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甘蓝BoRALFA1基因的克隆与表达分析

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高启国, 李帅, 姚智广, 等. 甘蓝BoRALFA1基因的克隆与表达分析[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2020, 42(11): 95-101. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.11.011
引用本文: 高启国, 李帅, 姚智广, 等. 甘蓝BoRALFA1基因的克隆与表达分析[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2020, 42(11): 95-101. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.11.011
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GAO Qi-guo, LI Shuai, YAO Zhi-guang, et al. Cloning and Expression Analysis of BoRALFA1 Gene in Brassica oleracea[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2020, 42(11): 95-101. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.11.011
Citation: GAO Qi-guo, LI Shuai, YAO Zhi-guang, et al. Cloning and Expression Analysis of BoRALFA1 Gene in Brassica oleracea[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2020, 42(11): 95-101. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2020.11.011
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甘蓝BoRALFA1基因的克隆与表达分析

  • 西南大学 园艺园林学院/南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715

  • 基金项目: 重庆市自然科学基金项目(cstc2019jcyj-msxmX0340)；大学生创新创业训练计划项目(201910635056)
详细信息
    作者简介:

    高启国(1978-)，男，副研究员，硕士生导师，主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究 .

  • 中图分类号: Q786;635.1

Cloning and Expression Analysis of BoRALFA1 Gene in Brassica oleracea

  • School of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University/Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715, China

  • 摘要: 基于前期转录组测序结果，从甘蓝自交不亲和系“A1”材料中克隆了1个RALF(Rapid alkalinization factor)蛋白编码基因，命名为BoRALFA1；该基因没有内含子，CDS全长为240 bp，编码79个氨基酸，包含1个信号肽和5个翻译后修饰位点；成熟肽具有RALF家族典型保守的4个半胱氨酸、YIXY、YXRGC以及RCG基序. BoRALFA1基因主要在花粉中表达.同源序列分析表明该基因在芸薹属中高度保守，表达模式一致，推测BoRALFA1蛋白可能在花粉发育和育性方面具有重要的功能.
    Abstract: A rapid alkalinization factor (RALF) gene, named as BoRALFA1, has been cloned from the self-incompatible 'A1' line of Brassica oleracea based on our former transcriptome analysis result. BoRALFA1 has no intron, its full length of CDS is 240 bp, encoding 79 amino acids. It contains 1 signaling peptide and 5 post-translational modification sites. The mature BoRALFA1 peptide comprises four highly conserved cysteine residues characteristic of the RALF family, a conservative YIXY motif, a YXRGC motif and a RCG motif. BoRALFA1 gene is mainly expressed in pollen. Homologous sequence analysis shows that their sequences are highly conserved in Brassica species, and their expression patterns are identical. It is speculated that BoRALFA1 protein may function in pollen development and pollen fertility.
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  • 图 1  甘蓝BoRALFA1基因的cDNA及其推导的氨基酸序列

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    图 2  甘蓝BoRALFA1基因gDNA和甘蓝02-12系6个编码位点多序列比对

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    图 3  甘蓝BoRALFA1与其他物种RALF蛋白氨基酸序列比对

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    图 4  甘蓝BoRALFA1与其他物种RALF蛋白氨基酸序列系统进化树

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    图 5  甘蓝BoRALFA1和白菜Bra027081基因表达分析

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    图 6  甘蓝BoRALFA1蛋白空间结构

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出版历程
  • 收稿日期:  2020-03-30
  • 刊出日期:  2020-11-20

甘蓝BoRALFA1基因的克隆与表达分析

    作者简介: 高启国(1978-)，男，副研究员，硕士生导师，主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究
  • 西南大学 园艺园林学院/南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715
  • 收稿日期:  2020-03-30
基金项目:  重庆市自然科学基金项目(cstc2019jcyj-msxmX0340)；大学生创新创业训练计划项目(201910635056)

摘要: 基于前期转录组测序结果，从甘蓝自交不亲和系“A1”材料中克隆了1个RALF(Rapid alkalinization factor)蛋白编码基因，命名为BoRALFA1；该基因没有内含子，CDS全长为240 bp，编码79个氨基酸，包含1个信号肽和5个翻译后修饰位点；成熟肽具有RALF家族典型保守的4个半胱氨酸、YIXY、YXRGC以及RCG基序. BoRALFA1基因主要在花粉中表达.同源序列分析表明该基因在芸薹属中高度保守，表达模式一致，推测BoRALFA1蛋白可能在花粉发育和育性方面具有重要的功能.

English Abstract

    全文HTML

  • 小分子分泌型多肽是重要的胞间信号分子，广泛地参与调节植物生长发育、抗病和抗逆等生理过程[1-2].快速碱化因子(Rapid alkalinization factor，RALF)属于植物小分子多肽的一种，最早是由Pearce等[3]从烟草叶片提取物中发现，该蛋白能引起烟草悬浮细胞的培养基快速碱化，过表达时能抑制番茄和拟南芥根的生长和发育.至今已在51种植物中鉴定出795个RALF基因[4].研究表明烟草NaRALF基因沉默后主根更长且毛状体细胞发育成不正常的根毛[5].蒺藜苜蓿根中过表达MtRALF1基因时结节发育不正常[6].在细胞悬浮培养基中加入纯化的甘蔗SacRALF1蛋白能抑制愈伤组织细胞的延伸，在培养基加入AtRALF1导致黑暗条件下萌发的拟南芥幼苗下胚轴伸长受到抑制，幼苗放到没有AtRALF1的培养基时下胚轴的伸长得到恢复[7].拟南芥中过表达AtRALK8基因可以显著增强植株抗干旱和线虫侵染的能力[8].拟南芥AtRALF34调控中柱鞘形成细胞的分化进而影响侧根发育[9].拟南芥AtS1P切割内源的AtRALF23以抑制植物免疫响应，而AtFER可以促进配体诱导的AtEFR，AtFLS2和AtBAK1形成复合体进而激活免疫信号[10].

    在生殖发育方面，人工合成的番茄SlPRALF蛋白能抑制花粉管的伸长，但不影响花粉水化和花粉活力[11].拟南芥AtRALF4可强烈抑制花粉萌发[12].拟南芥花粉AtRALF4/19与BUPS1/2和ANX1/2形成复合体维持花粉管的完整性，柱头AtRALF34与AtRALF4/19竞争性结合BUPS-ANX复合体，在纳摩尔水平就可以引起花粉管破裂[13]. Shi等[14]从白菜中鉴定出38个RALF基因，有14个在核雄性不育和可育性材料间差异表达.前期笔者通过甘蓝转录组测序从自交不亲和甘蓝“A1”花粉中获取了一个RALF基因的编码序列，命名为BoRALFA1，在甘蓝02-12系基因组CDS数据库(http://brassicadb.org/brad/)中检索不到同源序列.本文从甘蓝“A1”克隆了BoRALFA1的CDS序列，进行了生物信息学分析，对BoRALFA1及其同源基因组织表达模式进行了分析，以期为深入研究的BoRALFA1基因的生物学功能提供基础.

1.   材料与方法

    1.1.   供试材料

  • 甘蓝高度自交不亲和系“A1”种植在西南大学十字花科歇马实验基地隔离网内. 2019年3月底甘蓝花期，采集开花当天且长势一致的柱头、花粉、萼片、花瓣和叶片，置于-80 ℃冰箱保存备用.

    利用RNAprep Pure Plant kit(天根，北京)提取RNA，经琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用NanoVue Plus超微量分光光度计(Gen，美国)测定RNA的浓度，然后采用Primescript RT Reagent Kit(TaKaRa，日本)进行反转录合成cDNA的第一条链，-80 ℃冰箱保存备用.以叶片为材料，利用Plant Genomic DNA Kit(天根，北京)提取甘蓝基因组DNA，-20 ℃冰箱保存备用.

    • 1.2.   引物设计和目的基因克隆

  • 利用前期甘蓝转录组测序获得的BoRALFA1序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和BRAD(http://brassicadb.org/brad/)数据库进行BlastN检索，依据检索结果用Primer Primer 5.0软件设计基因特异性引物RALF-1和RALF-2. RALF-1的序列为ATTAATAATAATATGGGGATGTCTGAAAG，RALF-2的序列为TGGTACTCTACTTGGTCGATTCACA.以甘蓝花粉cDNA和基因组DNA为模板，参照PrimerSTAR Max DNA polymerase说明书配制25 μL反应体系. PCR循环参数为：98 ℃预变形3 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min. PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳，回收目的条带送重庆擎科公司测序.

    • 1.3.   甘蓝BoRALFA1基因生物信息学分析

  • 利用在线软件MultAlin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)进行cDNA和gDNA序列比对，用DNAstar软件推导BoRALFA1基因编码的氨基酸序列及其理化性质.利用在线软件SOSUI(http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)分析蛋白的跨膜运域.利用在线软件SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信号肽序列，利用在线Prosite(https://prosite.expasy.org/)分析蛋白活性位点.用BRAD在线数据库进行BlastN检索，分析甘蓝02-12系基因组BoRALFA1基因编码位点，检索白菜、油菜、拟南芥和琴叶拟南芥基因组中高度同源序列.利用在线数据库Phytozome 12(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)查找Brassica oleracea capitata V1.0基因组中同源序列.多序列比对利用MultAlin软件进行，参照高启国等[15]的方法利用MEGA软件并采用邻接法构建系统发育树.利用在线软件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)，以AtRALF8空间结构为模板，构建甘蓝BoRALFA1d的空间结构，用DeepView软件查看和分析生成的空间结构.

    • 1.4.   甘蓝BoRALFA1和白菜Bra027081基因表达分析

  • 以Ubiquitin作为内参基因，RT-PCR分析甘蓝BoRALFA1基因在柱头、花粉、萼片、花瓣和叶片5个组织的表达情况，PCR反应体系和循环参数参照1.2，其中循环为30个. Ubiquitin基因的循环参照Gao等[16]的方法，循环数为22.基于Wang等[17]对白菜Chiifu-401-42的愈伤组织、根、茎、叶、花和果荚6个组织的转录组分析，从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载转录组分析结果(收录号：GSE43245)，利用FPKM值绘制白菜Bra027081基因在6个组织中表达的柱形图.

2.   结果与分析

    2.1.   甘蓝BoRALFA1基因序列与编码位点分析

  • 依据前期转录组测序结果设计特异引物RALF-1和RALF-2，从自交不亲和甘蓝“A1”花粉cDNA和基因组DNA中扩增其cDNA和gDNA序列.测序后序列比对分析表明，BoRALFA1基因没有内含子，其全长CDS为240 bp，共编码79个氨基酸，理论分子量为8.73 kD，等电点为7.80，其中包含9个碱性氨基酸残基(K和R)、8个酸性氨基酸残基(D和E)、25个疏水性氨基酸残基(A，I，L，E，W和N)和23个极性氨基酸残基(N，C，Q，S，T和Y)(图 1).

    在线软件SOSUI分析表明，BoRALFA1蛋白包含1个跨膜结构域，其序列为第4位丝氨基酸位到第25位谷氨酰胺.在线软件SignalP-5.0分析表明，BoRALFA1蛋白具有一个N-端信号肽，可信值达0.992 7，最可能的前体蛋白剪切位点为第28位丝氨酸和第29位精氨酸之间.通过在线PROSITE分析发现：BoRALFA1蛋白含有1个N-端豆蔻酰基化位点，位于第2到第7位氨基酸；2个蛋白激酶(PKC)磷酸化位点，分别位于第6到第8位氨基酸以及第51到第53位氨基酸；1个酪蛋白激酶2(CK2)磷酸化位点，位于第24到第27位氨基酸；1个酪氨酸激酶(TYP)磷酸化位点，位于第53到第60位氨基酸.

    利用BoRALFA1基因序列在甘蓝02-12系基因组数据库进行BlastN检索，发现该基因定位在C09号染色体上，且在该染色体长度为14 134 bp的片段上存在6个BoRALFA1基因的完整编码框串联排列，分别位于C09：34543886..34544125，C09：34546665..34546904，C09：34549444..34549683，C09：34552223..34552462，C09：34555002..34555241和C09：34557781..34558020，多序列比对表明6个位点编码的序列与甘蓝“A1”中BoRALFA1基因序列完全一致，没有核苷酸差异(图 2).

    • 2.2.   甘蓝BoRALFA1同源基因分析

  • 利用甘蓝BoRALFA1基因cDNA序列在芸薹属基因组CDS数据库进行BlastN检索，结果显示甘蓝02-12系基因组中没有注释的相似序列.白菜Chiifu-401-42基因组中Bra027081基因与BoRALFA1的一致性最高，为97%.油菜中有3个基因GSBRNA2T00070572001，GSBRNA2T00020917001和GSBRNA2T00070573001，均与BoRALFA1的一致性较高，分别为99%，98%和97%.在NCBI数据库检索结果表明，BoRALFA1基因cDNA与已报到的油菜RALFbn基因(GeneBank登录号：KC149515)和青花菜BoRALF1基因(GeneBank登录号：DQO59310)完全一致.在拟南芥基因组数据库中检索发现BoRALFA1与AtRALF9和AtRALF15的相似性较高，分别为77%和75%.下载已完成功能分析的拟南芥AtRALF4，AtRALF19和AtRALF34，烟草NaRALF和NtRALF，马铃薯ScRALF3以及杨树PtdRALF1和PtdRALF2的蛋白序列，进行多序列比对，结果见图 3.甘蓝BoRALFA1与油菜RALFbn和GSBRNA2T00070572001、青花菜BoRALF1氨基酸序列完全一致，与上述已进行功能研究的8个RALF蛋白相比，BoRALFA1及其高度同源氨基酸序列的N-端明显较短，且缺少N-保守的RRXL基序[18].在所有的氨基酸序列中C-端序列的相似性较高，有4个高度保守的半胱氨酸、3个高度保守的基序(分别为YIXY，YXRGC以及RCG).

    利用BoRALFA1氨基酸序列在琴叶拟南芥基因数据库中进行BlastP检索，结果显示scaffold_200432.1和scaffold_200431.1与BoRALFA1一致性最高，分别为69%和65%.在甘蓝Brassica oleracea capitata V1.0基因组数据库中进行BlastP检索，结果显示Bo2g011740与BoRALFA1蛋白序列相似性最高为58%.将来自甘蓝、白菜、油菜、拟南芥和琴叶拟南芥中与BoRALFA1相似性较高及其上述已进行功能研究的23个RALF蛋白序列构建系统发育树(图 4).结果显示，共形成了2个主要分支，分支A和B.其中甘蓝的BoRALFA1与来自青花菜、白菜和油菜3个物种的5个高度相似性的基因聚合在分支A2中，表明该基因的分化可能早于物种的分化.已完成功能研究来自拟南芥、烟草、杨树和马铃薯的7个基因聚合在分支B中，与BoRALFA1的遗传关系较远.

    • 2.3.   甘蓝BoRALFA1和白菜Bra027081基因表达分析

  • 为了进一步确认BoRALFA1基因在甘蓝中的表达情况，分别提取了甘蓝“A1”开花当天柱头、花粉、萼片、花瓣和叶片的总RNA，然后进行RT-PCR分析.产物的凝胶电泳结果表明BoRALFA1基因在甘蓝“A1”花粉中表达量较高，在柱头和花萼中表达量较低，在花瓣中表达量极低，在叶片中几乎没有表达(图 5a).甘蓝BoRALFA1基因与白菜Bra027081基因相似度达97%，系统进化分析表明两者在进化上高度保守. Wang等[17]2011年进行了白菜Chiifu-401-42的愈伤组织、根、茎、叶、花和果荚6个组织的转录组分析，笔者从GEO数据库下载其转录组结果，从中分析Bra027081基因在6个组织表达情况，结果表明Bra027081基因主要在花中表达(图 5b).拟南芥中AtRALF9与BoRALFA1基因相似性最高，笔者利用TRAVA网站分析发现AtRALF9基因也主要是在花粉中表达.

    • 2.4.   甘蓝BoRALFA1蛋白空间结构分析

  • 利用在线软件GOR分析表明，BoRALFA1蛋白的二级结构由37.97%的α-螺旋(30个氨基酸)、45.57%的无规卷曲(36个氨基酸)和16.46%的延伸主链(13个氨基酸)组成. Frederick等[19]分析了AtRALF8蛋白的三维空间结构. BoRALFA1和AtRALF8氨基酸序列长度仅存在1对氨基酸差异，分别为79和80个氨基酸，两者全长一致性为59%.利用在线软件SWISS-MODEL，以AtRALF8为模板生成BoRALFA1三维结构.其包含了BoRALFA1成熟肽全部序列，空间上类似于大写字母“M”，序列上高度保守的基序YIXY位于N-端起始位置，裸露于外面，YXRGC和RCG基序分别位于靠近C端“M”顶角的内外两侧，N-端YIXY基序是RALF蛋白与受体结合的核心功能域，C-端可以增强N的活力[20-21](图 6).

3.   结论与讨论

  • RALF蛋白作为重要的胞间信号因子广泛参与植物的多种生理过程.然而至今关于甘蓝RALF蛋白还鲜有报道.本文从甘蓝“A1”材料中克隆的1个RALF蛋白编码基因，命名为BoRALFA1，其全长CDS为240 bp，编码79个氨基酸，包含1个信号肽和5个翻译后修饰位点.在甘蓝02-12系基因组C09号染色体上存在6个串联重复编码位点.序列比对表明BoRALFA1具有RALF蛋白家族典型保守基序[4]，包含4个保守的半胱氨酸残基、N-端YIXY基序、C-端YXRGC和RCG基序.与已经功能鉴定的拟南芥AtRALF4，AtRALF19和AtRALF34[13]，烟草NaRALF和NtRALF[3-5]，及杨树PtdRALF1和PtdRALF2[22]的氨基酸序列相比，BoRALF1蛋白N-端明显较短，且缺失保守的RRXL基序，该基序是RALF前体蛋白加工过程中丝氨酸蛋白酶AtSIP1的识别位点[18, 23]，由此推测BoRALFA1可能存在不同的加工过程.

    甘蓝BoRALFA1与白菜Bra027081、油菜RALFbn和青花菜BoRALF1序列高度一致且在进化上高度保守，表明它们可能具有相似的生物学功能.李焰焰等[24]分析表明油菜RALFbn主要在雄蕊中表达，而在雌蕊、花瓣和萼片中没有表达. Zhang等[25]从青花菜中克隆了BoRALF1基因，发现其主要在花粉中表达. Wang等[17]转录组分析显示白菜Bra027081主要在花中表达，Shi等[14]进一步分析表明白菜Bra027081在可育材料花蕾中高量表达，在核雄性不育材料花蕾中不表达.本文结果显示甘蓝BoRALFA1主要在花粉中表达.因此推测BoRALFA1可能在花粉发育和育性方面具有重要的功能. BoRALFA1蛋白具有保守的N-端YIXY基序，在三维空间结构上裸露于表面.研究表明YIXY基序是RALF蛋白与受体结合的核心功能域[20-21].在已经鉴定的与生殖有关的RALF蛋白中，AtRALF4/19与BUPS-ANX受体复合体结合维持花粉管的完整性，AtRALF34与AtRALF4/19竞争性结合BUPS-ANX复合体，致使花粉管破裂[13-26].先前研究显示拟南芥FEROINA (FER)与AtRALF1作用调控主根细胞伸长，与AtxRALF23作用调控植物免疫反应[10-27]，最新研究表明AtRALF1-FER调控拟南芥的开花时间[28].因此，接下来工作的重点是进一步明确BoRALFA1蛋白的功能，分离其互作蛋白并探究其作用机理.

参考文献 (28)

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