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我国目前农药使用量位居世界前列[1]，农药在防止农作物受损、增加粮食蔬菜产量等方面发挥着不可替代的作用。在众多杀虫剂类农药中，氨基甲酸酯类杀虫剂因选择性强、高效低毒等特性得到广泛研究和应用[2-3]。然而，过量使用氨基甲酸酯类农药，其残留物会通过抑制人类乙酰胆碱酯酶的活性，导致神经系统疾病甚至引起死亡。因此，氨基甲酸酯类农药的残留问题存在巨大的环境和健康风险，研究氨基甲酸酯类农药的分析方法和技术具有重要的价值[4-5]。
常用的氨基甲酸酯类农药残留分析方法主要包括光谱法、色谱法、电化学法、质谱法以及色质联用等[3, 6-13]，目前已经能够实现对氨基甲酸酯类农药残留的高灵敏和准确分析。然而，现有方法大多依赖复杂且价格昂贵的大型仪器设备，或者需要专业的操作人员来完成相应的数据处理和检测工作，这导致了检测效率低下且不利于农药残留的即时分析[9, 13]。相对而言，开发简单的、不依赖大型仪器的分析方法，尤其是能对农药残留进行直接的原位可视化分析的方法具有突出的优势和广阔的应用前景[14]，但目前相关的探索仍相对缺乏。
西维因作为一种代表性氨基甲酸酯类杀虫剂在农业领域应用广泛，目前已经开发了一系列的检测方法[8-10, 12-13]。由于其结构中含有萘环，分子自身的短波蓝光发射是对其进行荧光光谱分析的基础，但是此发射在农作物样本上直接进行可视化分析的难度非常大。部分现有的西维因检测方法是借助其碱性降解产物1-萘酚的较强蓝色荧光进行定量分析[10, 12]，然而在对西维因进行直接可视化分析时，此降解产物与其他氨基甲酸酯类农药一样，同样可能成为干扰物。因此，开发西维因可视化分析方法的难点在于新方法需要具有良好的选择性和特征性信号以消除结构类似物的干扰，从而保证分析的准确度。
分子间电荷转移(ICT)是通过电荷转移供受体之间非共价的空间相互作用形成电荷转移复合物的现象，同时该复合物表现出比供体和受体均显著红移的光学吸收和发射性质[15-17]。基于此，科研人员将ICT成功应用于近红外发射和成像材料构建等领域[18-19]。显然，ICT所带来的吸收和发射光谱的红移，能够作为有效的识别信号而用于分析检测领域，比如该策略已经用于芬太尼和胺类等小分子的灵敏检测[20-22]。此外，借助供受体之间作用强度的差异，ICT实现了对手性药物单体和消旋体之间的有效区分，并进一步用于手性药物的可视化结晶纯化[17, 23]。综上，ICT在可视化分析方面展现出了操作简单、信号显著等优势，本研究通过筛选合适的电荷转移受体，并借助ICT策略开展西维因可视化分析、作用机制研究以及RGB数值化分析。
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仪器：荧光光谱仪(Hitachi，F7100)；傅里叶变换红外光谱仪(Shimadzu，IRTracer-100)；热风枪(Bosch，GHG16-50)；紫外灯(10 W)。可视化荧光照片的拍摄采用iPhone 15 Pro Max手机完成。RGB数据采集通过直接使用微信小程序(取色器Pro)完成，也可通过类似的RGB颜色分析手机应用程序完成。叶片上西维因荧光成像的RGB线扫描分析通过Image-Pro Plus 6.0软件完成。
试剂：西维因、霜霉威、异丙威、抗蚜威、1-萘酚、1，3-二氰基苯(1，3-DCB)、1，3，5-三氰基苯(TCB)、1，2，4，5-四氰基苯(TCNB)、7，7，8，8-四氰基对苯二醌二甲烷(TCNQ)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；萘购自成都市科龙化工试剂厂；二氯甲烷、丙酮和氯化钠购自重庆市川东化工集团化学试剂厂。其中，霜霉威、异丙威、抗蚜威为分析标准品，其余试剂均为分析纯规格，所有试剂未经处理直接用于实验。
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根据西维因的结构特征初步确定其富电子的萘环适于作为ICT供体，从而在多氰基苯类受体分子中筛选能够与西维因构建ICT对的有效受体分子。将1，3-DCB、TCB、TCNB、TCNQ与西维因按照1∶1比例采用二氯甲烷-乙腈混合溶剂溶解，挥干溶剂得到复合物。对单独的西维因、4种受体分子以及西维因与4种受体分别形成的复合物进行荧光成像拍照，并进行对应的荧光光谱测定。
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为了探索TCNB对西维因进行可视化分析的应用价值，考察了可以带来显著荧光信号变化的西维因-TCNB比例范围。设置了100∶1、50∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100的西维因-TCNB比例系列，按照1.2节中所述的混合溶剂挥干法制得系列ICT复合物，对其进行荧光成像拍照和荧光光谱测定。
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为了确证西维因与TCNB发生了ICT作用，采用干燥的溴化钾作为稀释剂进行压片，对西维因、TCNB以及西维因-TCNB复合物进行了红外光谱测定。
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为了考察TCNB与西维因形成的ICT复合物的荧光信号的专属性，选用霜霉威、异丙威、抗蚜威作为氨基甲酸酯类杀虫剂潜在干扰物进行考察，通过溶液挥发法进行ICT复合物制备。同时，将西维因的碱降解产物1-萘酚以及母核结构萘作为潜在干扰物进行考察，对于此类含有萘环的供体分子通过简单的研磨法进行ICT复合物制备即可。对TCNB与上述各种潜在干扰物形成的ICT复合物进行荧光成像拍照和荧光光谱测定。
西维因-TCNB复合物的荧光信号与西维因的量之间的关系主要借助手机应用程序进行RGB值统计分析来确定。首先，将0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL的西维因丙酮溶液分别与1 mg/mL的TCNB丙酮溶液进行1∶1等体积混合，进而用一定量的氯化钠作为稀释剂，待其挥干后对3组平行样进行荧光成像拍照。然后采用微信小程序(取色器Pro)进行RGB值统计分析，其中RGB值分别对应红绿蓝3种颜色强度值[24-25]。
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为了确证ICT策略是否能够用于农作物叶片上西维因残留的可视化分析，选用柑橘树叶、蓝莓叶、苹果树叶作为研究对象。在上述3种叶片上分别施加1.6和0.4 mg/mL高低2种浓度的西维因，待其干燥后通过1 mg/mL的TCNB对其进行显色，以不加西维因空白叶片以及仅施加西维因而不加TCNB显影的叶片作为对照组。为考察洗涤对叶片上西维因去除效果的可视化分析，对每种浓度的西维因分别进行2次水洗处理，每次用喷瓶喷水大约5 s。对上述各组叶片的不同状态全部进行荧光成像拍照。
对施加0.4 mg/mL西维因的苹果树叶组3种状态(未处理、洗涤1次和洗涤2次)下的荧光成像照片进行西维因残留量的数值化分析。对3种状态对应的相同部位进行大约20像素的RGB线扫描数值统计[26-27]。以叶片中间的主脉为参考，考察西维因含量的下降趋势。
1.1. 实验仪器与试剂
1.2. ICT受体的筛选
1.3. 西维因-TCNB供受体比例探索
1.4. 西维因-TCNB相互作用解析
1.5. TCNB对西维因的选择性及分析性能考察
1.6. 农作物上西维因的可视化及RGB数值化分析
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西维因结构中的萘环可以作为富电中心，因此以多氰基苯类常用的ICT受体作为潜在的电荷转移受体进行筛选(图 1a)。借助热熔融法、溶液析出法、研磨法等物理过程方法以达到让主客体形成有效空间接触的效果即可触发ICT作用，因此本研究主要借助了溶液析出法和研磨法来实现ICT相互作用，且无须其他反应和特殊处理。如图 1b的荧光成像照片显示，西维因与TCNB作用能够产生显著区分于其他多氰基苯受体组的明亮的绿色荧光发射。其他多氰基苯与西维因作用未产生明显的荧光发射变化，仍呈现出与西维因类似的蓝色荧光发射。同时，明场成像照片显示西维因与TCNB作用产生了明显的吸收红移，不同于西维因与TCNQ组的棕色是来源于TCNQ颜色的稀释，这从侧面证实了TCNB与西维因两者发生了明显的相互作用。进一步的荧光光谱表征结果显示，TCNB与西维因的复合物在大约520 nm附近有最大发射峰，与荧光成像的绿色发射相吻合(图 1c)。其他多氰基苯受体与西维因的复合物发射均在420 nm附近，未产生明显的发射光谱红移，这与前期研究基础证实的多氰基苯中氰基的数量对于ICT的关键作用相符合[17, 23]。由此可见，TCNB与西维因形成的ICT复合物展现出了显著红移且明亮的绿色荧光发射，具备可视化分析的光学信号基础。
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考虑到在实际应用过程中，西维因的浓度可能出现在一个较宽的范围内，因此对西维因与TCNB能发生有效ICT的比例进行了考察。结果显示，西维因-TCNB比例为100∶1和50∶1的2组中因为TCNB不足所导致的ICT作用不充分，从而以西维因的蓝色荧光发射为主(图 2a、2b)。TCNB占比过高的1组(西维因-TCNB比例为1∶100)荧光发射较弱，不具有分析应用价值。产生该现象的原因是对于复合物发光有重要贡献的西维因含量过低，从而荧光发射强度较低。另外，TCNB占比较高的2组(西维因-TCNB比例为1∶10和1∶50)荧光发射进一步红移至黄色(图 2a、2c)，虽然与绿色荧光发射有一定差异，但同样与西维因的蓝色发射能够形成显著的区分，因此也可以用于西维因的可视化分析应用。不难发现，西维因-TCNB的比例范围从10∶1至1∶50均可以产生有效ICT作用且带来显著荧光信号，因此ICT策略用于西维因的可视化分析具有良好的潜质。
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为了确证西维因与TCNB复合物的吸收和荧光发射光谱的红移是源自两者的ICT作用，对两者单组以及复合物分别进行了红外光谱表征(图 3)。结果显示，相较于TCNB中氰基在2 243 cm-1处的特征峰，当与西维因作用后红移至2 245 cm-1处。该移动的原因为TCNB与西维因发生了电荷转移作用后使电子云密度增加，从而证实了西维因与TCNB发生了ICT作用。另外，相较于西维因自身的红外光谱，西维因与TCNB作用后在1 720 cm-1处的羰基特征峰变窄且振动增强。同时，在3 315 cm-1处的仲酰胺特征峰振动强度发生了明显的降低，这些特征信号的变化同样也体现出ICT作用的发生。
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为了进一步探索ICT策略用于西维因可视化分析的可行性，选取了代表性干扰物进行ICT作用荧光信号特异性的考察(图 4a)。首先，选取了3种具有代表性的氨基甲酸酯类杀虫剂作为潜在干扰物，包括不含有明显共轭结构的异丙威、含有苯环结构的霜霉威，以及含有氮杂环的抗蚜威。其次，选择西维因的碱性降解产物1-萘酚作为潜在干扰物，进一步确证该荧光信号的特异性。此外，为了进一步确证西维因结构中的萘环在ICT复合物发光中的重要性，选择萘作为受体进行测定。结果显示，3种典型氨基甲酸酯类杀虫剂与TCNB混合后，表现出与西维因-TCNB复合物显著差异的荧光信号。其中，仅有抗蚜威表现出一定强度的橙色荧光信号，这归因于氮杂环较强的富电性。1-萘酚则呈现出低强度的橙色荧光信号，而萘与TCNB作用后则产生了较强的青色荧光(图 4b、4c)。由于1-萘酚、萘与西维因三者结构各不相同，因此虽然与TCNB都发生了一定程度的ICT作用，但是ICT复合物的准分子能级各不相同从而发射波长各异。其中，1-萘酚为西维因酯键水解脱去了氨基甲酸，形成具有一定供电子能力的酚羟基，因此表现出更长波长的ICT荧光发射。此实验充分证实了西维因结构中富电子的萘环对于西维因与TCNB产生ICT作用及发光性质调控的重要性。同时，上述结果展现出TCNB对西维因具有专属性的区分能力。
接下来，通过荧光成像照片的RGB值分析对西维因-TCNB复合物的荧光信号与西维因的量之间的关系进行了探索。在西维因和TCNB发生ICT作用的比例考察环节中已经展现出该复合物主要发射绿色或者黄色的荧光，因此主要对R(红色值)和G(绿色值)进行了统计分析。结果显示，G在西维因浓度达到0.8 mg/mL即达到饱和(接近255)，而R则是在3.2 mg/mL才达到饱和(接近255)，因此综合起来(R+G)/2(模拟叠加色：黄色)在1.6 mg/mL达到饱和(图 5)。因此在低浓度至农作物使用剂量的范围内，西维因-TCNB的荧光信号随着西维因量的增加呈现出增长趋势，具有良好的可视化分析应用潜力。
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为了探索ICT策略在西维因农作物残留可视化分析中的应用，结合西维因除了用作杀虫剂也常在花期和幼果阶段用作疏果剂，因此本研究选取了现阶段可直接采集的柑橘树叶、蓝莓叶和苹果树叶3种典型的果树叶片作为研究对象。每种叶片分别进行了1.6和0.4 mg/mL 2种不同浓度的西维因实验，待其干燥后通过1 mg/mL的TCNB进行光学显影。结果显示，相对于空白叶片，施加了西维因的叶片在2种浓度下均无明显的荧光信号，这可以归因于西维因自身较弱的荧光信号。如图 6所示，通过TCNB显影后，1.6和0.4 mg/mL 2种浓度下的西维因均可以发出清晰的黄绿色荧光，其中1.6 mg/mL的西维因展现出明显更高的荧光信号强度。水洗涤对叶片表面西维因残留量影响的实验结果显示，水洗涤过程对2种浓度下的西维因残留量均表现出高效的去除能力。然而，该去除效果在柑橘树叶上的表现明显优于蓝莓叶和苹果树叶，推测这与柑橘树叶的角质层等结构有密切关联。该现象的深入研究和机制解析对于合理使用农药和降低农残的危害具有重要价值。
进一步对苹果树叶上0.4 mg/mL西维因残留的荧光成像照片进行了RGB线扫描数值化直观分析。选定未处理、洗涤1次和洗涤2次3种状态下照片中叶片的相同部位采集了22像素的RGB数值。尽管叶片拍照效果有轻微的差异，但是西维因残留的痕迹仍分布在相近的像素位置。其中，6~9像素范围为西维因残留的左边界，有R和G的最大值，这体现出此处较强的黄绿色荧光信号，并且该处的R和G展现出随浓度递减的趋势。除了此R和G的绝对强度具有递减趋势外，将17~19像素范围的苹果树叶主脉的背景信号值(维持在210附近)作为参考，其R和G与叶脉背景信号的比值同样表现出了逐渐降低的趋势(图 7)。结合上述2种方式，能够较好地确证该分析结果的可靠性。上述结果显示，水洗涤对于西维因残留的去除具有显著的效果。可以预见，对可能喷施了西维因农药的瓜果或者蔬菜进行充分的清洗，有望显著地降低表面的西维因残留量，进而有效地降低其对健康带来的潜在危害。同时，在施加西维因农药时应选择适宜的天气，以更好地保证用药效果。
2.1. 西维因-TCNB的ICT复合物筛选及表征
2.2. 西维因-TCNB的有效比例范围
2.3. ICT作用的红外光谱表征
2.4. TCNB对西维因的分析性能研究
2.5. 农作物叶片西维因残留的可视化分析
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本研究成功构建了氨基甲酸酯类杀虫剂西维因作为供体和TCNB作为受体的有效ICT供受体对，并在此基础上进行了供受体比例和作用机制探索以及可视化分析的系统性研究。研究结果表明：西维因与TCNB通过ICT作用能够产生具有显著区分度的明亮绿色荧光信号，该信号能够与其他典型的氨基甲酸酯类杀虫剂以及西维因的碱性降解产物1-萘酚进行有效的区分。同时，该信号在西维因使用剂量范围内随西维因量的增加而增强。借助该荧光信号，可以实现典型果树叶片上西维因残留的可视化分析，并且能够实现洗涤对农药残留去除效果的直观分析。同时，借助该特征性的荧光信号和通用型微信小程序对RGB数值进行分析，可以实现对农作物表面西维因残留的便捷和原位分析。