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L-色氨酸-Hg2+-青霉胺体系的荧光光谱及分析应用

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闫晶晶, 张甜, 胡咏梅, 等. L-色氨酸-Hg2+-青霉胺体系的荧光光谱及分析应用[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2022, 44(5): 119-124. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.05.014
引用本文: 闫晶晶, 张甜, 胡咏梅, 等. L-色氨酸-Hg2+-青霉胺体系的荧光光谱及分析应用[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2022, 44(5): 119-124. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.05.014
shu
YAN Jingjing, ZHANG Tian, HU Yongmei, et al. Fluorescence Spectra and Analytical Applications of L-tryptophan-Hg2+-penicillamine System[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2022, 44(5): 119-124. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.05.014
Citation: YAN Jingjing, ZHANG Tian, HU Yongmei, et al. Fluorescence Spectra and Analytical Applications of L-tryptophan-Hg2+-penicillamine System[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2022, 44(5): 119-124. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.05.014
shu

L-色氨酸-Hg2+-青霉胺体系的荧光光谱及分析应用

  • 1.

    西南大学 化学化工学院，重庆 400715

  • 2.

    成都市第二人民医院，成都 610017

  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(21705132)；成都市卫生健康委员会资助项目(2021029)
详细信息
    作者简介:

    闫晶晶，硕士研究生，主要从事分子光谱研究 .

    通讯作者: 胡咏梅：主任医师;  胡小莉，教授

  • 中图分类号: O657.3

Fluorescence Spectra and Analytical Applications of L-tryptophan-Hg2+-penicillamine System

  • 1.

    School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 2.

    Chengdu Second People's Hospital, Chengdu 610017, China

  • 摘要: 基于L-色氨酸(L-Trp)荧光猝灭与恢复，建立了一种高灵敏度、高选择性检测D-青霉胺(D-PA)的荧光分析方法. 实验发现在pH=4.8的缓冲溶液中，Hg2+与L-Trp中的羧基结合，猝灭L-Trp的荧光. 随着D-PA的加入，由于Hg2+与D-PA的巯基产生更强的螯合作用，导致Hg2+脱离L-Try，后者荧光恢复. 据此设计了IMPLICATION逻辑门，并用于D-PA的检测. 在优化条件下，荧光恢复程度与D-PA浓度在0.44~50.0 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.13 μmol/L. 该方法用于青霉胺药片含量的测定，结果满意.
    Abstract: A highly sensitive and selective fluorescence method for detection of D-penicillamine (D-PA) was designed based on the "OFF-ON" fluorescence switch mode of L-tryptophan (L-Trp). The fluorescence of L-Trp turned OFF due to the effective reaction between carboxyl group of L-Trp and Hg2+ in pH 4.8 BR buffer. The thiol group in D-PA could compete with L-Trp for chelating Hg2+, which turned ON the fluorescence of L-Trp. An IMPLICATION logic gate was designed and used for D-PA detection. Under optimized conditions, a good linear relationship was shown between fluorescence recovery and D-PA concentration in range of 0.44-50.0 μmol/L with the detection limit of 0.13 μmol/L. The method was used for the determination of D-PA in medicine with satisfactory results.
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  • 图 1  L-Trp测定D-PA的反应机理

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    图 2  L-Trp-Hg2+-D-PA体系的荧光光谱

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    图 3  pH值对反应体系荧光强度的影响

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    图 4  Hg2+浓度对L-Trp荧光强度的影响

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    图 5  离子强度的影响

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    图 6  探针对不同浓度D-PA的荧光响应

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    图 7  IMPLICATION逻辑图

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    表 1  共存物质的影响(cD-PA=5.0×10-5 mol/L)

    共存物 浓度/(×10-5 mol·L-1) 相对误差/% 共存物 浓度/(×10-5 mol·L-1) 相对误差/%
    KAl(SO4)2 500.0 -3.2 NH4Cl 750.0 -2.6
    Fe2(SO4)3 380.0 3.9 NaF 600.0 3.2
    CoSO4 460.0 -4.4 淀粉 710 3.7
    CuSO4 50.0 -4.0 果糖 500.0 4.5
    ZnSO4 530.0 4.8 葡糖糖 450.0 5.0
    NiSO4 500.0 3.5 精氨酸 30.0 -4.8
    PdCl2 70.0 4.1 甘氨酸 100.0 -3.6
    MnSO4 450.0 -3.5 L-酪氨酸 160.0 -4.5
    NaNO3 100.0 3.6 L-丝氨酸 500.0 -4.9
    MgCl2 660.0 -3.8 L-天门冬氨酸 30.0 -4.8
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    表 2  测定D-PA的不同方法的比较

    方法 试剂与材料 检出限/(μmol·L-1) 评价
    电化学发光法[3] 碳纳米片 33.0 灵敏度较低
    电化学法[4] 碳糊电极 0.7 合成步骤较复杂
    分光光度法[5] [Ru(CN)6]4- 0.25 检出限较低，但合成步骤较繁琐，需要使用贵金属
    高效液相色谱法[6] C18柱 0.03 灵敏度高，可同时进行多组分检测，但需要使用有机溶剂
    圆二色性法[7] CdS量子点 0.49 步骤复杂，不适宜常规检测
    荧光法[9] 银离子，碳点 5.62 合成步骤较繁琐
    荧光法[10] CdTe量子点 3.3 合成步骤较繁琐
    荧光法[11] 碳点 0.6 合成步骤较繁琐
    荧光法(本研究) L-Trp-Hg2+ 0.13 简单、灵敏、选择性好，适用于日常测定
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    表 3  逻辑门真值表

    输入1
    (Hg2+)    		 输入2
    (D-PA)    		 输出荧光
    0 0 1(高)
    0 1 1(高)
    1 0 0(低)
    1 1 1(高)
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    表 4  药片中D-PA的测定结果

    样品 标称量/(g·片-1) D-PA测得值/(g·片-1) D-PA加入量/(g·片-1) D-PA测得值/(g·片-1) 回收率/% RSD/%
    1 0.025 0.146 96.0 3.2
    2 0.125 0.122 0.053 0.177 103.8 2.8
    3 0.109 0.228 97.2 4.0
    注：n=5.
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图( 7) 表( 4)
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-04-05
  • 刊出日期:  2022-05-20

L-色氨酸-Hg2+-青霉胺体系的荧光光谱及分析应用

    通讯作者: 胡咏梅：主任医师; 
    通讯作者: 胡小莉，教授
    作者简介: 闫晶晶，硕士研究生，主要从事分子光谱研究
  • 1. 西南大学 化学化工学院，重庆 400715
  • 2. 成都市第二人民医院，成都 610017
  • 收稿日期:  2021-04-05
基金项目:  国家自然科学基金项目(21705132)；成都市卫生健康委员会资助项目(2021029)

摘要: 基于L-色氨酸(L-Trp)荧光猝灭与恢复，建立了一种高灵敏度、高选择性检测D-青霉胺(D-PA)的荧光分析方法. 实验发现在pH=4.8的缓冲溶液中，Hg2+与L-Trp中的羧基结合，猝灭L-Trp的荧光. 随着D-PA的加入，由于Hg2+与D-PA的巯基产生更强的螯合作用，导致Hg2+脱离L-Try，后者荧光恢复. 据此设计了IMPLICATION逻辑门，并用于D-PA的检测. 在优化条件下，荧光恢复程度与D-PA浓度在0.44~50.0 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.13 μmol/L. 该方法用于青霉胺药片含量的测定，结果满意.

English Abstract

    全文HTML

  • 开放科学(资源服务)标志码(OSID):

  • 青霉胺(3，3-二甲基半胱氨酸，PA)是青霉素的代谢产物，也是一种含巯基氨基酸[1]. 同时青霉胺也是一种具有药理作用的手性化合物，用于治疗多种疾病，如威尔逊氏病、类风湿性关节炎、硬皮病及重金属中毒等[2]. 青霉胺作为手性化合物，存在D-青霉胺(D-PA)和L-青霉胺两种对映异构体，它们的药效及毒理作用差别很大，其中L-PA有一定毒副作用，只有D-PA有治疗疾病的作用. 世界卫生组织已经将D-PA列为基础医疗中的必备药品. 因此，建立简单、快速、高灵敏、高选择检测D-PA的方法具有重要意义. 目前报道的检测D-PA的主要方法有电化学发光[3]、电化学法[4]、分光光度法[5]、HPLC法[6]、圆二色性法[7]和离子色谱法[8]. 此外，荧光光谱法相比于其他方法更简单、高效，且灵敏度更高. 近年来，已有较多测定D-PA的荧光法报道[9-11]，但是有的荧光探针合成步骤复杂繁琐，限制了方法的使用. 本研究利用一种简单易得的荧光探针来检测D-PA. 研究发现，L-色氨酸(L-Trp)在352 nm处有很强的荧光发射峰，随着Hg2+的加入，L-Trp荧光被猝灭. 接着加入D-PA，L-Trp的荧光得到恢复，据此建立了一种“开-关”模型来检测D-PA，其反应机理见图 1.

1.   实验部分

    1.1.   实验仪器与材料

  • Hitachi F-2500型荧光分光光度计(日立科学仪器有限公司，日本)；UV-2450型紫外-可见分光光度计(岛津公司，日本)；pHSJ-4F酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司，上海).

    L-Trp、D-PA(阿拉丁试剂有限公司，上海)；HgCl2(四川科伦医药贸易有限公司，成都)；Britton-Robinson缓冲溶液：2.71 mL 85% 磷酸(重庆北碚化学试剂厂，重庆)，2.36 mL冰醋酸(重庆川东化工有限公司，重庆)和2.47 g硼酸(重庆北碚化学试剂厂，重庆)溶于1.0 L蒸馏水中，用0.2 mol/L NaOH调节不同pH值. 实验过程中所用水均为超纯水.

    • 1.2.   实验方法

  • 在10.0 mL的比色管中依次加入pH=4.8的BR缓冲溶液1.0 mL，0.5 mL 4.0 × 10-4 mol/L L-色氨酸，0.5 mL 1.0 × 10-2 mol/L Hg2+和一系列不同浓度的D-PA，用蒸馏水定容至刻度后摇匀，在室温下静置15 min. 在荧光分光光度计上以λex=275 nm激发，进行波长扫描，记录体系的荧光光谱，并在波长352 nm处测定样品和试剂空白的荧光强度，ΔF=F-F0. 狭缝宽度为10 nm.

2.   结果与讨论

    2.1.   荧光光谱

  • 以最大激发波长275 nm对L-Trp溶液进行荧光光谱扫描，发现其最大荧光峰位于352 nm处(图 2中曲线1)，而Hg2+和D-PA均无荧光. L-Trp与D-PA溶液混合，L-Trp的荧光强度几乎没有变化(图 2中曲线2). 然而，在一定浓度的L-Trp中加入适量Hg2+后，由于Hg2+与L-Trp结构中的羧基结合，使得L-Trp在352 nm的荧光猝灭[12](图 2中曲线4)，接着向溶液中加入与Hg2+结合能力更强的D-PA，L-Trp被释放出来，溶液荧光逐渐得到恢复(图 2中曲线3).

    • 2.2.   反应条件优化

    2.2.1.   pH值的影响

  • 实验探究了不同pH值的BR缓冲溶液对反应体系的影响. 由图 3可知，L-Trp-Hg2+和L-Trp-Hg2+-D-PA两个反应体系的荧光强度在pH=2.0~3.1范围逐渐增强，pH=3.1~7.2之间荧光逐渐减弱，但荧光恢复值(ΔF)在pH=4.0~5.0时最大(图 3插图). 因此本实验选用pH=4.8的BR溶液为反应介质.

    • 2.2.2.   Hg2+浓度的影响

  • L-Trp作为一种常见天然氨基酸，已有文献报道Hg2+可以与羧基螯合从而猝灭L-Trp的荧光[13]. 如图 4所示，在Hg2+浓度为4.0×10-4 mol/L时，L-Trp荧光猝灭程度最大，且随着Hg2+继续加入，荧光强度保持不变. 故本实验选择5.0×10-4 mol/L为Hg2+后续实验浓度.

    • 2.2.3.   离子强度和反应时间的影响

  • 研究了离子强度对三元反应体系的影响(图 5)，当NaCl浓度低于4.0×10-4 mol/L时，反应体系荧光强度较稳定；当NaCl浓度高于4.0×10-4 mol/L时，荧光强度有所增加，因此，在实际样品检测过程中要注意控制离子强度，避免高浓度盐类的引入. 此外，实验发现L-Trp的荧光在15 min恢复到最大值并且在1 h内保持稳定，因此选择15 min为反应时间.

    • 2.3.   方法的选择性

  • 为了考察该方法的选择性，在优化的实验条件下，探究了20种常见物质对测定D-PA的影响. 当共存物质引起的荧光强度改变在相对误差±5%之内，通常认为不会对检测造成影响. 由表 1可知，常见的金属离子、氨基酸、糖类对D-PA的检测几乎没有影响，表明本法具有较好的选择性，可以应用于实际样品的检测.

    • 2.4.   标准曲线

  • 按照前述实验方法，测定不同D-PA浓度下反应体系的荧光强度. 如图 6所示，随着D-PA的加入，L-Trp的荧光逐渐恢复，荧光恢复程度(ΔF)与D-PA浓度在0.44~50.0 μmol/L范围内呈现良好的线性关系(图 6插图)，线性回归方程为ΔF=226.6 C+51.8，相关系数为0.999 3，检出限(3σ/K)达0.13 μmol/L. 表 2列出了本法与其他方法测定D-PA的比较，由此可以看出，本法灵敏度高，操作简单，更具有实用价值.

    • 2.5.   逻辑门的模拟应用

  • 分子传感器与目标分析物协同作用，对反应条件进行信息处理，将一个或多个反应条件作为输入信号，荧光信号的改变作为输出信号[14]. 基于荧光响应可以通过Hg2+和D-PA的加入来回切换，体系荧光强度进入“on-off-on”模式，为此构建了IMPLICATION逻辑门[15]. 以L-Trp作为一种逻辑门装置，设定Hg2+(输入1)和D-PA(输入2)为输入信号，352 nm处荧光强度为输出信号，0和1分别代表荧光猝灭和未猝灭. 无信号输入(0，0)或只有D-PA输入(0，1)，352 nm处荧光吸收很强，输出为1；单独Hg2+输入(0，1)时，荧光猝灭，输出为0. 当两者同时输入(1，1)时，L-Trp荧光恢复，输出为1. 表 3为逻辑门对应的真值表，图 7为荧光输出IMPLICATION逻辑图.

    • 2.6.   实际样品的测定

  • 为了评价本方法的适用性和有效性，将本方法用于青霉胺药片中D-PA含量检测. 随机选10片药片(上海信谊药厂有限公司)，研细. 称取相当于0.25片质量的样品，溶解、过滤、除去不溶物，最后定容至500.0 mL容量瓶中，备用. 吸取0.5 mL待测液于10.0 mL比色管中进行检测, 结果见表 4. 通过标准加入法测得回收率和相对标准偏差分别为96.0%~103.8% 和2.8%~4.0%，表明本方法具有较高的准确度和较好的重复性，可以用于实际样品的测定.

3.   结论

  • 利用Hg2+与D-PA之间的强螯合作用，使得Hg2+脱离L-Trp，L-Trp荧光得到恢复，从而设计了分子逻辑门，并建立了D-PA的荧光检测新方法. 本方法相较于其他方法，简单易行、选择性好、灵敏度高，无需精密的仪器和复杂的合成步骤，适用于青霉胺药片含量的测定.

参考文献 (15)

目录

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