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锌是地球上所有生物体内必需的一种微量元素，是众多酶的辅助因子，它参与核酸、蛋白质、碳水化合物和维生素等重要物质的生物合成；在生长发育、生殖遗传以及人体免疫等重要生理过程中起着极其重要的作用[1-3].当人体缺锌时，会发生锌缺乏症，出现味觉差、厌食、免疫力减退、生长缓慢与智力发育低于正常等症状[4].而粮食、水果、蔬菜和肉类等食物是人体锌营养的主要来源[5].
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是由动物、植物和微生物体内产生的一类富含半胱氨酸残基和具有金属结合能力的低分子量多肽，具有多种生物学功能[3].在人体中，类金属硫蛋白(Homo sapiens metallothionein-Like，HsMT-L)可分为4个亚型，其中亚型Ⅰ的HsMT1L存在于各种组织和器官中，尤以肝、肾细胞为主，起着对重金属解毒、参与人体所必需的微量元素储存和运输，以及清除自由基等作用[6-7]. HsMT1L基因已在大肠杆菌和酵母中大量表达[8-10]，用于开发该基因在医药、保健和护肤等多领域的应用产品.但在植物上，该基因的表达研究还少有报道.本研究将花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)控制的人源类金属硫蛋白基因HsMT1L导入番茄基因组，初步分析了转基因番茄幼苗对Zn2+的耐受与富集能力，以期为今后培育富Zn2+的优异番茄新种质、探讨HsMT1L对番茄锌代谢的影响、开发利用HsMT1L蛋白等研究奠定基础.
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采用的普通番茄(Solanum lycopersicum L.)品种为Ailsa Craig(AC)，由本实验室繁殖.大肠杆菌菌株XL1-blue、根癌农杆菌菌株LBA4404和双元载体pCAMIBA1301(GenBank登陆号为AF234297) 购自鼎国生物技术有限公司.含有人源类金属硫蛋白基因HsMT1L(GenBank登陆号为X76717) 的中间载体pBK-MT1L(图 1(a))由本实验室构建. 表 1中的引物委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成.
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采用Omega质粒提取试剂盒(Omega公司)提取质粒DNA.采用Omega胶回收试剂盒(Omega公司)纯化电泳分离的DNA.采用Sambrook等[11]酶切与连接方法进行载体构建.通过PCR扩增、酶切和测序鉴定重组质粒.序列测定委托北京六合华大基因科技股份有限公司.
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采用冻融法将双元表达载体转化进根癌农杆菌菌株LBA4404[12]，并采用图 2(a)和表 1所示引物进行PCR扩增鉴定.
采用农杆菌介导的叶盘方法转化番茄AC的离体子叶.番茄种子经20%的次氯酸钠(原液中含5%有效氯)表面消毒后，播种于MS[13]附加10 g/L蔗糖和6 g/L琼脂的固体培养基(pH=5.8) 上.切取即将展开的子叶，在MS附加1.75 mg/L玉米素(ZT)、30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂的固体培养基上预培养2 d，经农杆菌侵染10 min，用无菌滤纸吸去外植体上的多余菌液，接种于MS附加100 mg/L卡那霉素(Kan)、1.75 mg/L ZT、30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂的固体培养基上共培养2天，转接至MS附加100 mg/L Kan、300 mg/L羧苄青霉素(Carb)、1.75 mg/L ZT、30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂的筛选培养基上.早期每2周继代一次，4代后每4周继代一次，并逐渐降低Carb至100 mg/L.分化出的Kan抗性不定芽长至2~3 cm高时，在MS附加100 mg/L Kan、100 mg/L Carb、30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂的固体培养基上生根.生根的小苗洗净培养基后移栽至营养土，在(25±1) ℃、50 μmol/(m2·s)光照强度的培养室内进行炼苗和培养，最后在网室内种植和留种.
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Kan抗性小苗移栽成活，提取新生叶片的gDNA，按图 2(a)和表 1所示引物进行PCR扩增鉴定. HsMT1L基因经高保真PrimSTAR HS DNA聚合酶扩增后委托北京六合华大基因科技股份有限公司测序鉴定.
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野生型番茄AC的Zn2+耐受性实验在(25±1) ℃、80 μmol/m2·s光照强度的培养室内进行.取相同生长时期的6叶1心番茄幼苗，在添加0~3 mmol/L ZnSO4浓度梯度的Hoagland营养液[14]中进行液体培养；其间，每天补充蒸发的营养液以避免离子浓度的改变，每周换一次液体培养基，整个水培过程采用氧气泵进行通氧换气.每天观察并记录番茄植株的根、茎、叶等形态变化，找出番茄幼苗Zn2+致害临界浓度.采用相同的培养方法，在Zn2+致害临界浓度下处理野生型和转基因番茄植株，比较分析形态差异.
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分别取番茄植株的地上部(茎+叶)和根为材料，采用干灰化法消化材料、原子吸收光谱法[15]测定锌含量.采用SPSS14.0统计软件进行方差分析，比较处理间的差异性.
1.1. 植物材料、菌株、载体和引物
1.2. 双元表达载体的构建
1.3. 遗传转化方法
1.4. 转基因植株的鉴定方法
1.5. 锌处理方法
1.6. 锌含量的检测方法
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中间载体pBK-MT1L经Hind Ⅲ酶切后，用Klenow酶补平，再经EcoR Ⅰ酶切，电泳回收9 306 bp大片段，弃853 bp小片段.同时，双元载体pCAMBIA1301经Xba Ⅰ酶切后，用Klenow酶补平，再经EcoR Ⅰ酶切，电泳回收大小为1 030 bp的2x35S启动子片段(图 1(a)).将两个回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞.用引物P5/P7对获得的Kan抗性菌落进行PCR扩增鉴定，得到预期的380 bp大小的目标带(图 1(b)). PCR阳性菌落的质粒DNA经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ分别酶切，得到的10 355 bp大小产物，且比质粒DNA电泳滞后，证实均为单位点；Xba Ⅰ酶切不开质粒，证实没有该位点；Pst Ⅰ酶切得到806 bp、2 011 bp和7 523 bp的目标条带；Ase Ⅰ酶切得到863 bp、1 900 bp和7 518 bp的目标条带(图 1(c))；所有酶切结果正确.测序结果(略)也证实为预期.因此，构成了含有2x35S-HsMT1L基因的双元表达载体pBK-35sMT1L.经冻融法将该载体转化根癌农杆菌LBA4404，用引物对P2/P4和P6/P8进行PCR扩增，分别得到了1 662 bp和811 bp预期大小的产物，筛选到了阳性克隆(图 1(d)和(e)).
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经农杆菌介导转化番茄AC的子叶外植体，在筛选培养基上诱导培养1~2个月后，得到大量卡那霉素抗性的不定芽(图 2(b)).待苗长至3~5 cm高时，在不加任何激素的培养基上诱导生根(图 2(c)和(d)).生根的小植株移栽至土壤(图 2(e))，炼苗成活后提取新生叶组织的gDNA进行PCR鉴定.以位于T-DNA外侧的引物P1与位于T-DNA内侧nptⅡ基因中的引物P3进行PCR扩增，结果显示转基因材料未扩增出1 241 bp大小的产物，表明用于检测的转基因材料的DNA样本中不含有农杆菌双元载体pBK-35sMT1L的污染(图 2(a)和(f)).用P6/P8引物进行PCR扩增，显示12棵植株中有9棵检测到了HsMT1L-Tipt基因的扩增产物(图 2(g))，表明HsMT1L基因整合进了番茄AC的基因组，而P2/P4的PCR产物则显示整合了Pnos-nptⅡ-T35s选择标记抗性基因(图 2(h)).
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在水培条件下，野生型番茄AC幼苗进行0~3.0 mmol/L不同浓度的ZnSO4处理.结果发现，0.6 mmol/L ZnSO4处理的植株表型与对照的相一致，显示该浓度的Zn2+不影响番茄幼苗生长；而1.2，1.8，2.4，3.0 mmol/L的ZnSO4处理4周后，番茄植株呈现新叶发黄、叶心皱缩卷曲(图 3(a)和(b))、茎部出现褐斑、侧根减少(图 3(a))等现象，且随着ZnSO4浓度的增加，植株更为矮小，其中3.0 mmol/L的ZnSO4处理的番茄植株的株高比对照矮15%左右，表明锌毒害症状随锌浓度的增加而变得更加明显(图 3(a)).因此，确定野生型番茄在本试验条件下的ZnSO4临界中毒浓度为1.2 mmol/L.
未加ZnSO4培养时，随机挑选的整合有2x35s-HsMT1L转基因的番茄株系N3和N7比野生型对照生长的较为矮小(图 3(c)).经1.2 mmol/L的ZnSO4处理4周后，N3和N7均未呈现出与野生型相似的失绿发黄的受害症状(图 3(d))，表明2x35s-HsMT1L转基因表达的HsMT1L蛋白赋予了番茄幼苗对Zn2+的耐受性. Zn2+含量测定结果表明，转基因和野生型植株的地上组织或地下组织中Zn2+的含量在处理前没有差别(图 3(e)和(f))，而处理4周后，无论是转基因植株，还是野生型材料，其地下组织的Zn2+含量均远高于地上组织(图 3(e)和(f))，表明根部的吸收和贮藏Zn2+的能力强于地上部分；此外，转基因番茄株系N3的地下和地上组织中的Zn2+含量分别比野生型对照高出35.96%和11.34%，差异均极具有统计学意义，而转基因番茄株系N7仅地下组织的Zn2+含量与野生型材料的差异具有统计学意义.这些结果表明含有转基因2x35S-HsMT1L的番茄幼苗比非转基因对照更能耐受和富集Zn2+.
2.1. 含有人源类金属硫蛋白基因的双元表达载体的构建
2.2. 获得了整合有人源类金属硫蛋白基因的番茄材料
2.3. 含有人源类金属硫蛋白转基因番茄幼苗对Zn2+的吸收和积累能力得到增强
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不同植物对Zn2+的富集能力存在差异.传统的富锌植物是指那些在有效锌含量较低的土壤中能够正常生长，并获得较高产量和较高Zn2+含量的植物；这类植物具有较强的对土壤中Zn2+的主动吸收的能力[16].而本研究获得的转基因番茄在富集Zn2+的机制上不同于传统的富锌植物.表现在对照处理上，转基因番茄与野生型材料之间的Zn2+含量差异不具有统计学意义，仅在施加锌肥的处理上，转基因番茄的Zn2+含量才显著高于野生型材料(图 3).这表明外源HsMT1L基因不能增强转基因番茄对Zn2+的主动吸收，而只是在土壤环境的Zn2+浓度高时，进入植物细胞内的Zn2+浓度也高，HsMT1L蛋白能够螯合Zn2+而增强细胞对高浓度Zn2+的耐受性，从而呈现出能够积累较多Zn2+的特性.
HsMT1L的61个氨基酸残基中有20个半胱氨酸残基，并以半胱氨酸残基为基础，构成了2个金属硫簇，可分别螫合4个和3个二价金属离子，所以HsMT1L具有很强的对二价金属离子的结合能力[2-3].当进入细胞中Zn2+过量时，HsMT1L即可起到解毒作用，因此，含有HsMT1L的转基因番茄表现出较野生型番茄更强的对Zn2+的耐受性(图 3(d)).此外，本研究的HsMT1L基因由2x35S强启动子控制的组成性表达，在根部和地上部分的茎叶中均会得到大量表达，但地上部分积累的Zn2+含量远低于地下部分的根组织(图 3(e)，(f)).这是由于根部优先接触到营养液中的Zn2+离子，大量Zn2+离子被根吸收并被优先截留在根组织.该现象与他人的结果相一致[17].如果采用叶面施肥的方式提供锌元素，则可以减少锌肥施用量，促进转基因番茄地上部分，尤其是果实，对Zn2+的积累.而富Zn2+提高了番茄果实的营养价值，且无论是鲜食还是干燥后的制品，均可提供优质的锌蛋白，满足人们对锌的需求.
MT具有对重金属解毒和很强的抗辐射、抗氧化能力，在医药、保健品和护肤品上具有较大的开发利用价值[3].目前主要从动物的肾组织中提取MT，但存在动物源性污染的担心.在细菌和酵母上发酵制备MT，仍存在生产成本较高等问题.植物生物反应器是目前表达有功效的蛋白的研究热点，具有生产成本低等优势.本研究将人源HsMT1L基因在番茄中组成性表达，有望从高丰量表达的转基因番茄中提取MT，促进MT的研究与应用.