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魔芋属Amorphophallus Blume是天南星科Araceae多年生草本植物，分布范围只在亚洲和非洲，但非洲至今未人工栽培[1].中国云南南部及中南半岛蕴藏着丰富的野生魔芋资源和较为原始的种群，因此被认为是魔芋初生起源中心[2-3].目前，魔芋属共记载了163个种，可分为3个类型：葡甘聚糖型，如白魔芋、花魔芋等；淀粉型，如疣柄魔芋、甜魔芋及南蛇棒等；中间型，如攸乐魔芋、西盟魔芋等[4].西盟魔芋和白魔芋为中国特有的魔芋种，白魔芋的肉质为白色，是刘佩瑛、陈劲枫1984年发现并命名的新种[5].珠芽魔芋是一种繁殖方式独特的野生驯化魔芋种，其起源于热带雨林，耐高温高湿，主要分布于中国云南南部、缅甸北部、老挝、泰国北部及印度尼西亚热带雨林等地区[6].疣柄魔芋分布较广泛，例如越南、泰国、老挝、缅甸、印度、孟加拉国、马来西亚及我国的云南、广西、广东、海南、香港等地区均有分布[7].
魔芋有一个重要特性，即“花叶不见面”，一般情况下，一株魔芋只有花器或者叶片.魔芋一般需要3~5年才能分化出花芽，不同的魔芋种其开花的时间也不一样，这给魔芋花粉的收集与研究带来很大困难.前人的研究结果证明，孢粉学是植物分类的一个重要依据[8].花粉的形态特征受遗传基因控制，具有较强的稳定性与遗传保守性，不易受环境因素影响，因而可以利用花粉粒大小、形状及外壁纹饰研究植物分类与进化关系[9].但国内外对魔芋属植物花粉的研究相对较少，国外有利用光镜和透射扫描电镜发现花魔芋花粉无萌发沟[10]的报道；Punekar S A等[11]对印度的高止山脉西北部到孔坎地区8个类群的魔芋花粉进行外部形态和地理的关系以及对魔芋花粉类群传粉生态学的研究.国内龚先友[4]利用光镜和扫描电镜观察了魔芋属6个种的花粉，与Wang Liping等所观察的结果一致[12]，但都只是对魔芋花粉外部形态特征进行了简单描述，未对其分类鉴定及系统演化进行更深入研究.
本研究以魔芋属4个种的17份资源为主要试材，对其花粉形态进行观察，结合形态分析和聚类分析结果，比较17份魔芋花粉的异同，旨在对魔芋品种分类及鉴定提供孢粉学依据，并对魔芋系统演化及植物亲缘关系研究提供参考.
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本试验材料均来自西南大学魔芋研究中心资源圃，17份魔芋资源分别为：白魔芋(金阳白魔芋、老圃10号、细叶白魔芋)，西盟魔芋(西双版纳黄魔芋、西盟B、西盟C、西盟E、西盟F、2010-023、西盟G、西盟D)，珠芽魔芋(缅甸珠芽A、缅甸珠芽B、缅甸珠芽种子、2010-052)，疣柄魔芋(疣柄魔芋A、疣柄魔芋B).参照蒋学宽[13]对魔芋新品种形态性状的描述，对供试魔芋花器的典型性状进行观察与测量，包括花序柄长(L≤15 cm，极矮；15 cm≤L≤29.8 cm，极矮到矮；29.8 cm≤L≤44.6 cm，矮；44.6 cm≤L≤74.2 cm，中)、佛焰苞形状(舟状、披肩状)，肉穗花序/佛焰苞(短于、略短于、相等、略长于、明显长于)，附属器颜色(灰白、浅黄、淡紫色、棕褐色、紫色)，中性器官(L≤0.5 cm，极短；0.5 cm≤L≤0.89 cm，极短到短；0.89 cm≤L≤1.28 cm，短；1.28 cm≤L≤1.67 cm，短到中；1.67 cm≤L≤2.06 cm，中；2.06 cm≤L≤2.45 cm，中到长；2.45 cm≤L≤2.84 cm，长)等重要的花器外部特征.材料具体信息如表 1.
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试验于6月-7月初的晴天在资源圃收集花粉.对刚散粉的魔芋，用手抖动附属器，将花粉抖落在硫酸纸上，倒入小瓶中，置于含硅胶的干燥器中干燥6 h，后将花粉置于4 ℃冰箱内密封干燥保存，备用. 8月底进行扫描电镜实验，将样品用牙签均匀粘在粘有导电胶的样品台上，于真空喷镀仪中镀铂，在SEM(日立S-450，日本)下观测，选择具代表性的花粉分别在300×，700×，1 500×，3 500×进行花粉群体、极面观、外壁纹饰的扫描.每个样品选取有代表性的花粉粒20粒，观测其形态特征并拍照.
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利用CAD软件测量花粉的数量性状，即极轴长(P)、赤道轴长(E)、P/E(表示花粉粒形状(P/E＞2为超长球形，1.14＜P/E＜2为长球形，0.88＜P/E＜1.14为近球形)、条脊宽、条脊距.结合电镜显微标尺长度计算其实际长度，用EXCEL进行统计.
对极轴、赤道轴、P/E、条脊宽、条脊距等定量指标取其数值，花粉形状和外壁纹饰定性指标进行标准化转换后，利用SPSS22.0软件采用欧氏距离和组内连接法进行聚类分析.其中定性数据采用二元赋值法进行赋值，肯定状态为“1”，否定状态为“0”.
1.1. 材料
1.2. 方法
1.3. 数据统计
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利用扫描电镜对17份魔芋资源的花粉进行形态观察，结果显示，疣柄魔芋花粉为深黄色，其余魔芋花粉为浅黄色.根据Erdtman分级标准(以花粉最长轴的长度来表示)，参试魔芋花粉属于大花粉(50~100 μm)(表 2).由图 1所示，西双版纳黄魔芋、缅甸珠芽A、缅甸珠芽种子、疣柄魔芋A、疣柄魔芋B的形状为近球形，其余魔芋花粉形状为长球形.极面观为近圆形或扁圆形，均无萌发沟或萌发孔，其中，缅甸珠芽A、缅甸珠芽种子、疣柄魔芋A和疣柄魔芋B无明显的极轴区分，可能是由于无极点或无明显区别的赤道面观和极面观.
花粉极轴最大的是缅甸珠芽A(94.27 μm)，最小的是西双版纳黄魔芋(48.06 μm)，两者之间差异显著；赤道轴最大的是缅甸珠芽A(87.15 μm)，最小的是西盟F(31.45 μm)；P/E最大的是西盟F(1.65 μm)，最小的是2010-023(0.73 μm)，两者之间差异显著.珠芽类魔芋和疣柄类魔芋花粉外壁无条纹纹饰，白魔芋和西盟魔芋花粉外壁条纹中，条脊宽最大的是老圃10号(2.32 μm)，最小的是西盟G(0.55 μm)，两者之间差异显著；条脊距最大的是西盟G(1.70 μm)，最小的是西盟F(0.50 μm)，两者之间差异显著.
在4个魔芋种之间，分属珠芽魔芋和疣柄魔芋的花粉粒大小绝大部分大于白魔芋和西盟魔芋花粉粒，在珠芽魔芋中，以缅甸珠芽A花粉粒最大，极轴长度为94.27 μm.分属珠芽魔芋和疣柄魔芋的花粉粒大小差异不显著.分属白魔芋和西盟魔芋的花粉条脊宽和条脊距的差异较小.
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从花粉外壁纹饰来看，白魔芋和西盟魔芋(图 1)花粉均是条纹状纹饰，且纹饰较致密，多数有着较为规则的平行纹饰，只有老圃10号(图 1-2A)的条脊大小不均，不连续且无规则分布.魔芋花粉的外壁上均无穿孔，其条脊分支较少，且花粉外壁存在不同程度的凹陷.由极面观看，细叶白魔芋(图 1-3B)花粉外壁有断裂.西双版纳黄魔芋花粉外壁附有粘着物(图 1-4A).西盟F外壁条纹走向明显区别其他花粉粒外壁纹饰.西盟F和西盟G极轴端呈螺旋状.珠芽魔芋和疣柄魔芋花粉外壁无条纹状纹饰，其中，珠芽魔芋A、珠芽魔芋B、2010-052和疣柄魔芋B花粉外壁较光滑，珠芽魔芋种子和疣柄魔芋A花粉外壁较粗糙.珠芽魔芋A外壁上出现了假沟.由花粉群体观可以看出，参试魔芋属花粉有不同程度的败育花粉存在.
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聚类分析结果表明(图 2)，17份魔芋资源的花粉可以分为4个类群.第一类群是西盟B、西盟E、细叶白魔芋、2010-023、西盟D、西盟F、西盟G、金阳白魔芋、西盟C、老圃10号、西双版纳黄魔芋，花粉外壁特点是，均有条纹状纹饰，且大多数条脊走向较平行规则，球形花粉大小为48.06~57.33 μm，P/E值为1.14~1.70，这些魔芋的花外部形态(表 1)为佛焰苞均为舟状，且均有中性器官；第二类群是缅甸珠芽B和2010-052，花粉外壁无条纹状纹饰且表面较光滑，球形花粉大小为60.44~71.79 μm，P/E值为1.35~1.36；第三类群是疣柄魔芋A、疣柄魔芋B和缅甸珠芽种子，花粉形状为近球形且球形花粉大小为52.41~71.99 μm，花的外部形态共同点是花序柄极矮，佛焰苞形状为披肩状；第四类群是缅甸珠芽A，花粉形状为近球形且花粉最大，为94.27 μm，P/E值为1.08，明显区别于其他花粉.
2.1. 花粉外部形态特征观察比较
2.2. 花粉外壁纹饰特征
2.3. 聚类分析
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通过对17份魔芋资源的花粉形态观察发现，魔芋种间花粉形态在花粉粒大小、花粉形状、条脊宽、条脊距、纹饰类型上有相同之处，同时又存在一定差异，说明每个品种花粉各有其独特的形态特征.观察发现，白魔芋和西盟魔芋花粉外壁纹饰为条纹状纹饰，与龚先友研究结果一致，其与疣柄魔芋和珠芽魔芋花粉的外壁纹饰存在明显不同；珠芽魔芋花粉和疣柄魔芋花粉外壁存在光滑或粗糙的情况，这与Sachin A的结果存在差异. 4个种的魔芋资源的花粉外壁上均无穿孔，与芦建国等[14]研究的梅花花粉外壁上存在穿孔的情况明显不同.魔芋属花粉形状为长球形或近球形.在种的水平上，不同种魔芋的花粉粒大小也存在一定差异.白魔芋花粉大小为51.46~54.34 μm，P/E值为1.34~1.51，条脊宽为0.66~1.03 μm，与珠芽魔芋和疣柄魔芋存在明显差异.珠芽魔芋花粉大小为52.41~94.27 μm，均无条脊，其中缅甸珠芽A大小为94.27 μm，(图 1)可明显区别于其他花粉.西盟魔芋花粉大小为70.76~71.99 μm，就花粉大小而言，与珠芽魔芋差异不大.西盟魔芋的花粉大小为48.06~57.33 μm，P/E值为1.14~1.70，与白魔芋花粉差异较小.此外，聚类结果显示，白魔芋和西盟魔芋聚为一类，而白魔芋和西盟魔芋花的外部形态特征共同点是佛焰苞为舟状且均有中性器官，与其花粉的形态特征的共同点表现出一致性.疣柄魔芋与缅甸珠芽魔芋聚为一类，其共同点是花粉形状为近球形，花的外部形态共同点是花序柄极矮，肉穗花序明显长于佛焰苞.
武海霞等[15]在研究桉树花粉形态时指出，花粉粒外部形态细微特征的差异可作为种间鉴别的重要依据.魔芋不同种的花粉形态特征及花外部形态存在的差异，可为其品种分类及鉴定提供参考. 4种魔芋花粉虽然在外壁纹饰和花粉大小上存在一定差异，但是，白魔芋花粉与西盟魔芋花粉在花粉大小、形状、外壁纹饰及条脊宽度与距离上相似，珠芽魔芋与疣柄魔芋在这些指标上也存在相同之处，所以依据不同种魔芋花粉外部形态特征的差异，综合运用形态学、孢粉学、细胞生物学、地质学等，可为魔芋品种的分类鉴定提供重要参考及科学依据.
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关于花粉大小的演化顺序，目前公认比较原始的是被子植物花粉体积都是比较大的，花粉是由大到小进化[16].然而刘庚峰等[17]在对宽皮桔子花粉形态的研究结果显示，花粉是由小到大进化的.在所研究的17份魔芋属植物中，缅甸珠芽A花粉最大，为94.27 μm，西双版纳黄魔芋花粉最小，为48.06 μm，而珠芽魔芋既有三倍体也有二倍体[18]，西盟魔芋是二倍体，庄东红等[19]的研究报道花粉粒的大小与染色体基数和倍性呈显著正相关的关系，所以就花粉大小的演化的关系，有待进一步佐证. J.W.Walker[20]指出，被子植物花粉萌发孔类型的进化：远极槽、远极三岐槽、环槽、远极单孔、近极孔、近极槽-近极单孔、无萌发孔、双槽-双孔、散孔、沟和孔.本试验所观察的17份魔芋花粉均无萌发孔或萌发沟，所以从萌发孔的角度看，魔芋属植物是属于较原始类群.从花粉外壁纹饰看，白魔芋类和西盟魔芋类花粉壁上均是条纹状纹饰，而珠芽类和疣柄类花粉外壁有光滑也有粗糙的，J.W.Walker认为被子植物纹饰演化的趋势是：表面光滑表面具小穴、小沟状雕纹表→面棒状、鼓锤状、刺状→表面皱波状、网状、条纹状，白魔芋和西盟魔芋花粉外壁存在条纹状纹饰，疣柄魔芋和珠芽魔芋花粉外壁存在光滑或粗糙的情况，而花粉形状的演化趋势是：舟形→纵长形(单沟)→球形→扁球形(具沟)→球→圆球形→长球形，魔芋属植物花粉中白魔芋和西盟魔芋多为长球形，疣柄魔芋和珠芽魔芋花粉形状有长球形，也有近球形，可见，从花粉外壁纹饰及花粉形状的演化趋势看，西盟魔芋和白魔芋是较进化种.