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硅包银纳米颗粒的制备及其光散射法检测腺苷

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李靖云, 韩国斌, 刘建萍, 等. 硅包银纳米颗粒的制备及其光散射法检测腺苷[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2017, 39(9): 113-117. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.09.017
引用本文: 李靖云, 韩国斌, 刘建萍, 等. 硅包银纳米颗粒的制备及其光散射法检测腺苷[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2017, 39(9): 113-117. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.09.017
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Jing-yun LI, Guo-bin HAN, Jian-ping LIU, et al. Preparation of Ag@SiO2 Nanoparticles and Detection of Adenosine by Light Scattering[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(9): 113-117. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.09.017
Citation: Jing-yun LI, Guo-bin HAN, Jian-ping LIU, et al. Preparation of Ag@SiO2 Nanoparticles and Detection of Adenosine by Light Scattering[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(9): 113-117. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.09.017
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硅包银纳米颗粒的制备及其光散射法检测腺苷

  • 1.

    发光与实时分析教育部重点实验室/西南大学 化学化工学院，重庆 400715

  • 2.

    重庆第48中学，重庆 400700

  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(21175109)
详细信息
    作者简介:

    李靖云(1986-)，女，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事发光分析研究 .

    通讯作者: 李原芳，教授

  • 中图分类号: O657

Preparation of Ag@SiO2 Nanoparticles and Detection of Adenosine by Light Scattering

  • 1.

    Education Ministry Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis/School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 2.

    Chongqing Forty-Eighth Middle School, Chongqing 400700, China

  • 摘要: 将腺苷的核酸适配体设计成两段DNA链，一段修饰在硅包银纳米颗粒上，另一段修饰在磁性颗粒上.利用腺苷与其核酸适配体的特异性结合，通过检测磁性分离后上清液中硅包银纳米颗粒的光散射信号变化，实现了腺苷检测.方法的线性范围为8.0×10-6~5.0×10-4 mol/L，线性相关系数(r)为0.981 8，其他的核苷不干扰测定.
    Abstract: Silver nanoparticles (AgNPs) have the property of strong localized surface plasmon resonance scattering, but their stability and functionality are inferior. To solve these problems, silica-coated silver (Ag@SiO2) nanoparticles were prepared by packing a SiO2 layer on AgNPs. Then a new method was designed for adenosine detection by using Ag@SiO2NPs with separation of magnetic particles (MPs). It was found that a linear relationship (ΔILS=666.50+505.18logc) was obtained between the value of ΔILS and the concentration of adenosine in the range of 5.0×10-4-8.0×10-6 mol/L with a correlation coefficient (r) of 0.981 8. Moreover, no obvious effects were detected of other nucleosides on the analysis of adenosine
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  • 图 1  AgNPs与Ag@SiO2NPs的吸收图及SEM图

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    图 2  磁性分离后上清液的光散射光谱图

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    图 3  BSA的浓度对Ag@SiO2NPs的影响

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    图 4  不同核苷(A)和不同DNA(B)对体系的响应结果

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  • [1] LIU Yue, HUANG Cheng-zhi. Screening Sensitive Nanosensors Via the Investigation of Shape-Dependent Localized Surface Plasmon Resonance of Single Ag Nanoparticles [J]. Nanoscale, 2013, 5(16): 7458-7466. doi: 10.1039/c3nr01952g
    [2] HUANG Jing-tao, YANG Xiao-xi, ZENG Qiao-ling, et al. A Simple Green Route to Prepare Stable Silver Nanoparticles with Pear Juice and a New Selective Colorimetric Method for Detection of Cysteine [J]. Analyst, 2013, 138(18): 5296-5302. doi: 10.1039/c3an00901g
    [3] HU Ping-ping, ZHENG Lin-ling, ZHAN Lei, et al. Metal-Enhanced Fluorescence of Nano-Core-Shell Structure Used for Sensitive Detection of Prion Protein with a Dual-Aptamer Strategy [J]. Anal Chim Acta, 2013, 787: 239-245. doi: 10.1016/j.aca.2013.05.061
    [4] OTARI S V, YADAV H M, THORAT N D, et al. Facile One Pot Synthesis of Core Shell Ag@SiO2 Nanoparticles for Catalytic and Antimicrobial Activity [J]. Materials Letters, 2016, 167: 179-182. doi: 10.1016/j.matlet.2015.12.134
    [5] LI Fan, ZHANG Juan, CAO Xu-ni, et al. Adenosine Detection by Using Gold Nanoparticles and Designed Aptamer Sequences [J]. Analyst, 2009, 134(7): 1355-1360. doi: 10.1039/b900900k
    [6] LIU Shu-hua, HAN Ming-yong. Silica-Coated Metal Nanoparticles [J]. Chem Asian J, 2010, 5(1): 36-45.
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    [8] LI Chun-mei, ZHAN Lei, ZHENG Lin-ling, et al. A Magnetic Nanoparticle-Based Aptasensor for Selective and Sensitive Determination of Lysozyme with Strongly Scattering Silver Nanoparticles [J]. Analyst, 2016, 141(10): 3020-3026. doi: 10.1039/C6AN00489J
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-10-16
  • 刊出日期:  2017-09-20

硅包银纳米颗粒的制备及其光散射法检测腺苷

    通讯作者: 李原芳，教授
    作者简介: 李靖云(1986-)，女，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事发光分析研究
  • 1. 发光与实时分析教育部重点实验室/西南大学 化学化工学院，重庆 400715
  • 2. 重庆第48中学，重庆 400700
  • 收稿日期:  2016-10-16
基金项目:  国家自然科学基金项目(21175109)

摘要: 将腺苷的核酸适配体设计成两段DNA链，一段修饰在硅包银纳米颗粒上，另一段修饰在磁性颗粒上.利用腺苷与其核酸适配体的特异性结合，通过检测磁性分离后上清液中硅包银纳米颗粒的光散射信号变化，实现了腺苷检测.方法的线性范围为8.0×10-6~5.0×10-4 mol/L，线性相关系数(r)为0.981 8，其他的核苷不干扰测定.

English Abstract

    全文HTML

  • 银纳米颗粒(AgNPs)具有独特的局域表面等离子体共振(Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)性质[1-2].但是它们在溶液中稳定性较差，同时表面修饰困难.而SiO2具有良好的化学稳定性和光学通透性，并且SiO2比AgNPs更易于进行表面功能化修饰[3-4].因此，本研究利用AgNPs强烈的LSPR特性和SiO2光透性好、易于修饰的特点，制备了Ag@SiO2NPs作为光散射(Light Scattering，LS)探针，并结合磁性颗粒(Magnetite Particles，MPs)在外磁场作用下易于分离的特点，设计了一种分析检测腺苷的新方法.即将腺苷的核酸适配体裁剪为两段DNA单链[5]，一段修饰在Ag@SiO2NPs上，另一段修饰在MPs上.当体系中不存在腺苷时，Ag@SiO2NPs与MPs之间不能通过DNA链发生相互结合，在进行磁分离后，Ag@SiO2NPs依然分散在溶液中，此时，上清液表现出较强的LS信号；而当有腺苷存在时，Ag@SiO2NPs与MPs上的DNA链通过腺苷发生相互作用，两者结合，此时再进行磁分离，Ag@SiO2NPs就会与MPs一同从溶液中分离，上清液的LS信号减弱.通过对溶液中Ag@SiO2NPs的LS信号的监测，实现了腺苷的检测.

1.   实验部分

    1.1.   仪器和试剂

  • F-4500荧光分光光度计(日本日立公司)；UV-3010紫外-可见分光光度计(日本日立公司)；S-4800型扫描电子显微镜(SEM，日本日立公司)；SZCL-控温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司).

    DNA1：5'-NH2-TTT TTT TTT TAC CTG GGG GAG TAT-3'，DNA2：5'-NH2-TTT TTT TTT TTG CGG AGG AAG GT-3'，DNA3：5'-NH2-TTT TTT TTT TCT TAC GGT GGG GCA ATT-3'(上海生物工程技术有限公司)；腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、胸苷(Thymidine)(上海蓝季科技发展有限公司)；正硅酸乙酯(TEOS)、三乙基氨基硅烷(APTES)、牛血清白蛋白(BSA)(美国Sigma-Aldrich公司)；pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol/L)；实验用水均为二次蒸馏水，所用无机试剂均为分析纯.

    • 1.2.   实验方法

    1.2.1.   Ag@SiO2NPs的制备与修饰

  • Ag@SiO2NPs的制备[3, 6]：称取9 mg AgNO3溶于50 mL水中，在剧烈搅拌下，加入1 mL 1%的柠檬酸三钠溶液并剧烈搅拌1 h.将制备好的AgNPs于棕色广口瓶中避光储存.测得AgNPs的吸收峰约在428 nm处(图 1)，统计其平均粒径约为(60±3) nm(图 1(a)).取一定量的AgNPs加入到100 mL无水乙醇中，搅拌加入2 mL氨水.继续搅拌并向溶液中加入5 mL 10 mmol/L的TEOS，待反应24 h结束后，测得其吸收峰位于462 nm处(图 1). Ag@SiO2NPs平均粒径约为(83±3) nm，硅壳平均厚度约为(11±3) nm(图 1(b)).取一定量Ag@SiO2NPs在搅拌下逐滴加入200 μL APTES，反应30 min结束后洗去多余的APTES，最后将产物干燥. Ag@SiO2NPs的修饰：将上述干燥产物重新超声分散于5 mL水中，再加入500 μL 25%的戊二醛，充分反应1 h后，产物用Tris-HCl洗涤3次，之后加入500 μL DNA2，37 ℃孵育过夜，结束后产物用Tris-HCl洗去未连接的DNA2，之后用BSA在37 ℃孵育30 min，封闭未反应的醛基活性位点，最后用Tris-HCl洗去多余的BSA，定容至5 mL，于4 ℃温度下保存备用.

    • 1.2.2.   MPs的制备与修饰

  • MPs的制备[7-8]：称取2.7 g FeCl3·6H2O和1.8 g FeSO4·7H2O溶于100 mL水中，在80 ℃水浴中搅拌15 min后，加入2.8 g NaOH，待生成Fe3O4后继续搅拌30 min，反应完全后洗去未反应的原料，产物用无水乙醇定容至100 mL.取4 mL MPs于25 mL无水乙醇中，搅拌下先加入1 mL TEOS再加入500 μL氨水，继续反应2 h后洗去多余的原料.重新分散后，在搅拌下加入250 μL APTES，反应30 min后用无水乙醇洗去多余的APTES，最后将MPs干燥并收集固体待用.取10 mg上述固体MPs分散于4 mL水中，然后加入1.6 mL水与400 μL 25%的戊二醛混合液，30 min反应结束后，用水洗去多余的戊二醛，再向MPs溶液中加入400 μL的DNA1，定容至4 mL，密封后以37 ℃孵育过夜；将反应的MPs用Tris-HCl清洗3次，之后用BSA在37 ℃孵育30 min，封闭未反应的醛基活性位点，最后用Tris-HCl洗涤3次，定容至4 mL，4 ℃储存.使用相同的方法，在MPs上修饰DNA3.

    • 1.2.3.   实验方法与步骤

  • 在2 mL离心管中依次加入Tris-HCl缓冲液，Ag@SiO2NPs，BSA，MPs，NaCl溶液以及不同量的腺苷，最后定容至500μL.溶液旋涡混匀反应40 min后磁性分离，取上清液在荧光分光光度计上以λem=λex同步扫描激发和发射单色器测定其散射光谱图，激发和发射狭缝宽度均为5.0 nm.

2.   结果与讨论

    2.1.   Ag@SiO2NPs光散射光谱图

  • 如图 2所示，Ag@SiO2NPs表现出较强的LS信号(图 2中线1)，当向体系中加入一定浓度的腺苷时，腺苷与分别修饰在Ag@SiO2NPs和MPs上的DNA链相结合，形成核酸适配体与腺苷的复合物.通过磁场作用，Ag@SiO2NPs与MPs一同从溶液中分离，上清液中的LS强度减弱(图 2中线2-4).

    • 2.2.   实验条件优化

    2.2.1.   BSA用量的优化

  • 在检测过程中发现，Ag@SiO2NPs和MPs之间存在一定的非特异性吸附.因此，通过加入适量的BSA避免非特异性吸附，稳定体系的LS信号.如图 3所示，在无腺苷存在，也不加入BSA的条件下，单独Ag@SiO2NPs的LS强度明显高于磁分离后上清液中Ag@SiO2NPs的强度.但随着BSA的加入，磁分离后上清液中Ag@SiO2NPs的LS强度逐渐与单独Ag@SiO2NPs的接近.而当BSA质量浓度达到0.03 g/L时，强度超过单独Ag@SiO2NPs，说明此时BSA过量.同时，用Ag@SiO2NPs的散射强度(ILSAg0)减去加入不同量BSA后体系散射强度(ILSAg)的差值与Ag@SiO2NPs的散射(ILSAg0)相比的比值关系，即：(ILSAg0-ILSAg)/ILSAg0，也衡量了BSA对体系稳定性的影响(图 3中的嵌入图).实验最终选择加入BSA的质量浓度为0.02 g/L.

    • 2.2.2.   NaCl浓度的优化

  • 对NaCl浓度考察时发现，当溶液中有腺苷存在时，随着NaCl浓度的增大，体系的LS强度随之降低，说明Ag@SiO2NPs随MPs分离的量逐渐增多，并在NaCl的终浓度达到0.3 mol/L时，LS强度降低达到最大值.因此，实验选择NaCl浓度为0.3 mol/L.

    • 2.2.3.   反应时间的优化

  • 在考察时间对反应体系的影响时发现，当反应时间达到40 min时，体系的散射强度趋于稳定.因此，实验选择40 min作为体系的反应时间.

    • 2.3.   选择性实验

  • 在优化条件下，考察了体系选择性.从图 4可以发现，用不同核苷(图 4(a))进行实验，体系并不会产生有意义的LS信号降低.同样，如果选用非腺苷的核酸适配体的DNA3(图 4(b))时，即便体系中有腺苷存在，LS信号响应值依然很低.实验证实此分析方法对检测腺苷具有较好的选择性.

3.   分析参数

  • 在优化条件下，Ag@SiO2NPs在475 nm左右的散射强度的降低值(ΔILS)与腺苷的浓度(c)在5.0×10-4~8.0×10-6mol/L之间有较好的线性关系：ΔILS=666.50+505.18logc，线性相关系数r=0.981 8.

4.   结论

  • 本研究制备出以AgNPs为核、SiO2为壳的复合纳米颗粒.这种纳米颗粒不仅克服了AgNPs易聚集，不易修饰的缺点，还保持了AgNPs所固有的强散射信号.运用制备的Ag@SiO2NPs作为散射信号探针，结合MPs易于分离的优势，设计了基于磁性分离检测腺苷的新方法.对比AgNPs，Ag@SiO2NPs作为散射探针具有更好的稳定性和易于表面功能化的优点，有望在分析检测、细胞成像等领域得到更广泛的应用.

参考文献 (8)

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