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番茄是我国重要的大宗蔬菜之一，其较高的营养价值和经济价值使得番茄的种植面积和复种指数不断增加[1].日光温室番茄的主要种植形式分为春秋茬(早春茬和秋冬茬)和越冬茬[2].其中，秋冬茬和越冬茬的育苗期和苗期正处于高温干燥条件，此环境有利于黄化曲叶病毒在传播媒介烟粉虱体内的增殖和传播，有利于根结线虫和叶霉病病菌的繁殖[3-5].黄化曲叶病毒主要由烟粉虱进行传播，传播快，为害严重，对番茄品质和产量造成了严重的影响[6].黄化曲叶病毒病自20世纪60年代被报道，90年代传入中国，并逐渐自南向北为害中国番茄生产，给我国番茄产业带来了巨大的影响[7]. 2009年，河北省在邯郸、邢台、石家庄、衡水等地发现了番茄黄化曲叶病[8]，目前已广泛分布于陕西、广西、上海、安徽、河北、山东、河南等20多个省(区、市)的设施蔬菜产区，对中国番茄产业的可持续发展构成严重威胁[9].根结线虫病是一种常见的为害番茄生产的极难防治的土传病害，其寄主广泛，可造成作物减产，甚至导致绝产，容易引发枯萎病等其他土传病害[10]. 2006年，南方根结线虫已遍及河北省的11个地级市[11].解决以上对番茄产量和品质影响较大病害的最为直接有效的方法是选用含有多个抗性基因的番茄品种.近年来，本团队在番茄耐贮运、硬度及可溶性固形物等品质方面的研究较为集中[12-14].在本试验中，主要针对秋冬茬所种植的14个番茄品种的抗病及植株、果实等性状进行初步统计，即运用分子生物学技术，检测生产上应用较多的番茄抗病基因Ty-1，Ty-2，Ty-3[15]，根结线虫抗病基因Mi-1[10]及叶霉病抗性基因Cf-9[16]，结合其在秋茬的田间表现以及其他的一些性状的调查结果，比较各材料的综合条件，筛选出适合河北省日光温室秋冬茬多抗、优良的番茄品种.
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试验材料由河北省高邑县鄗丰蔬菜专业合作社提供，共14份：其中，01，05，06，13，14，21，30为自育杂交组合；14-6，14-8，152，940，金棚8B，秋帅为西安金鹏种苗有限公司的品种；圣番863为京研益农(北京)种业科技有限公司的品种.
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番茄材料于2017年7月7日播种，采用基质育苗. 8月23日定植在高邑县鄗丰蔬菜专业合作社日光温室内，种植密度为37 500株/hm2，定植采取宽窄行，宽行90 cm，窄行50 cm，株距40~50 cm.利用温室自带的烟粉虱、病菌及含根结线虫的病土自然接种，进行简单的黄化曲叶病毒病、根结线虫及叶霉病的抗病观察.于2017年11月到12月进行植株性状、果实性状等的调查统计，并取不同材料的叶片进行Ty-1，Ty-2，Ty-3，Mi-1和Cf-9共5个抗性基因的分子检测.
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取各个待测材料的幼嫩叶片，研磨后利用CTAB法提取番茄基因组DNA，用TE缓冲液溶解，于-20 ℃保存.
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试验所用引物由华大基因科技服务有限公司合成，GoldView I型核酸染色剂购自北京索莱宝科技有限公司，EasyTaq DNA聚合酶等购自北京全式金生物技术有限公司.
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番茄抗性基因Ty-1，Ty-2，Ty-3的分子标记引物参照河北省地方标准番茄抗黄化曲叶病毒品种苗期快速鉴定技术规程，Mi-1和Cf-9的分子标记引物参照华中农业大学番茄课题组所设计的引物.
PCR反应各组分如下：DNA适量，引物各0.2 μM，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 0.2 mM，EasyTaq DNA聚合酶2.5 U，ddH2O补足至25 μL.反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s(Ty-1，Ty-2，Ty-3，Mi-1和Cf-9的退火温度为55~57 ℃)，72 ℃延伸(延伸时间根据延伸速度及片段大小计算)，共35个循环；72 ℃后延伸10 min.
PCR产物加入6×Loading Buffer，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，120 V，30 min左右后在凝胶成像系统保存图像并统计结果.
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对每个材料的5~10棵植株的形态特征和生物学特性等进行调查统计，包括生长习性、田间生长势、株高、首花序节位、花序类型、成熟果色、果肩、果形、果肉厚、单果质量、熟性、可溶性固形物、产量等共13个指标.其中，可溶性固形物比例的检测使用手持式折光仪N-10E，测量范围为0%~10%.果形指数=果实纵径/果实横径，0.70＜果形指数≤0.86为扁圆，0.86＜果形指数≤1.00为圆形.
1.1. 试验材料
1.2. 试验设计
1.3. 抗性基因的检测
1.3.1. 番茄总DNA的提取
1.3.2. 引物及试剂
1.3.3. PCR检测
1.4. 性状调查
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以水为阴性对照，对14个番茄材料进行了黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1的检测(图 1).纯合抗病材料为仅出现984 bp的片段，编号分别为1，2，6，14，15；杂合抗病材料为共有984 bp和1 434 bp两条片段，编号分别为3，4，5，7，8，9；仅含有1 434 bp片段的材料不含有Ty-1，编号分别为10，11，12，13.
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以水为阴性对照，对14个番茄材料进行了黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的检测(图 2).纯合抗病材料为仅出现195 bp的片段，本试验中未检测到；杂合抗病材料为共有195 bp和550 bp两条片段，编号分别为8，9，10，11，12，13；仅含有550 bp片段的材料不含有Ty-2，编号分别为1，2，3，4，5，6，7，14，15.
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以水为阴性对照，对14个番茄材料进行了黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的检测(图 3).纯合抗病材料为仅出现510 bp的片段，编号分别为2，6，14；杂合抗病材料为共有260 bp和510 bp两条片段，编号分别为1，3，4，5，7，8，9；仅含有260 bp片段的材料不含有Ty-3，编号分别为10，11，12，13.
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以水为阴性对照，对14个番茄材料进行了根结线虫病抗性基因Mi-1的检测(图 4).纯合抗病材料为仅出现550 bp的片段，编号分别为1，5，7，9；其余为杂合抗病材料，有550 bp和350 bp两条片段，编号分别为2，3，4，6，8，10，11，12，13，14.
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以水为阴性对照，对14个番茄材料进行了叶霉病抗性基因Cf-9的检测.检测Cf-9所用试验方法为显性标记，如图 5所示，含抗病基因Cf-9的材料出现415 bp片段，没有此片段的为不含Cf-9的材料.本试验中，14个材料都含有Cf-9.
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抗性基因检测结果统计详见表 1.试验结果显示，14个材料均含有黄化曲叶病毒病抗性基因、根结线虫抗性基因Mi-1以及叶霉病抗病基因Cf-9.含Ty-1的番茄材料共10个，其中的4个基因型为纯合，6个为杂合；含Ty-2的番茄材料共6个，都是杂合；含Ty-3的番茄材料共10个，7个杂合，3个纯合.含有纯和抗性基因Mi-1的材料共有4个，其余为杂合.含有5个抗性基因的番茄材料共2个，含有4个抗性基因的共8个，含有3个抗性基因的共4个.
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本试验并未使用针对性的病原进行接种，只是依赖于温室自然发病后进行观察，田间发病结果并未发现这14个材料有明显的感病情况.其中，14和14-8的抗黄化曲叶病毒病的能力较好，基本上没有感染；其余12个材料的叶片颜色偏黄，但并没有影响植株正常的生长发育，与温室内明显矮化黄化的无果实或果实少的感病材料(采种时高度在0.5~1 m左右)具有显著差异. 14个材料并未见明显感染叶霉病或根结线虫的情况，即叶面上未见明显的白斑、坏死斑、黄化斑、霉状物和孢子，根系上无根结或根结少于5个.
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如表 2所示，14个番茄材料都属于无限生长类型.其中，01生长势较弱，14，14-8和圣番863生长势较强，05，06，13，21，30，14-6，152，940，金棚8B和秋帅的生长势中等. 14个材料株高为1.30~1.56 m；叶裂刻深浅各有不同. 01，05，06，30，14-6，152，金棚8B和秋帅的首花序节位为6-7位，14，21，14-8，940的首花序节位为7-8位，13和圣番863的首花序节位为8-9位；05，06，21，14-6为单双歧花序都有，其余为单歧花序.成熟果色都为粉红色，其中，21的颜色较深；成熟果无绿肩(圣番863在未成熟时有绿肩，成熟时消失)；通过计算果形指数，01，06，13，14，30，14-8，940，金棚8B，秋帅和圣番863的果实形状为圆形，其余为扁圆；果肉厚为0.62~0.80 cm；05和圣番863果肉厚最大，14-6果肉厚最小；单果质量为162.50~238.33 g，14的单果质量最大，14-8的单果质量最小；01为早熟，13和圣番863为晚熟，其余为中熟. 14个番茄材料的可溶性固形物比例为4.00%~5.22%，风味较好，14-8的可溶性固形物比例最高(5.22%)，其次为金棚8B(5.10%)；14的产量最高，其次为152.
综合抗病能力以及田间表现，14，21和金棚8B的坐果率高，果形及果色好，果实均匀，抗病能力强，单果质量在200 g左右，可溶性固形物比例较高，比较适宜日光温室秋冬茬番茄的种植及市场需求.
2.1. 番茄抗性基因的检测
2.1.1. 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1的检测
2.1.2. 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的检测
2.1.3. 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的检测
2.1.4. 根结线虫病抗性基因Mi-1的检测
2.1.5. 叶霉病抗性基因Cf-9的检测
2.1.6. 基因型分析
2.2. 自然发病的抗性观察结果
2.3. 番茄品种的性状特征
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抗病育种是目前世界范围内番茄育种的重要目标之一，利用分子生物学检测抗病基因可以准确、有效地缩短育种时间，提高育种效率[17].但环境、基因型以及植物本身及其所处的生长阶段都会影响番茄的抗病能力，因此，只通过分子检测并不能确定番茄植株的抗病能力，将分子鉴定结果与田间鉴定结合起来，才能筛选出更符合当地的抗性品种[18].
本试验主要对14个番茄材料进行了黄化曲叶病毒病抗性基因(Ty-1，Ty-2，Ty-3)、根结线虫抗性基因(Mi-1)以及叶霉病抗性基因(Cf-9)的检测，并观察生长在自带病原温室内的番茄对番茄黄化曲叶病毒病、根结线虫病及叶霉病的抗病能力.郑积荣等[19, 4]指出，在含有单个黄化曲叶病毒病抗病基因材料中，含有Ty-2的材料以及含有两个抗病基因的材料均具有较强的抗病能力；含有Mi-1的番茄材料能有效抵制南方根结线虫的为害.于拴仓等[20]指出，Cf-9对我国的2个叶霉病优势生理小种具有较强的抗性.本试验中的番茄材料，152，940，金棚8B和秋帅仅含有Ty-2，其余的材料至少含有两个番茄黄化曲叶病毒病抗病基因，都含有根结线虫病抗病基因Mi-1和叶霉病抗病基因Cf-9，因此都具有对番茄黄化曲叶病毒病、根结线虫病及叶霉病较强的抗病能力.此外，本试验还对这14个材料进行了初步的性状调查.结果显示，14个材料都是无限生长类型，成熟果粉红色，果实圆形或接近圆形，成熟果实无绿肩. 14-8的可溶性固形物比例最高(5.22%)，其次为金棚8B(5.10%)；01为早熟，13和圣番863为晚熟，其余为中熟；14单果质量最大，为238.33 g，14-8的单果质量最小. 01生长势较弱，14，14-8和圣番863生长势较强，05，06，13，21，30，14-6，152，940，金棚8B和秋帅的生长势中等.总的来说，14，21和金棚8B在抗病性、生长势、果形、果色、单果质量、可溶性固形物比例等方面表现较好，商品性较高，基本满足日光温室秋冬番茄的种植和市场需求.