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2021 Volume 43 Issue 9
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WU Dengyan, DU Maotao, TAN Ranjing. Study on the Specific Antibodies to Helicobacter pylori in Sera from Patients with Chronic Spontaneous Urticaria[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2021, 43(9): 30-37. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2021.09.004
Citation: WU Dengyan, DU Maotao, TAN Ranjing. Study on the Specific Antibodies to Helicobacter pylori in Sera from Patients with Chronic Spontaneous Urticaria[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2021, 43(9): 30-37. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2021.09.004
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Study on the Specific Antibodies to Helicobacter pylori in Sera from Patients with Chronic Spontaneous Urticaria

  • The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

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  • Received Date: 12/05/2020
    Available Online: 20/09/2021

  • MSC: R758.24

  • In order to explore the underlying pathogenesis of CSU (chronic spontaneous urticaria), the relationship between Hp (Helicobacter pylori) infection and CSU risk was analyzed and the levels of sera specific antibodies against Hp in CSU patients were detected. The standard ELISA kit was used to determine the prevalence rate of Hp-infection in the CSU group and the normal control group. Urea-lysed Hp and recombinant Lpp20 protein which was definitely expressed, purified and identified, were respectively pre-coated on microplate, and then all of the sera samples were tested by ELISA assay for their IgE, IgG and IgA antibodies against Hp and Lpp20. The standard ELISA assay showed that the Hp-infection rate was significantly higher in the CSU group (73.46%, 155/211) than that in the control group (51.82%, 71/137) (χ2=17.08, p < 0.001). In ELISA assay, no obvious differences were detected in the levels of sera Hp- or Lpp20-IgE between the CSU(+)Hp(+) group (0.082±0.002, 0.085±0.003) and the CSU(-)Hp(+) group (0.078±0.003, 0.082±0.005) (P1=0.382, P2=0.597). The levels of sera Hp- IgG and IgA in the CSU(+)Hp(+) group (1.053±0.022 and 0.660±0.022, respectively) were obviously lower than those in the CSU(-)Hp(+) group (1.222±0.034 and 0.849±0.037, respectively) (P1=0.000, P2=0.019). The levels of sera Lpp20- IgG or IgA showed no obvious differences between the two groups (1.459±0.012, 1.494±0.016, P1=0.087; 1.229±0.020, 1.251±0.033, P2=0.548). In conclusion, Hp infection was found to be closely related to CSU attack, but the specific sera antibodies of Hp and Lpp20 were not critical factors to trigger urticaria.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Study on the Specific Antibodies to Helicobacter pylori in Sera from Patients with Chronic Spontaneous Urticaria

  • Received Date: 12/05/2020
  • Available Online: 20/09/2021

Abstract: In order to explore the underlying pathogenesis of CSU (chronic spontaneous urticaria), the relationship between Hp (Helicobacter pylori) infection and CSU risk was analyzed and the levels of sera specific antibodies against Hp in CSU patients were detected. The standard ELISA kit was used to determine the prevalence rate of Hp-infection in the CSU group and the normal control group. Urea-lysed Hp and recombinant Lpp20 protein which was definitely expressed, purified and identified, were respectively pre-coated on microplate, and then all of the sera samples were tested by ELISA assay for their IgE, IgG and IgA antibodies against Hp and Lpp20. The standard ELISA assay showed that the Hp-infection rate was significantly higher in the CSU group (73.46%, 155/211) than that in the control group (51.82%, 71/137) (χ2=17.08, p < 0.001). In ELISA assay, no obvious differences were detected in the levels of sera Hp- or Lpp20-IgE between the CSU(+)Hp(+) group (0.082±0.002, 0.085±0.003) and the CSU(-)Hp(+) group (0.078±0.003, 0.082±0.005) (P1=0.382, P2=0.597). The levels of sera Hp- IgG and IgA in the CSU(+)Hp(+) group (1.053±0.022 and 0.660±0.022, respectively) were obviously lower than those in the CSU(-)Hp(+) group (1.222±0.034 and 0.849±0.037, respectively) (P1=0.000, P2=0.019). The levels of sera Lpp20- IgG or IgA showed no obvious differences between the two groups (1.459±0.012, 1.494±0.016, P1=0.087; 1.229±0.020, 1.251±0.033, P2=0.548). In conclusion, Hp infection was found to be closely related to CSU attack, but the specific sera antibodies of Hp and Lpp20 were not critical factors to trigger urticaria.

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  • 慢性荨麻疹(Chronic urticaria，CU)是以反复发生的风团、瘙痒为主要表现的常见疾病，病程常迁延达6周以上. CU的病因复杂且隐匿，因此将大多数(>80%)无明显诱因的CU归为慢性自发性荨麻疹(Chronic spontaneous urticaria，CSU)[1]. 大量研究表明，CSU患者常同时伴随幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染，经规范抗Hp治疗后，大部分患者的荨麻疹症状可得到缓解或完全消退，这些研究均提示Hp感染和CSU发病有着非常密切的相关性[2-5].

    肥大细胞的激活是荨麻疹发病的关键，它常由其胞膜外的FcεRI受体和IgE交联触发[1]. 关于Hp相关体液免疫与CU发病机制的研究一直热度不断，Hizal等[6]发现血清抗Hp IgG阳性的荨麻疹患者自体血清皮肤试验阳性率(40%)显著高于血清抗Hp IgG阴性的荨麻疹患者(14.3%)，而自体皮肤血清试验已被广泛用于检测与CSU发病密切相关的抗肥大细胞FcεRI抗体，Sun等[7]也发现抗Hp抗体阳性和抗TGAb阳性的CU患者血清抗FcεRI抗体阳性率较对照组显著增高. 但也有一些研究表示Hp感染与致CSU发病的自身抗体的产生无关[8]. Hp是一种能长期定植于胃肠道粘膜上皮细胞的微需氧革兰氏阴性杆菌，宿主持续的带菌状态可产生特异性体液免疫，导致感染局部粘膜和全身抗Hp特异性抗体高表达，包括IgA，IgE和IgG类抗体. 鉴于肥大细胞的胞膜外尚有多种正性效应的受体，除了对IgE表现高亲和力的FcεRI受体外，循环免疫复合物受体、低亲和力的IgG受体、补体受体等的特异性结合也可促使肥大细胞活化. Acuña等[9]对30例CU进行检测，其中血抗Hp IgG抗体阳性率为60.0%，IgM阳性率为33.3%；Galadari等[10]也发现血清抗Hp IgG，IgM抗体阳性率在CU患者中显著增高；Rostamy等[11]对43例CU患者血清特异性抗Hp-IgG，IgA，IgG联合IgA进行检测，发现阳性率分别为72.1%，46.5%和44.18%，与40例正常对照(37.5%，40%，27.5%)比较差异具有统计学意义；Liutu等[12]甚至用免疫印迹的方法在Hp中发现了IgE结合表位，提示Hp诱导的循环细菌特异性抗体可能在CU发病中起了重要作用. 更早期的研究对比均伴Hp感染的CU及非CU患者，前组可检出高滴度血清抗Hp-Lpp20蛋白的IgG，IgA抗体，这也是目前为止仅有的一项提出Hp具体蛋白成分特异性抗体参与CU发病的研究[13]. 但到目前为止，Hp介导的体液免疫和CU/CSU发病的相关研究样本数量较少，针对大样本的CSU血清抗Hp和其Lpp20蛋白抗体水平的研究鲜有报道，迫切需要在CSU大样本中调研Hp特异性抗体水平，并探讨其可能的致病机制. 本研究拟纳入较大样本的CSU患者及对照组，检测各组血清抗Hp和抗Hp-Lpp20的IgE、IgG和IgA水平，明确抗体分布情况，并探讨Hp感染促发的体液免疫在CSU发病中的角色及可能的机制.

1.   材料与方法

    1.1.   材料

    1.1.1.   血清样本、菌株、质粒

  • CSU病例的血清样本：2014年7月-2015年1月在重庆大坪医院就诊并确诊为CSU的211例患者，其中112例女性(排除妊娠)，99例男性，年龄为14-69周岁(38.79±4.22岁). 本研究纳入的CSU：①均符合2018年欧洲变态反应和临床免疫学(EAACI)会议的CSU诊断标准[1]；②病程6周至7年不等，平均1.8年；③无用药史，近一周否认抗组胺治疗，近一月否认使用糖皮质激素、免疫抑制剂；④否认重大基础疾病及遗传、传染病病史；⑤从未接受过规范的抗Hp治疗. 健康对照组的血清样本：同期大坪医院体检中心常规体检结果正常的志愿者，对照组在年龄、性别等一般条件上与CSU组匹配. 纳入志愿者137例，其中73例女性(排除妊娠)，64例男性，年龄为18-66周岁(38.29±3.37岁). 纳入的对照组：①无过敏性疾病病史；②一般检查无异常(二便、血常规，肝肾功)；③无重大基础疾病及遗传、传染病病史；④从未接受过规范的抗Hp治疗. EDTA抗凝管收集各受试者外周静脉血，2 h内静置离心、收集血清. 菌株和质粒Hp 26695标准株购自美国菌种保藏中心(ATCC)；BL21(DE3) 感受态大肠杆菌购自北京天根公司；由本实验室制备的pET22b-Lpp20重组质粒已转入DH5α感受态大肠杆菌，氨苄西林(Amp)抗性[14].

    • 1.1.2.   主要试剂

  • 标准Hp-ELISA血清检测试剂盒购于北京贝尔生物公司；质粒抽提试剂盒购于Omega公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒购于北京达科为公司；Chelating Sepharose Fast Flow纯化柱购于Pharmacia公司；生物素-山羊抗人IgE，IgA购自英国AbD serotec公司；HRP-羊抗人IgG购自北京中杉公司；HRP-链霉亲和素购自美国Abbkine公司；TMB显色液购于北京天根公司；BCA蛋白浓度试剂盒购于Sigma公司；ECL化学发光试剂盒购于上海碧云天公司；N-端测序送中国科学院测定.

    • 1.2.   试验方法

    1.2.1.   Hp感染阳性率测定

  • 用标准的Hp-ELISA试剂盒就CSU组和对照组Hp感染阳性率(抗CagA及HSP联合抗原的IgG抗体)进行检测. 具体操作严格遵守说明书，酶标仪450 nm读取OD值.

    • 1.2.2.   血清特异性抗Hp全菌抗原IgG，IgE和IgA抗体检测

  • (1) Hp的培养和菌体尿素裂解液的制备

    ① 细菌培养[14]：将保种的Hp菌液接种于固体Hp培养基上37 ℃培养长出的菌落，再次接种入布氏肉汤培养基(含10%胎牛血清)扩增到对数分裂期. ② Hp尿素裂解液的制备：菌液用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)重悬洗涤3次，离心后将菌体沉淀加入尿素溶液(8 M)中，充分吹打后即成，BCA法测蛋白质量浓度.

    (2) 抗Hp-IgG，IgE和IgA抗体水平测定

    ① 间接ELISA法测定抗Hp-IgG：20 μg/mL的Hp尿素裂解液包被酶标板，加入1∶40稀释血清100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板后加入1∶3 000稀释的HRP-羊抗人IgG 100 μL/孔，孵育1 h，洗板后拍干板中液体，加入显色液避光显色15 min，终止反应，450 nm读取OD值. 每样本设3复孔，同时设无血清对照孔. ②生物素-亲和素ELISA法测定抗Hp-IgE/IgA：将各血清1∶20稀释后加样入Hp尿素裂解液包被的酶标板，37 ℃，1 h孵育后洗板，加入1∶10 000的生物素-山羊抗人IgE或1∶2 000的生物素-山羊抗人IgA孵育1 h，洗板，加入1∶6 000 HRP-链霉亲和素孵育35 min，加入TMB显色液显色20 min，终止反应，450 nm读取光密度(OD)值. 同时设置复孔及无血清对照.

    • 1.2.3.   血清特异抗Hp-Lpp20-IgG、IgE和IgA抗体检测

  • (1) Lpp20的表达和纯化[14]

    将pET22b-Lpp20-DH5α菌液培养扩增后提取重组质粒DNA并经NdeI+XhoI双酶切鉴定正确，再将质粒转入感受态BL21(DE3)中，构建工程菌pET22b-Lpp20-BL21(DE3)并诱导质粒表达. SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定重组Lpp20蛋白的表达，镍离子亲和层析法纯化蛋白，蛋白浓度测定(BCA)法测定浓度，并送中国科学院进行N-端测序，增强化学发光法鉴定Lpp20重组蛋白的抗原反应性.

    (2) 抗Lpp20-IgG，IgE，IgA抗体水平测定

    取Lpp20以5 μg/mL的质量浓度，将各血清1∶20稀释加入包被好的酶标版中，检测各样本中抗Lpp20-IgG，IgE，IgA抗体水平. 同时设置复孔及无血清对照.

    • 1.3.   统计学方法

  • 使用GraphPad Prism 5.0统计软件进行数据分析并作图，Hp感染的阳性率(%)行卡方检验比较，p小于0.05判定为差异具有统计学意义；正态计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间进行非配对t检验比较，p小于0.05判定为差异具有统计学意义.

2.   结果

    2.1.   CSU组和对照组Hp感染阳性率

  • CSU组和对照组均进行血清抗Hp-ELISA标准试剂盒检测，结果表明，在CSU组中，抗Hp抗体阳性率为73.46%(155/211)，对照组中阳性率为51.82%(71/137)，两组行卡方检验(χ2=17.08，p=0.000)具有统计学意义(表 1)，可认为CSU发病与Hp感染有密切的相关性.

    • 2.2.   Lpp20重组蛋白的表达、纯化和鉴定

  • 将诱导表达的pET22b-Lpp20-BL21用SDS-PAGE凝胶蛋白电泳进行检测，诱导4 h的工程菌在20 kDa附近有新的蛋白表达条带，目的蛋白表达成功(图 1). 目的蛋白的纯化使用镍离子亲和层析法，将不同设置参数下的收集液分别用SDS-PAGE电泳进行检测，其中目的蛋白纯度可达90%，经分子筛浓缩后BCA法测定蛋白质量浓度为2.2 mg/mL(图 2). 重组蛋白的N端测序为NH2-Met-Lys-Asn-Gln-Val，Fasta将此序列与蛋白质数据库进行比较，与预期的Lpp20的N-端蛋白序列一致；重组Lpp20蛋白经增强化学发光法鉴定具有良好的抗原反应性(图略).

    • 2.3.   CSU组及对照组的血清抗Hp全菌抗原和抗Lpp20的IgE，IgG及IgA水平

  • 通过2.1的结果，将CSU组分为：①CSU(+)Hp(+)组，计155例，②CSU(+)Hp(-)组，计56例；将对照组分为：③CSU(-)Hp(+)组，计71例，④CSU(-)Hp(-)组，计66例. 经生物素-亲和素ELISA法测定显示，抗Hp-及抗Lpp20-IgE分别在①，②组间(0.082±0.002 vs 0.074±0.003，p1=0.076；0.085±0.003 vs 0.083±0.003，p2=0.622)；①，③组间(0.082±0.002 vs 0.078±0.003，p1=0.382；0.085±0.003 vs 0.082±0.005，p2=0.597)比较，差异不具有统计学意义(图 3a、图 3d).

    经间接ELISA法测定显示，抗Hp-IgG在①，②组间(1.053±0.022 vs 0.890±0.028，p=0.000)，③，④组间(1.222±0.034 vs 0.816±0.020，p=0.000)比较，差异具有统计学意义，表明Hp感染后，人群中血清抗Hp全菌-IgG水平显著升高；①，③组间(1.053±0.022 vs 1.222±0.034，p=0.000)比较，①组抗体水平明显低于③组，且差异具有统计学意义(图 3b). 抗Lpp20-IgG在①，②组间(1.459±0.012 vs 1.422±0.019，p=0.10)，①，③组间(1.459±0.012 vs 1.494±0.016，p=0.087)比较，差异不具有统计学意义；但③，④组间(1.494±0.016 vs 1.449±0.016，p=0.046)比较，差异具有统计学意义(图 3e). 经生物素-亲和素ELISA法测定显示，抗Hp-IgA在①，②组间(0.660±0.02 vs 0.559±0.030，p=0.01)，③，④组间(0.849±0.037 vs 0.730±0.032，p=0.000)比较，差异具有统计学意义，表明Hp感染后，人群中血清抗Hp全菌-IgA水平显著升高；①，③组间(0.660±0.02 vs 0.849±0.037，p=0.019)比较，①组水平低于③组，且差异具有统计学意义(图 3c). 抗Lpp20-IgA在①，②组间(1.229±0.020 vs 1.124 ±0.033，p=0.005)，③，④组间(1.251±0.033 vs 1.098±0.035，p=0.002)比较，差异具有统计学意义，表明Hp感染后人群中血清抗Hp-Lpp20-IgA水平显著升高；但是①，③组间(1.229±0.020 vs 1.251±0.033，p=0548)比较，差异不具有统计学意义(图 3f).

3.   讨论

  • 越来越多的研究揭示了CSU发病与Hp感染相关[2-5]，在EAACI最新发布的荨麻疹诊疗指南中，已将检测Hp感染情况纳入CSU常规诊疗计划中[1]. 本研究首先用标准化Hp-ELISA试剂盒检测了CSU人群和健康对照中Hp感染阳性率(包括既往感染和现症感染)，数据显示CSU人群中Hp感染阳性率明显高于健康对照，证明Hp感染和CSU发病存在密切的相关性(表 1). 荨麻疹发生的关键病理机制是肥大细胞活化、脱颗粒，继而合成和释放炎性介质，而其中最经典的肥大细胞激活途径是IgE与其胞膜外的FcεRI受体病理性结合，Hizal等[6]发现血清抗Hp IgG阳性的荨麻疹患者自体血清皮肤试验阳性率(40%)显著高于血清抗Hp IgG阴性的荨麻疹患者(14.3%)，而自体皮肤血清试验已被广泛用于检测与CSU发病密切相关的抗肥大细胞FcεRI抗体，Sun等[7]也发现抗Hp抗体阳性和抗TGAb阳性的CU患者血清抗FcεRI抗体阳性率较对照组显著增高，提示Hp感染可能通过诱导产生外周血抗FcεRI抗体升高的途径促进荨麻疹发生；但也有一些研究表示Hp感染和致CSU发病的自身抗体的产生无关. 同时，肥大细胞表面仍分布有其它正性调节受体，如循环免疫复合物受体、IgG受体等，这些受体在特异性体液免疫亢进时和相应的配体结合，也能够引起细胞活化，促进后继炎症反应[1]. 感染Hp后的长期带菌状态可使宿主产生持续性体液免疫，导致感染局部粘膜和循环抗Hp抗体水平增加，包括IgG，IgA和IgE等，虽然这些抗体对于清除Hp定植作用甚微，却可能在其他病理机制中发挥作用. 如已有研究揭示，在伴随Hp感染的CU病例中，血清抗Hp-IgG，IgA水平显著高于伴随Hp感染的非CU对照. Bakos等[13]的研究也发现，在伴随Hp感染的CU受试组中，存在高滴度血清抗Hp-Lpp20-IgG及IgA，这些研究都提示Hp感染介导的体液免疫可能在某些CU发病中发挥了重要作用. 但既往相关研究纳入的样本量极少，迄今未见关于大样本CSU中Hp全菌及Lpp20血清特异性抗体的调研分析，因此本研究就CSU患者和健康对照中抗Hp全菌和其Lpp20血清特异性的IgE，IgG和IgA水平进行调研，以期揭示Hp引起的体液免疫在CSU发病中所扮演的角色.

    本研究通过对受试血清样本细菌特异性IgE进行检测发现，在各受试组中(CSU(+)Hp(+)组、CSU(-)Hp(+)组、CSU(+)Hp(-)组、CSU(-)Hp(-)组)，血清特异性抗Hp全菌-和Lpp20-IgE抗体均处于差异不具有统计学意义的低值水平(组间比较p均大于0.05)(图 3a、图 3d)，表明Hp感染不能有效激发机体的IgE型体液免疫，且所产生的低水平细菌特异性IgE与CSU发病无相关性. 通过检测受试血清中细菌特异性IgG发现，不论在CSU组还是对照组，感染Hp后均能引起外周循环中抗Hp全菌-IgG显著升高(p < 0.05)，但CSU(+)Hp(+)组中抗Hp全菌-IgG水平显著低于CSU(-)Hp(+)组(p < 0.001，图 3b)，揭示在CSU人群中，Hp感染后激发IgG型体液免疫的强度远远小于无CSU人群，我们因此推测虽然感染Hp可诱导宿主产生高水平特异性的IgG抗体，但是这种体液免疫效应并不是促进CSU发病的重要病理机制. 同样的，不论在CSU组还是对照组中，感染Hp后血清中抗Lpp20-IgG水平均升高，但这种升高趋势只在CSU(-)Hp(+)组中差异具有统计学意义，并且CSU(+)Hp(+)组血清抗Lpp20-IgG水平也低于CSU(-)Hp(+)组，但两组间差异不具有统计学意义(图 3e)，因此我们认为Hp感染可以通过其Lpp20蛋白诱导宿主产生较高水平的血清特异性IgG，虽然Lpp20是Hp中具备良好免疫原性的成分蛋白，但它却不是Hp感染致CSU发病的重要病因. 通过检测受试血清细菌特异性IgA发现，不论在CSU组或对照组，感染Hp后都会引起血清抗Hp全菌-和抗Lpp20-IgA显著升高(p < 0.05)，且CSU(+)Hp(+)组中血清特异性抗Hp全菌-IgA水平显著低于CSU(-)Hp(+)组(p < 0.05)，而这两组间的抗Lpp20-IgA水平差异不具有统计学意义(图 3c、图 3f). 我们推测，虽然感染Hp可激发宿主产生血清高水平特异性IgA，而Hp-Lpp20又是参与此反应的具备良好免疫原性的成分，但是这种IgA型体液免疫反应并非Hp感染相关性CSU的主要致病机制. 至于CSU(+)Hp(+)组中抗Hp全菌-IgG，IgA水平较CSU(-)Hp(+)组更低(p < 0.05)，我们推测是由于部分病例Hp感染后更向Th1型免疫反应偏移[15]，表现为血清抗体水平低，而胃肠道粘膜细胞免疫增强使粘膜损伤更严重，细菌或其代谢产物可直接接触胃肠道固有层肥大细胞，进一步使其活化而诱发包括荨麻疹在内的炎症反应；或者也可能是CSU宿主在荨麻疹炎症状态和Hp感染定植的相互作用下，能够通过某些机制削弱Hp介导的体液免疫反应. 已有研究表明，CU患者血清sIL-2R水平与类胰蛋白酶水平显著相关，提示CU患者T细胞活化与肥大细胞脱颗粒成正比，CU患者具有更亢进的外周血T细胞活性[16].

    我们有理由推断，虽然感染Hp可以导致宿主产生高水平的血清特异性IgG，IgA，并且Hp-Lpp20因具备良好的免疫原性；也在Hp感染触发的体液免疫中占有重要权重，但在与Hp感染相关的CSU病程中，Hp细菌特异性抗体的产生并不是主要致病机制，也即Hp并不是通过诱发体液免疫促进CSU发病. 我们认为，机体感染Hp后存在除体液免疫外的其他一些途径促进肥大细胞活化参与CSU发病. 已经有一些研究表明，某些Hp蛋白如VacA和NAP，可通过引起肥大细胞的胞内钙振荡或G蛋白介导的MAPK，PI3K/Akt信号通路活化的方式直接激活人肥大细胞[17-18]，提示Hp感染后极有可能通过直接作用的方式活化粘膜固有层肥大细胞，促进CSU发病. 我们的研究成果也更加全面地对Hp这种直接活化肥大细胞的方式做了补充[19].

    本研究揭示了Hp感染和CSU发病的相关性，首次在大样本的CSU病例中调研了血清特异性抗Hp全菌-及Lpp20-IgE，IgG，IgA水平，论证了Hp血清特异性抗体并非Hp感染相关性CSU的病因. 虽然我们的研究并未完全揭示Hp感染致CSU的发病机制，但却给相关研究提供了新的思路，避免了某些研究资源的浪费.

Figure (3)  Table (1) Reference (19)

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