重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米粘虫肠道细菌比较

顾偌铖; 唐运林; 吴燕燕; 牛小慧; 李青晏; 郭志斌; 向丽; 蒋睿轩; 雷云飞; 刘秀; 胡源; 包佳玲; 李田; 韦俊宏; 潘国庆; 周泽扬

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2019.08.002

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重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米粘虫肠道细菌比较

1.
西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室, 重庆 400715

2.
西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室, 重庆 400715

3.
西南大学微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室, 重庆 400715

4.
西南大学生物技术学院, 重庆 400715

5.
重庆市种子管理站, 重庆 401121

6.
江津区农业技术推广中心, 重庆江津 402260

7.
重庆江记农业科技有限公司, 重庆江津 402289

8.
重庆师范大学生命科学学院, 重庆 401331

基金项目: 中央高校基本科研业务费团队项目（XDJK2018AA001）；家蚕基因组生物学国家重点实验室自设课题（2019-03）

详细信息

作者简介:
顾偌铖(1996-), 男, 硕士研究生, 主要从事昆虫肠道微生物的研究;

唐运林(共同贡献者)(1993-), 男, 硕士研究生, 主要从事昆虫肠道微生物的研究 .

通讯作者: 韦俊宏, 博士, 讲师; 潘国庆, 博士, 研究员, 博士研究生导师;

中图分类号: Q93-331

Comparison of Gut Bacteria Between Spodoptera frugiperda and Mythimna seperata Feeding on Sorghum in Chongqing Area

1.
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China

2.
Key Laboratory of Sericultural Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Chongqing 400715 China

3.
Chongqing Key Laboratory of Microsporidia Infection and Control, Chongqing 400715, China

4.
College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

5.
Crop Seed Management Station of Chongqing, Chongqing 401121, China

6.
Jiangjin Agricultural Technology Extension, Jiangjin Chongqing 402260, China

7.
Chongqing Jiangji Agricultural Technology Limited, Jiangjin Chongqing, 402289, China

8.
College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China

摘要: 草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）于2019年5月被发现已经入侵至重庆地区，6月底在江津地区的高粱地中也发现了少量的草地贪夜蛾，同时还发现了大量玉米粘虫（Mythimna seperata）.通过分离培养同一生境内的草地贪夜蛾和玉米粘虫的肠道细菌，结合16S rDNA测序完成了这两种害虫肠道优势菌属水平的鉴定，共分离得到了19个细菌分离株，其中分离自草地贪夜蛾肠道细菌归为5个属，分别为欧文氏菌属（Erwinia），不动杆菌属（Acinetobacter），肠杆菌属（Enterobacter），肠球菌属（Enterococcus），假单胞菌属（Pseudomonas）.分离自玉米粘虫肠道细菌归为6个属，分别为克雷伯氏菌属（Klebsiella），不动杆菌属（Acinetobacter），寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），肠球菌属（Enterococcus），金黄杆菌属（Chryseobacterium），芽孢杆菌属（Bacillus）.同时我们也对采自玉米地和高粱地的草地贪夜蛾肠道微生物优势菌进行了比较分析，在江津高粱地中的草地贪夜蛾中没有发现克雷伯氏菌，但该菌在巫山、巫溪玉米地的草地贪夜蛾中大量存在.结论为进一步研究草地贪夜蛾幼虫肠道核心微生物群奠定了基础.

Abstract: In May of 2019, Spodoptera frugiperda migrated to Chongqing and spread rapidly. It was found in maize fields in several counties and districts. At the end of June, a little S. frugiperda and plenty Mythimna seperata were found in sorghum fields in Jiangjin district. In this study we isolated the intestinal dominant bacteria from the larvae of S. frugiperda and M. seperata, and used 16S rDNA sequencing to identify their dominant genera. In total, we obtained 19 isolates of bacteria, of which Erwinia, Acinetobacter, Enterobacter, Enterococcus and Pseudomonas were identified from S. frugiperda; Klebsiella, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Enterococcus, Chryseobacterium and Bacillus were idenfified from M. seperata. The dominant bacteria types in the gut of the two insects in the same habitat were obviously diffierent although two genera were same. At the same time, we also conducted a comparative analysis of the dominant intestinal bacteria of S. frugiperda in the maize field and the sorghum field. We did not find Klebsiella sp. in S. frugiperda feeding on sorghum in Jiangjin district, which was abundant in the S. frugiperda feeding on maize in Wushan and Wuxi. This work may lay a foundation for further study on the core intestinal microorganisms of the S. frugiperda larvae.

Key words:

OTU ID

样品来源

NCBI ID

RDP ID

草地贪夜蛾

玉米粘虫

OTU1

未分离到

JJM1

Klebsiella

JJM3

JJM5

JJM7

OTU2

JJSF2

JJM2

Acinetobacter

JJM4

JJM6

JJM8

OTU3

JJSF7

未分离到

Pseudomonas

OTU4

JJSF4

未分离到

Enterobacter

OTU5

未分离到

JJM11

Chryseobacterium

OTU6

JJSF3

未分离到

Enterobacter

OTU7

未分离到

JJM12

Bacillus

OTU8

JJSF5

未分离到

Acinetobacter

OTU9

JJSF6

未分离到

Enterococcus

OTU10

未分离到

JJM10

Enterococcus

OTU11

JJSF1

未分离到

Erwinia

OTU12

未分离到

JJM9

Stenotrophomonas

注：JJSF1-JJSF6，JJM1-JJM9分离自粪便；JJSF7，JJM10-JJM12分离自中肠.

重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米粘虫肠道细菌比较

通讯作者: 韦俊宏, 博士, 讲师; 潘国庆, 博士, 研究员, 博士研究生导师;

作者简介: 顾偌铖(1996-), 男, 硕士研究生, 主要从事昆虫肠道微生物的研究 ; 唐运林(共同贡献者)(1993-), 男, 硕士研究生, 主要从事昆虫肠道微生物的研究
1. 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室, 重庆 400715

2. 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室, 重庆 400715

3. 西南大学微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室, 重庆 400715

4. 西南大学生物技术学院, 重庆 400715

5. 重庆市种子管理站, 重庆 401121

6. 江津区农业技术推广中心, 重庆江津 402260

7. 重庆江记农业科技有限公司, 重庆江津 402289

8. 重庆师范大学生命科学学院, 重庆 401331

收稿日期: 2019-07-13

基金项目: 中央高校基本科研业务费团队项目（XDJK2018AA001）；家蚕基因组生物学国家重点实验室自设课题（2019-03）

关键词:

Comparison of Gut Bacteria Between Spodoptera frugiperda and Mythimna seperata Feeding on Sorghum in Chongqing Area

Corresponding author: Jun-hong WEI ;

1. 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室, 重庆 400715

2. 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室, 重庆 400715

3. 西南大学微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室, 重庆 400715

4. 西南大学生物技术学院, 重庆 400715

5. 重庆市种子管理站, 重庆 401121

6. 江津区农业技术推广中心, 重庆江津 402260

7. 重庆江记农业科技有限公司, 重庆江津 402289

8. 重庆师范大学生命科学学院, 重庆 401331

Received Date: 2019-07-13

Keywords:

全文HTML

昆虫的肠道微生物种类和丰度会因食物、地域和生长发育等不同而出现差异，相同地域、相同食物的不同昆虫之间肠道微生物也会存在较大差异. Vanessa等人通过高通量测序研究表明，不同地区、不同环境下的果蝇肠道微生物的组成以及丰度存在差异，但主要优势菌属为乳酸杆菌属以及醋酸杆菌属^[1].向芸庆等人通过传统培养的方法鉴定发现，从柘叶饲养家蚕肠道中分离出的优势菌群与桑叶饲养的家蚕相比，出现了较大差异且不如桑叶饲养家蚕的菌群丰富，并推测这种改变可能与柘叶饲养家蚕生长发育不良、容易患病具有相关性^[2].此外邵勇奇课题组研究发现，家蚕、桑剑纹夜蛾以及桑螟3种以桑叶喂食的昆虫的肠道微生物的组成以及丰度都存在差异^[3].

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，又名秋粘虫、行军虫，起源于美洲，被联合国粮农组织称为“全球重大跨国迁飞性农业害虫”，其食谱广泛，主要包括禾本科、菊科和豆科植物，于2019年初入侵中国并对中国的农业生产造成了巨大威胁^[4-7].美国和巴西已经开展了草地贪夜蛾肠道优势细菌分离鉴定工作^[8-9]，但主要是对玉米地中的草地贪夜蛾肠道微生物进行的研究.本课题组前期研究对在重庆的巫山、巫溪、潼南等地区的玉米地捕捉的草地贪夜蛾进行了生物型以及肠道细菌鉴定分析，在巫山、巫溪地区分离得到了5个属的分离株，分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)，不动杆菌属(Acinetobacter)，假单胞菌属(Pseudomonas)，肠杆菌属(Enterobacter)以及气单胞菌属(Aeromonas)^[10-11].最近在重庆江津地区高粱地同时发现有少量草地贪夜蛾和大量玉米粘虫(Mythimna seperata)的存在，为我们研究取食同一食材的入侵昆虫与当地固有昆虫的肠道微生物提供了很好的素材.

本研究采集了重庆江津地区同一片高粱地中的草地贪夜蛾和玉米粘虫样本，通过传统培养法以及16S rDNA测序对草地贪夜蛾和玉米粘虫的肠道优势菌进行了初步分离鉴定，并对相同生境中两种昆虫肠道优势细菌类型进行了比较.同时我们也对不同食性的草地贪夜蛾肠道微生物优势菌进行了比较分析，以期为后续深入研究草地贪夜蛾核心肠道微生物群奠定基础.

1. 材料与方法

1.1. 实验材料

草地贪夜蛾幼虫(5只)和玉米粘虫幼虫(24只)采自于重庆江津地区高粱地.

1.2. 草地贪夜蛾的生物型鉴定

分别用COI和Tpi基因的引物对所提取的草地贪夜蛾基因组进行PCR扩增，扩增产物送华大基因科技股份有限公司测序，测序结果使用MEGA 6.0进行多重序列比对，剔除冗余的低质量序列后，进行进化树分析.根据COI和Tpi基因具有“水稻型”和“玉米型”的亚型，用ClustalX(1.83)软件分析所得序列的差异位点^[7].

1.3. 草地贪夜蛾幼虫和玉米粘虫幼虫粪便及中肠内容物的收集

将采样得到的草地贪夜蛾幼虫和玉米粘虫幼虫分组，并喂食高粱叶饲养，收集粪便，加入1 mL灭菌的磷酸缓冲液(PBS)后震荡制取粪便原液；在超净工作台上解剖经酒精表面消毒的幼虫，取其中肠置于1.5 mL离心管中，加入1 mL灭菌的PBS，充分震荡制取肠道内容物悬液.

1.4. 肠道细菌的分离

各取100 μL粪便原液与肠道原液分别加入900 μL PBS，梯度稀释，获得10^-3-10^-9稀释度的粪便液和肠液样本.取10^-3-10^-9稀释度的液体样本100 μL涂布于LB平板上，30 ℃培养箱培养24 h，36 h，48 h后，挑取不同形态的单菌落划线培养.

1.5. 肠道细菌的分子鉴定

1) 吸取50 μL裂解缓冲液于PCR管中，挑取单菌落置于PCR管中.

2) 置于80 ℃水浴5 min充分裂解，吸取4 μL裂解液作为模板.

3) 用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，扩增反应体系如下：模板4 μL，引物27F/1492R各2 μL，1 ×TaqMasterMix(purple)42 μL. PCR反应程序为96 ℃，10 min；96 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min 30 s，30个循环；72 ℃，10 min. PCR产物送至华大基因科技股份有限公司测序.

1.6. 数据分析

将得到的测序结果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行序列比对，下载同源性较高的序列，使用MEGA 6.0进行多重序列比对，并进行进化树分析.同时将获得的16S rDNA基因序列在RDP数据的Classifer程序(https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)中进行比对，获得同源性较高序列的相关信息.

3. 讨论

肠道微生物在宿主的生长发育、生理状态和行为特征上起着重要的作用.在果蝇的肠道微生物研究中发现，果蝇共生菌植物乳杆菌可以通过胰岛素信号通路促进果蝇的生长发育，还可以通过与神经元的相互作用调控果蝇的运动，其肠道菌群的稳定对果蝇的寿命也有一定的影响^[12-14].此外，肠道菌群可以促进宿主对食物的吸收利用^[15]，而饮食差异也会对宿主肠道微生物组成造成一定的影响^[16].草地贪夜蛾是一种食性比较广的杂食昆虫，研究取食不同植物的草地贪夜蛾肠道微生物菌群差异，对于分析草地贪夜蛾的核心微生物群，阐明肠道微生物在草地贪夜蛾生长发育中的作用均具有重要的意义.

本文基于细菌培养结合16S rDNA测序的方法对重庆江津地区以高粱为食的草地贪夜蛾和玉米粘虫的肠道优势细菌进行了鉴定.在草地贪夜蛾的肠道中，共分离得到了7个分离株，属于5个属，包括欧文氏菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属和肠球菌属.在玉米粘虫的肠道中，共分离了12个分离株，属于6个属，包括克雷伯氏菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、肠球菌属、金黄杆菌属和芽孢杆菌属.在已有的玉米粘虫肠道微生物报道中，肠球菌属、假单胞菌属、肠杆菌属等是玉米粘虫的肠道优势菌群^[17]，与我们的结果有一定的出入.有报道指出，食叶昆虫从土壤中获取肠道微生物，而不是植物^[18].但我们的分离鉴定结果显示，虽然草地贪夜蛾和玉米粘虫生长在相同环境，取食对象相同，但他们的肠道细菌组成差异较大，仅有不动杆菌属和肠球菌属在二者的肠道中都存在.

随后，我们将江津地区的草地贪夜蛾肠道细菌与巫山、巫溪地区草地贪夜蛾肠道细菌进行比较，发现其肠道微生物组成有着一定的差异，在此前巫山、巫溪采食玉米的草地贪夜蛾的肠道细菌分离中，分离到了大量克雷伯氏菌属^[8]，而在江津采食高粱的草地贪夜蛾幼虫肠道中却没有分离到，但在同一生境下，玉米粘虫的肠道内却又分出了克雷伯氏菌，有可能与本次获得的取食高梁的草地贪夜蛾样本过少有关.在江津地区的草地贪夜蛾肠道中，第一次分离到了欧文氏菌.美国学者在宾夕法尼亚州的草地贪夜蛾中分离得到了克雷伯氏菌属，但在巴西对农药抗性的草地贪夜蛾中没有分离得到^[3].

我们通过纯培养的方法分离得到了取食高粱的草地贪夜蛾和玉米粘虫的肠道优势细菌，初步探究了食物对草地贪夜蛾肠道细菌组成的影响，证明草地贪夜蛾肠道细菌组成会受到环境的影响，为后续研究奠定了基础.但细菌的纯培养受到了诸多因素的限制，如细菌的最适生长条件，培养基偏好性等因素，对肠道优势菌的鉴定造成了一定的影响.因此，我们将在后面的工作中结合细菌培养和16S rDNA测序、宏基因组测序的方法，以便更好地揭示微生物群落结构和多样性的组成，确定肠道优势菌群.

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