致死浓度胁迫下，柑橘木虱成虫的组织蛋白酶基因DcCath-B、DcCath-F、DcCath-L及DcCath-L1表达显著下调[17]；同时，细胞色素P-450相关解毒酶表达被沉默，可增加柑橘木虱对吡虫啉的敏感性[18]。吡虫啉可被植物根或叶吸收并转移至全株，对刺吸式和食叶害虫均具有有效毒性，因此在柑橘园中常通过叶面喷雾或土壤处理方式进行防控[19-21]。
相比之下，吡丙醚对昆虫的作用机制并不通过神经系统，而是通过复杂的体内生理调节过程，造成害虫阶段性死亡。吡丙醚属于昆虫生长调节剂(Insect Growth Regulators，IGRs)，可模拟保幼激素活性干扰昆虫内分泌系统，影响蜕皮过程或角质层形成，同时对昆虫免疫系统也有调控作用[22-23]。吡丙醚对柑橘木虱各发育阶段均具毒性，可抑制产卵、卵孵化及成虫羽化，并诱导若虫死亡，对成虫繁殖力亦有显著影响[24-25]。由于吡丙醚与传统神经毒剂交互抗性低，可作为抗性治理中轮换或混配的重要药剂；在柑橘园中，5%吡丙醚与5%高效氯氰菊酯复配为10%高氯·吡丙醚微乳剂稀释后喷施，见效快，无需重复施用[26]。
目前，吡虫啉和吡丙醚在柑橘木虱防控中尤其是绿色防控中占据重要地位，但针对不同虫态的防控数据仍不足，限制了其在果园的精准应用。为明确两种药剂对不同虫态的毒力峰值期及最佳施药方式，本研究通过室内毒力测定，分析了喷施条件下吡虫啉和吡丙醚对柑橘木虱若虫的致死效果，并比较了浸渍法与药膜法两种试验方法下对若虫和成虫的毒力差异，旨在为柑橘木虱精准用药提供科学依据。
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供试植物为九里香(Murraya paniculata L.)种苗，购自广州市增城区小楼苗圃基地，移植于华南农业大学生物防治教育部工程研究中心网室内，使用直径28 cm的花卉盆定植，并定时浇水、施肥及修剪，以保证嫩芽嫩梢充足，为柑橘木虱产卵和繁殖提供条件。柑橘木虱田间种群于2023年6月采自华南农业大学校园绿化带九里香植株，经剪枝后在网室内利用嫩芽充足、营养状况良好的九里香枝条进行连续传代繁殖10代以上，用于试验。
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95.1%吡虫啉原粉和97%吡丙醚原粉分别购自深圳诺普信作物科学股份有限公司；分析纯丙酮购自上海麦克林生化科技股份有限公司。
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参照《农药室内生物测定试验准则·杀虫剂第9部分：喷雾法》(NY/T 1154.9—2008)，将吡虫啉原药和吡丙醚原药先用丙酮溶解，再用去离子水分别配制为以下质量浓度：吡虫啉0.1、0.5、1、5、10 mg/L；吡丙醚10、20、40、80、120 mg/L。
选取在九里香嫩梢上产卵24 h后的20对成虫，待发育为低龄若虫(约2龄，8~9 d)或高龄若虫(约5龄，13~15 d)后，统计处理前若虫数量(低龄若虫≥50头，高龄若虫≥40头)。使用手提喷瓶，将100 mL各浓度药剂从距离枝条约10 cm处，多方向均匀喷施5次，喷后在阴凉通风处晾干，再转入(25±1)℃恒温室内，枝条用纱网袋套住。设置清水对照，每个处理3个重复。观察期为7 d，每24 h记录若虫死亡数量。虫体掉落于网袋上，躯体干瘪或足蜷缩无反应者视为死亡。
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参照《农药室内生物测定试验准则·杀虫剂第8部分：滤纸药膜法》(NY/T 1154.8—2007)，将吡虫啉原药和吡丙醚原药用丙酮溶解，再用去离子水配制为以下质量浓度：吡虫啉1、5、10、30、50 mg/L；吡丙醚5、10、20、30、50 mg/L。
吸取1 mL药液置于用保鲜膜封好的玻璃管(长度20 cm，直径5 cm)中，将管水平放置滚动2 min，使管壁均匀沾药，静置15 min使药液干燥形成药膜。每管放入30头柑橘木虱成虫，使其在管内爬行2 h，每隔10 min轻转一次试管；2 h后转移至装有九里香嫩枝条，枝条下端置于1.5 mL离心管保湿的装置中。管两端用纱网覆盖保持空气流通。试验环境为恒温室，温度为(25±1)℃，相对湿度约70%。清水为对照，每个处理3个重复。观察期为30 d，每24 h记录成虫死亡数量。虫体躺倒且轻触无反应视为死亡。
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参照《农药室内生物测定试验准则·杀虫剂第14部分：浸叶法》(NY/T 1154.14—2008)，将吡虫啉原药和吡丙醚原药用丙酮溶解，再用去离子水配制为以下质量浓度：吡虫啉1、5、10、30、50 mg/L；吡丙醚5、10、20、30、50 mg/L。
先在培养皿中加入2 mL药液，九里香枝条(通常取靠近芽的第二或第三枝条，长度约9~13 cm)放入药液中，浸2 min后取出置于吸水纸上晾干。将处理后的枝条放入两端通气的试管中，枝条基部置于1.5 mL清水离心管中保持湿润。每管放入30头羽化≤5 d的成虫(性比为1∶1)，两端用网纱套住保证空气流通。设置清水对照，每个处理3重复。观察期为30 d，每24 h记录成虫死亡数量。虫体躺倒且轻触无反应视为死亡。
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各处理死亡数量使用Microsoft Excel 2013软件统计；毒力回归方程及参数分析使用SPSS 14.0调用PROBIT过程；柑橘木虱若虫7 d存活率及成虫30 d死亡率变化图使用GraphPad Prism 8.0.2绘制。
1.1. 试验材料
1.1.1. 供试虫源与寄主植物
1.1.2. 供试药剂与试剂
1.2. 试验方法
1.2.1. 喷施法
1.2.2. 药膜法
1.2.3. 浸渍法
1.3. 数据处理与统计学分析
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采用喷施法处理柑橘木虱若虫，吡虫啉和吡丙醚对低龄和高龄若虫的毒力回归方程见表 1。3 d后毒力测定结果显示，在两种药剂中，吡虫啉对柑橘木虱若虫的防治效果最佳，其对低龄若虫的LC50显著低于高龄若虫；而吡丙醚对低龄若虫的LC50也低于高龄若虫，但两者差异不如吡虫啉明显。
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在持续喷施吡虫啉和吡丙醚的条件下，不同浓度药剂对低龄和高龄若虫的毒性存在明显差异(图 1)。两种药剂对柑橘木虱若虫均呈现剂量效应和暴露时间效应，随着药剂浓度增高和暴露时间延长，致死率明显升高。结果表明，在果园中进行柑橘木虱防控时，应选择浓度大于10 mg/L的吡虫啉进行喷施，以有效控制若虫数量。
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采用药膜法和浸渍法对5日龄柑橘木虱成虫进行吡虫啉和吡丙醚的毒力测定。结果显示，吡虫啉处理3 d后，药膜法的LC50高于浸渍法(表 2)；同样，吡丙醚处理3 d后，药膜法的LC50也高于浸渍法。以上结果表明，两种药剂对柑橘木虱成虫均具有较高毒力，但浸渍法的致死效果明显优于药膜法。
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在吡虫啉药膜法处理下，不同浓度成虫持续30 d的死亡动态如图 2所示；低质量浓度处理(1 mg/L和5 mg/L)死亡率变化与对照组相似；高浓度处理的死亡率从第3 d开始明显上升，至第7 d曲线趋于平稳(图 2a)。
在吡虫啉浸渍法处理下，成虫死亡动态与药膜法总体趋势相似，但死亡率上升更为迅速。从第3 d开始急速上升，第8 d左右进入平缓期，第11 d后曲线波动趋于稳定。5 mg/L和10 mg/L的死亡率稳定在约85%，而第30 mg/L和50 mg/L的死亡率可达100%(图 2b)。
对于吡丙醚药膜法处理，成虫在前3 d死亡率上升最快，第3 d至第9 d死亡率稳步增加，之后曲线出现小幅波动(图 2c)。吡丙醚浸渍法处理的成虫，在前4 d死亡率显著上升，第5 d至第10 d死亡率变化进入平缓过渡期，10 d后每隔5 d死亡率出现小幅上升(图 2d)。
2.1. 喷施法对柑橘木虱若虫毒力分析
2.2. 喷施法对柑橘木虱若虫存活率的影响
2.3. 药膜法和浸渍法对柑橘木虱成虫毒力分析
2.4. 药膜法和浸渍法对柑橘木虱成虫死亡动态分析
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杀虫剂毒力测定是评价杀虫剂对害虫毒性强弱的重要手段，也是田间选择合适杀虫剂的参考依据。前期研究表明，吡虫啉是田间防治柑橘木虱效果最显著的新烟碱类杀虫剂代表[27]。本研究中，吡虫啉对低龄和高龄若虫的LC50分别为1.23 mg/L和3.73 mg/L，均低于5 mg/L；而成虫对吡虫啉敏感性相对较低，其LC50分别为37.91 mg/L(药膜法)和33.21 mg/L(浸渍法)。
宋晓兵等[28]采用浸渍法用70%吡虫啉水分散粒剂测定柑橘木虱成虫的实验室敏感种群的LC50为0.880 2 mg/L，而广东肇庆田间种群的LC50为5.183 7 mg/L，说明吡虫啉对成虫防效较强，但LC50与本研究差异较大，可能与药剂剂型及柑橘木虱种群抗性差异有关。此外，有研究显示吡虫啉对成虫和若虫的LC50分别为0.44 mg/L和0.43 mg/L，两者差异不大[29]，与本研究结果不同，可能因野外种群存在不同程度抗性。除直接施药外，柑橘苗跨省运输前3 d使用吡虫啉处理，可防止柑橘木虱侵染与传播[30]。
吡丙醚作为激素类似物，通过调节昆虫生长发育起作用，常用于农业、园艺及公共场所防治埃及伊蚊(Aedes aegypti)、烟粉虱(Bemisia tabaci)等害虫[31-32]。有研究表明，10%高氯·吡丙醚1 000倍液防效最佳，5 d虫口减退率可达99.36%，且防效可持续15 d[33]；在田间条件下，单剂第一次施药12 d后虫口减退率仅为60.29%，第二次施药12 d后可达88.93%[34]。本研究结果表明，吡丙醚对柑橘木虱的若虫和成虫均具有毒性，但因处理方法不同，其对不同虫态的毒性表现存在差异；其中，药膜法处理下成虫的致死中浓度低于喷施法处理下的若虫，而浸渍法处理下的若虫则略高于喷施法处理下的若虫。低剂量(5、10 mg/L)浸渍处理的死亡率与接触时间相关，高浓度(20~50 mg/L)毒性明显，死亡率可达40%~70%，但显著低于吡虫啉的神经毒性效果，结果与Palumbo等[35]相似。吡丙醚对成虫毒性高的原因可能与其干扰体内激素平衡相关，该作用随浓度增加而增强。有研究表明，高剂量吡丙醚(1.25、2.5、5、10 μg)可抑制意大利工蜂(Apis mellifera)卵黄原蛋白Vg合成与积累，而低剂量(0.001~0.1 μg)无显著影响[25]。
药效测定对评估化学药剂毒性具有指导意义。不同药剂因作用机制、作用对象不同，其测定方法亦有所区别。对柑橘木虱若虫而言，喷洒法最直接且有效，其停留于柑橘嫩芽顶端，喷洒法可最大程度模拟实际施药场景，结果准确可靠。在喷洒法下，吡虫啉在幼芽上的有效控制时间短，药效随时间迅速下降，因此抽芽期喷洒次数需增加[36]。本研究中，喷洒法对低龄和高龄若虫的LC50测定显示，吡虫啉剂量低，高龄若虫耐药性强；实际果园防控应参考高龄若虫致死浓度。此外，可利用芸香科对柑橘黄龙病菌免疫且对柑橘木虱有诱集作用的咖喱树(Bergera koenigii L.)，诱集后喷施吡虫啉，提高柑橘木虱及黄龙病防控效果[37]。
药膜法更贴近触杀作用，适合评估击倒效果和抗药性测定[38]。柑橘木虱若虫在药膜法中死亡原因难以区分是药剂作用还是脱离叶片所致，因此主要用于成虫抗药性评估。浸渍法模拟叶片施药，适合评估内吸性药剂持效性，可用于多数昆虫室内活性研究[39]，符合成虫在植物表面停留、刺吸行为的实际情况。
现有柑橘木虱化学防控研究多聚焦单一虫态或施药方法，缺乏系统性比较，导致田间防治缺乏理论依据。本研究对吡虫啉和吡丙醚在低龄若虫、高龄若虫和成虫3种虫态的防治效果进行了全面评价，并提出3种施用方法在防治中的优劣，为合理选择药剂及施药方法提供了科学依据。然而，本研究主要关注杀虫剂防治效果，对作用机制研究尚浅；尤其是吡丙醚对成虫毒性高于若虫的现象，仅作推测，未来可进一步研究其作用机制，以期解析更多杀虫剂防控害虫的科学问题。
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