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中国是茶叶的原产国，茶产业发展历史悠久，是世界唯一六大茶类生产体系完备的国家，也是世界上最大的茶叶生产国和消费国. 2020年，全世界茶叶种植面积820.9万hm2，茶叶产量626.9万t. 其中，中国种植面积509.8万hm2，年产量424.4万t，分别占62.1%和67.7%. 然而，茶叶在种植、加工和存储过程中可能会积累农药残留，如果农药残留超过限量，会给人体带来健康风险. 多菌灵(Carbendazim)是茶树常用的广谱杀菌剂[1]，对多种由真菌(如半知菌、多子囊菌等)引起的病害有较好的防治效果，具有广谱、高效、化学性质稳定、半衰期长等特点. 但其残留一般很难自然消解，长期摄入会导致人体急性、慢性中毒，甚至有致畸、致癌和致突变的风险. 随着经济的快速发展，人们对茶叶的质量安全提出了更高的要求，对茶叶农残检测技术的研究更为关注.
近年来，国内外研究人员对茶叶农残检测方法进行了多方面的探索. 有学者利用基质固相分散法对茶叶中的多种农药残留进行了检测[2-3]. 另有学者通过将表面增强拉曼散射(SERS)与超材料相结合，对茶叶中吡虫啉、氯吡磷、多菌灵等农药残留进行了定量检测[4-7]. 王书涛等[8]采用FS920稳态荧光光谱仪采集绿茶和铁观音两种不同茶叶的荧光光谱，结合遗传算法GA进行定量分析，提高了农药残留检测的灵敏度.
上述茶叶农残检测方法多基于化学试剂结合萃取法或光谱技术结合化学计量学方法进行定量分析，试验预处理时间长，成本高，且仅能估算农残浓度值而无法观察农残在叶片上的分布，因而限制了其在农残检测领域的应用. 针对上述问题，本文采用太赫兹(THz)光谱成像技术对茶叶农残进行定位和检测. THz光谱对固态分子的排列、振动和转动非常敏感[9]，可以通过振幅和相位信息对材料的成分及其结构的细微变化进行有效分析[10]，是一种重要的分析检测技术[11]. Lee等[12]利用THz成像评估了麦穗霜冻的严重程度与发芽活力，为霜冻灾害后是否立即进行麦穗收割提出了准确建议，避免了经济损失. Zhang等[13]利用太赫兹成像和高光谱成像对水稻抗枯萎病种子进行鉴定，实现了快速分类. 目前，THz成像技术已被广泛用于农业[14]、食品[15]、生物医学[16-17]和材料学[18]等领域的无损检测中，具有广阔的应用前景.
本研究基于团队前期搭建的THz图像超分辨率重建及评价完整机制[19]，对制备的茶叶多菌灵农残样本进行成像、重建、分析和评价，采用图像分割算法对茶叶超分辨率重建图像中的多菌灵区域进行定位，提取多菌灵分布区域，进一步加强THz图像可视化能力，并根据图像强度变化分析多菌灵残留的质量浓度.
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试验采用Advanced Photonix公司生产的T-Ray 5000太赫兹时域光谱系统进行检测. 该光谱系统利用近红外飞秒激光脉冲和LT-InGaAs光导天线产生相干探测THz超短脉冲. 如图 1所示，在透射模式下将待测茶叶样本固定在X-Y二维(2-D)移动工作台. 样本固定夹片由在THz频段具有低吸收性的聚乙烯制成，以保证茶叶样本平整、无卷曲变形. 光栅扫描步长为0.2 mm，扫描速度为50 mm/s，测试环境温度(22 ± 0.1) ℃，湿度为50%±2%，以空白聚乙烯固定夹片THz透射信号为参考信号进行参数计算.
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聚乙烯(Polyethylene，PE)购于Signa-aldrich公司，样本呈固态粉末状，纯度大于98%，使用时未进一步提纯处理. 多菌灵购于网络平台，由天津施普乐农药技术发展有限公司生产，性状为可湿性粉剂，有效成分为80%，使用时未进一步提纯处理. 试验所用茶叶均采摘于西南大学茶园.
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制样过程中，分别将PE和多菌灵样本固体粉末置于红外烤灯下干燥3 h，取出冷却至室温，然后放入研钵中研磨，过100目筛后备用，反复3次，以减少颗粒引起的散射效应. 将研磨后的多菌灵粉末与PE粉末按65∶35的质量比混合均匀后，取适量粉末置于压片机中，加压30 MPa持续压制3 min，压制成直径约为13 mm，厚度1.0 mm，表面光滑无裂痕、上下面平行的圆形压片. 将压片置于T-Ray 5000太赫兹时域光谱系统中，改变固定样片的二维平移台与THz波汇聚点的相对位置，每隔0.2 mm采集一个样本点的光谱数据，共采集到363条有效光谱数据，得到的吸收谱如图 2所示.
将多菌灵可湿性粉剂溶于纯净水中，混合充分，得到800，1 200，1 700，2 000，2 300，3 000，3 700，4 500，5 000 mg/L共9个质量浓度的多菌灵溶液. 选用表面光滑无污染、无凹陷或缺损，左半叶和右半叶面积差异小，易展平的叶片. 试验制作了2个批次的样本，为了减少干扰并保护叶片表面生态，制作前均使用生理盐水进行清洗，制备完成后自然干燥. 太赫兹光谱对样品水分非常敏感，为了确定最佳样本检测状态，本文在第一批次中制备4个样本，分别是裁剪为茶叶状的A4纸张、新鲜叶片、压制干燥叶片(压制4 d后部分水分自然流失的茶叶)、烘干叶片(经烘箱35 ℃干燥3至4 d后的茶叶). 在4份样本表面左右两侧分别喷涂2 000 mg/L和1 200 mg/L的多菌灵溶液各300 μL. 为了探讨茶叶基质上多菌灵质量浓度变化造成的成像差异，实现复杂基质表面多菌灵区域定位，制作第二批次7个样本，在7片干燥茶叶样本表面，分别喷涂质量浓度为800，1 700，2 300，3 000，3 700，4 500，5 000 mg/L的多菌灵溶液各300 μL.
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多菌灵压片样本在0.2~1.5 THz波段的吸收谱如图 2所示. 由图 2可知，多菌灵THz光谱在此波段有两个明显的波峰，处于1.15 THz到1.32 THz之间，与文献所述一致[20]. 该试验结果表明多菌灵在0.2~1.5 THz波段存在指纹谱，验证了基于THz光谱技术实现多菌灵农残定位、定量检测的技术可行性.
采用时域数据，利用时域切片法对茶叶基质表面多菌灵农残进行成像分析. 对时域信息取8个点进行切片成像，成像效果如图 3所示. 从11.88 ps至15.68 ps，随着时间延迟的增加，茶叶内部信息发生了明显变化. 当时间延迟为11.88 ps时，图像中叶片轮廓信息缺失，仅能观察到部分边缘，主脉信息部分呈现，未见叶肉和叶脉信息. 时间延迟为12.18 ps时，叶肉、叶脉及叶片边缘有明显的表现，但对茶叶基质及茶叶基质表面多菌灵农残透射强度分布的表现不准确. 相较于时间延迟为12.68 ps的信息成像，时间延迟为13.98 ps时的图像边缘更加清晰，具有更高的对比度，叶脉与叶肉的细节更加饱满，噪声更低，对叶片基质表面多菌灵农残的透射强度分布有更好的表现. 时间延迟为14.38，14.78，15.08和15.68 ps时，图像信息逐渐模糊，细节信息缺失，严重影响了对叶片组织的观测和分析. 因此，对比后选择时间延迟为13.98 ps的时域信息成像，在此基础上进行后续定位、定量分析.
1.1. 仪器与设备
1.2. 材料与试剂
1.3. 样本制备
1.4. 数据预处理
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为了明确太赫兹光谱对多菌灵农残成像检测的可行性，以裁剪为茶叶状的A4纸作为纯净背景，对比A4纸喷涂多菌灵前、后太赫兹成像效果，结果如图 4所示. 由图 4可知，未喷涂多菌灵的纸张有较高的透射强度，成像图中仅对纸张边缘有表现. 而喷涂有多菌灵的纸张，成像图中呈现了不同的透射强度分布，喷涂有多菌灵的区域THz辐射部分被农残吸收，透射强度较低，表现为蓝色，与未喷涂纸张有较大差异，证明了多菌灵样本的有效性及利用THz成像技术对多菌灵农残进行可视化分析的可行性.
相较于表面增强拉曼散射(SERS)和荧光光谱，THz对样本水分有极高的敏感性，成像质量受此影响较大[21]，因此本研究制备了不同干燥状态的样品进行成像对比，以确定最佳样本制备方法. 分别制备新鲜叶片、压制干燥叶片(压制4 d后部分水分自然流失的茶叶)、烘干叶片(经烘箱35 ℃干燥3至4 d后的茶叶)共3种样本. 图 5为不同方法制备茶叶样本的THz成像图. 由图 5a-图 5c可知，随着叶片水分减少，叶片边缘和叶肉部分对THz波的吸收减少，透射强度逐渐增加，图像由深蓝色逐渐转为较浅的绿色和黄色. 其中，图 5a和图 5d透射强度低，叶脉和叶肉信息对比度小，细节信息模糊，掩盖了农残信息，难以用于农残的可视化分析. 图 5b和图 5e显示了室温下压制4 d，水分自然流失后的茶叶图像，相较于新鲜叶片成像，压制4 d后的叶片透射强度明显增加，虽然受含水量的影响难以辨别农残信息，但叶片主脉信息较为明显. 图 5c和图 5f是烘干叶片图像，对THz辐射表现出良好的透过性，叶片主脉和边缘较为清晰，可以观察到侧脉信息. 叶片表面左侧透射强度低于右侧，图像上表现为颜色的深浅差异，这也与叶片左侧和右侧喷涂多菌灵的质量浓度差异相符. 因此，基于成像效果，选择烘干叶片进行后续研究.
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采用时域切片法选择13.98 ps时域信息点对7个不同质量浓度的烘干茶叶农残样本进行成像，成像效果如图 6所示. 烘干叶片的THz成像图中，主脉和侧脉细节丰富，边缘清晰，有较好的成像效果. 叶片边缘呈现的环状痕迹是由聚乙烯膜上下层固定夹取叶片时，叶片边缘厚度与周围材料厚度差异导致的，对茶叶表面观察分析没有影响.
图 6为喷涂不同质量浓度多菌灵的茶叶样本THz成像图，可以看出，随着多菌灵质量浓度的逐渐增加，叶片表面的多菌灵对THz辐射的吸收越强，农残区域透射强度降低，表现为叶片黄色区域(农残分布区域)色度加深，与附近区域的色差进一步加大，这也体现在了对应的灰度图中. 受THz信号强度的影响，原始图像分辨率较低，难以用于分析，通过图像增强的方式重建叶片THz图像，丰富细节信息，有助于进一步提取多菌灵农残分布区域，观察分析其质量浓度变化.
将喷涂不同质量浓度多菌灵的茶叶样本的7张THz图像纳入搭建的超分辨率成像机制中，得到超分辨率重建后的图像. 图 7a为原始图像，像素为90 px×70 px；图 7b为图 7a红色方框区域经超分辨率重建后的局部放大对比图. 图 7a中亮黄色区域为多菌灵残留区域，颜色越黄则表明多菌灵质量浓度越高. 但受到THz信号的限制，图像较为模糊，细节信息较少，边缘仍不够清晰. 图 7c为超分辨率重建图像，对比图 7b可以看出，超分辨率重建后的图像细节信息更加丰富，颜色对比度明显提升，原始图像对多菌灵分布区域“粗糙”的大范围呈现得到有效抑制，农残分布区域边缘更加清晰，体现出更多的细节信息.
对于THz图像呈现样本内部信息，难以获得参考图像的问题，采用自然图像质量评价(NIQE)[22]、基于空间和光谱熵的无参考图像评估(SSEQ)[23]和无参考空间域质量评估(BRISQUE)[24]3种评价方法对茶叶多菌灵农残的原始THz图像和重建后的图像效果进行客观的评估，多种评价方式的综合使用可以有效避免单一评价方式可能导致的误差，为后续图像分割法提取多菌灵分布区域的有效性提供依据. 3种筛选方法对图像的评估结果如表 1所示. 对于喷涂不同质量浓度的多菌灵茶叶样本成像，NIQE和SSEQ对重建后的图像评估分数均低于原始图像，而BRISQUE对重建图像的评分则均高于原始图像，相较NIQE和SSEQ呈现出不同的趋势. 这是由于BRISQUE对自然图像有较大的偏向性，而重建后的图像进一步凸显了多菌灵分布区域的边缘信息，增强了亮度对比，有利于图像的分割提取研究，但加大了对自然图像的偏离程度. 评分结果表明，重建后的图像质量更优，虽然加大了失真程度，但更有效呈现了叶片基质上多菌灵的图像细节信息和多菌灵分布区域的边缘信息，有助于对茶叶基质上多菌灵农残的观察和分析.
利用Matlab 2021b自带图像工具箱对茶叶多菌灵农残图像进行分割处理，提取多菌灵农残分布区域，结果如图 8所示. 提取区域覆盖在原始图像上，用亮黄色表示，二值图用黑白表示，白色为提取区域. 由图 8可以看出，基于原始图像进行多菌灵农残分布区域提取，提取区域与茶叶基质上多菌灵农残分布区域不符且外延至茶叶以外区域，难以体现正确的农残区域信息. 相较于原始图像，对超分辨率重建图像进行图像分割提取，提取区域与实际分布区域基本相符，可以清晰地观察到多菌灵农残分布.
茶叶叶片有天然的凹凸脉络，叶片表面不平整，农药残留易积聚，可能造成局部点位透射强度的不正确反馈. 因此，为了对茶叶多菌灵农残质量浓度进行准确分析和预测，计算800，1 700，3 000，3 700，5 000 mg/L 5个样本的多菌灵农残区域透射强度均值，如图 9所示. 由图可见透射强度与多菌灵质量浓度呈负相关，随多菌灵农残浓度降低，透射强度增加. 计算得到多菌灵质量浓度拟合方程
式中：p1=-1.721×105，p2=4.502×104，x为平均透射强度，c为多菌灵质量浓度(mg/L).
将2 300 mg/L和4 500 mg/L对应的透射强度均值0.247 9和0.235 2代入计算得到多菌灵质量浓度预测值为2 364 mg/L和4 542 mg/L，误差分别为2.78%和1.16%.
相较于传统化学和光谱检测法对微量农残的定量检测，本文基于THz成像结合THz超分辨率重建机制对多菌灵农残的分布进行了可视化定位，并进行了定量分析. 需要特别说明的是，虽然本研究所用多菌灵质量浓度与实际农药使用的质量浓度尚有一定差距，但基于本文提出的茶叶THz图像超分辨率重建机制，可以有效观察农作物农残分布，并进行较为精确的质量浓度预测，为农作物样本基质表面农残检测、定位做出了有益的探索.
2.1. 不同干燥状态的茶叶样本可视化分析
2.2. 不同多菌灵浓度的叶片样本可视化分析
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农作物农药残留严重影响着人体健康，现有研究已经证明了光谱检测技术在农作物农残检测方面的潜力，但这些研究多关注于农残的定量研究，对于农残在作物表面分布的定位研究尚属空白. 本文利用THz成像技术对茶叶基质表面多菌灵残留进行定位、定量研究. 研究基于THz扫描成像系统获得了多菌灵“指纹谱”，确定了茶叶农残样本制备方法及最佳成像参数；基于课题组搭建的生物样本THz单图像重建机制对茶叶多菌灵农残样本进行重建图像可视化分析. 重建图像较原始图像细节信息丰富，多菌灵分布区域清晰，不同质量浓度多菌灵样本的重建图像显示出明显差异，且透射强度与多菌灵质量浓度呈明显负相关关系，多菌灵样本预测结果与试验结果误差分别为2.78%和1.16%，实现了多菌灵区域分布和质量浓度变化的可视化分析. 目前基于THz成像的清晰度和可透视的深度还有较大的提升空间，在后续研究中，可以考虑结合超材料和自适应模糊核算法提升成像清晰度，丰富样本信息.