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秋水仙素诱导黑喉石斛多倍体研究

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王爱华, 吴青青, 杨澜, 等. 秋水仙素诱导黑喉石斛多倍体研究[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2017, 39(1): 55-60. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.009
引用本文: 王爱华, 吴青青, 杨澜, 等. 秋水仙素诱导黑喉石斛多倍体研究[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2017, 39(1): 55-60. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.009
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Ai-hua WANG, Qing-qing WU, Lan YANG, et al. Study on Polyploid of Dendrobium ochreatum Induced by Colchicine[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(1): 55-60. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.009
Citation: Ai-hua WANG, Qing-qing WU, Lan YANG, et al. Study on Polyploid of Dendrobium ochreatum Induced by Colchicine[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(1): 55-60. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.009
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秋水仙素诱导黑喉石斛多倍体研究

  • 贵州省园艺研究所，贵阳 550006

  • 基金项目: 国家自然科学基金(31160400)；贵州省科技计划项目(黔科合NY字(2012)3032号)；贵州省科学技术厅贵州省农业科学院科学技术联合基金项目(黔科和J字LKN(2013)]20号)
详细信息
    作者简介:

    王爱华(1982-)，女，河北邯郸人，助理研究员，硕士，主要从事细胞生物学研究 .

    通讯作者: 陈之林，副研究员，博士

  • 中图分类号: Q943

Study on Polyploid of Dendrobium ochreatum Induced by Colchicine

  • Horticultural Research Institute of Guizhou Province, Guiyang 550006, China

  • 摘要: 以黑喉石斛原球茎为材料，探讨了秋水仙素不同处理对黑喉石斛多倍体诱导的影响.流式细胞仪测定结果表明，适宜四倍体诱导的秋水仙素质量分数在0.01%~0.03%之间，适宜八倍体诱导的秋水仙素质量分数在0.05%~0.10%之间，处理时间均为2~3 d；获得的多倍体在形态、气孔和染色体数目上有明显变化；八倍体与四倍体相比，发育更加迟缓，多表现为整株分叉.
    Abstract: Effects of the various colchicine treatments on polyploidy induction of Den. ochreatum were carried out in the current work. The results measured by flow cytometry showed that the most efficient condition of Den. Ochreatum for inducing tetraploids seemed to be treated with 0.01%-0.03% colchicine and octoploids with 0.05%-0.1% colchicine all for 2-3 days. The polyploidies were different from normal diploids in morphology, stoma and chromosome numbers. Compared with tetraploid, octoploid developed more slowly, and more showed bifurcation.
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  • 图 1  秋水仙素对植株形态的影响

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    图 2  黑喉石斛二倍体和变异株气孔比较(×40)

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    图 3  黑喉石斛叶片二倍体、四倍体和八倍体流式图

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    图 4  黑喉石斛二倍体、四倍体和八倍体根尖细胞分裂中期染色体(×100)

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    表 1  不同秋水仙素处理对黑喉石斛植株形态的影响

    秋水仙素的
    质量分数/%    		培养
    时间/d    		叶长
    /mm    		叶宽
    /mm    		叶型指数株高
    /cm    		茎粗
    /mm
    0.005119.67±0.58efg2.00±0.00j9.78±0.25ab3.27±0.06bcd3.20±0.17efg
    220.33±1.15cdef2.33±0.12i8.46±0.47c3.20±0.10bcde3.17±0.23efg
    318.00±1.00gh3.23±0.12e5.41±0.10e2.90±0.17def4.17±0.29cd
    0.010122.33±0.58bc2.63±0.06h9.17±1.22bc3.90±0.10a3.00±0.00fg
    220.00±2.00defg2.67±0.21h7.43±0.20d2.87±0.21ef3.17±0.15efg
    315.33±0.58ij3.97±0.06cd3.87±0.11g2.43±0.12g6.00±1.00a
    0.030125.00±1.00a2.70±0.20gh9.20±1.09bc3.50±0.26b2.67±0.12g
    215.33±0.58ij3.13±0.15e4.91±0.08e2.63±0.06fg3.97±0.06d
    313.33±0.58j3.77±0.21d3.57±0.32g1.97±0.06h5.23±0.40b
    0.050122.00±1.00bcd3.05±0.05ef7.17±0.27d3.07±0.38cde3.03±0.06fg
    218.67±2.89fg4.00±0.00bc4.80±0.64ef2.90±0.35def3.77±0.25de
    314.67±1.15ij4.30±0.10a3.27±0.08g2.07±0.15h4.33±0.29cd
    0.100121.00±1.00bcde2.90±0.10fg7.22±0.49d3.30±0.10bc3.33±0.29ef
    216.33±0.58hi4.20±0.10ab4.01±0.35fg2.63±0.32fg4.23±0.25cd
    316.33±1.53hi4.30±0.10a3.83±0.31g2.60±0.10fg4.67±0.29c
    对照23.00±1.00ab2.27±0.21i10.40±0.11a2.97±0.21cdef3.27±0.06efg
     注：同列内相同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异不具有统计学意义.
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    表 2  黑喉石斛二倍体与变异株气孔比较

    植株气孔长度/
    μm    		气孔宽度/
    μm    		长宽比气孔密度/
    (个·mm-2)
    二倍体34.89±2.80b37.03±1.58b0.94±0.08a81.02±4.10a
    变异株43.66±3.34a52.21±2.50a0.84±0.06b47.01±3.64b
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    表 3  各处理流式细胞仪倍性分析结果

    质量分数/
    %    		时间/
    d    		检测株数二倍体及比率/
    株(%)    		四倍体及比率/
    株(%)    		八倍体及比率/
    株(%)    		混倍体及比率/
    株(%)    		变异率
    /%
    0.0051108(80)0(0)0(0)2(20)20
    2106(60)2(20)0(0)2(20)40
    3104(40)3(30)0(0)3(30)60
    0.010190(0)0(0)0(0)9(100)100
    290(0)6(60)0(0)3(30)100
    3100(0)8(80)0(0)2(20)100
    0.0301104(40)2(20)2(20)2(20)60
    2100(0)4(40)2(20)4(40)100
    3100(0)7(70)2(20)1(10)100
    0.0501100(0)6(60)2(20)2(20)100
    2100(0)2(20)5(50)3(30)100
    3100(0)0(0)5(50)5(50)100
    0.1001100(0)0(0)6(60)4(40)100
    2100(0)0(0)7(70)3(30)100
    3100(0)0(0)6(60)4(40)100
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出版历程
  • 收稿日期:  2015-11-20
  • 刊出日期:  2017-01-20

秋水仙素诱导黑喉石斛多倍体研究

    通讯作者: 陈之林，副研究员，博士
    作者简介: 王爱华(1982-)，女，河北邯郸人，助理研究员，硕士，主要从事细胞生物学研究
  • 贵州省园艺研究所，贵阳 550006
  • 收稿日期:  2015-11-20
基金项目:  国家自然科学基金(31160400)；贵州省科技计划项目(黔科合NY字(2012)3032号)；贵州省科学技术厅贵州省农业科学院科学技术联合基金项目(黔科和J字LKN(2013)]20号)

摘要: 以黑喉石斛原球茎为材料，探讨了秋水仙素不同处理对黑喉石斛多倍体诱导的影响.流式细胞仪测定结果表明，适宜四倍体诱导的秋水仙素质量分数在0.01%~0.03%之间，适宜八倍体诱导的秋水仙素质量分数在0.05%~0.10%之间，处理时间均为2~3 d；获得的多倍体在形态、气孔和染色体数目上有明显变化；八倍体与四倍体相比，发育更加迟缓，多表现为整株分叉.

English Abstract

    全文HTML

  • 石斛属(Dendrobium)植物既是我国传统中药材，更是名贵的观赏花卉.近年来，石斛产业发展迅猛，产品一直处于供不应求的状态，且需求有逐年增加趋势.因此，培育优质、高产石斛新种质十分紧迫和必要.多倍体因器官巨大、株型奇特、抗逆性强等特征而被育种家们青睐，已成为目前种质创新研究的热点和重点领域之一.现已获得铁皮石斛[1]、齿瓣石斛[2]、粗舌石斛[3]、金钗石斛[4]、春石斛及秋石斛杂交种[5-6]的多倍体.黑喉石斛(Den.ochreatum)嫩茎开花的特性有别于其他石斛品种，即在新芽长成后便立即开花，不需经过冬季的低温处理，大大缩短了开花时间，使之更具有特殊价值，是石斛育种的珍贵材料.目前对于黑喉石斛的研究国内还未见报道.本研究以黑喉石斛的原球茎为材料，采用秋水仙素进行多倍体诱导，以期为石斛种质资源创新提供新材料.

1.   材料与方法

    1.1.   材料

  • 黑喉石斛蒴果采自贵州省园艺研究所花卉温室大棚，经体细胞染色体鉴定为二倍体，2n=2x=38.将种子无菌萌发7周后形成的原球茎作为实验材料.

    • 1.2.   多倍体植株诱导

  • 将原球茎浸入含不同质量分数的秋水仙素的液体培养基(1/2MS+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L NAA)中(对照不加秋水仙素)，进行不同时间的悬浮培养(表 1)，培养条件为：温度(25±2) ℃，摇床转速100 r/min.原球茎在液体培养后经100目筛子过筛，用无菌水冲洗3遍，用灭菌滤纸吸干水分，再接种于育苗培养基(1/2MS 0.2 g+花宝1号1.5 g+花宝2号1.5 g+Peptone 1.0 g+肌醇0.1 g+1g/L活性炭+30 g/L白糖+4 g/L琼脂+0.5 mg/L NAA)上进行分化培养，每处理接种60株，重复3次，培养瓶置于光照培养室中培养，光培室的温度为(25±2) ℃，光照强度为2 000 lx，每日光照12 h，培养60 d继代1次.

    • 1.3.   多倍体鉴定

    1.3.1.   形态观察

  • 待诱导植株分化并长成大苗，取其中10株，用游标卡尺测量叶长、叶宽、株高和茎粗，取平均值.叶型指数=叶长/叶宽.

    • 1.3.2.   气孔观察

  • 分别用无色透明的指甲油涂抹形态明显变异的植株和对照植株的叶片下表皮，待指甲油干燥后，撕取下表皮制片，然后置于Leica显微镜下观察气孔的长度、宽度和密度.气孔长度和宽度取所观察的30个细胞的平均值，气孔及形态数据均使用DPS和Excel软件进行统计.

    • 1.3.3.   DNA倍性分析
    1.3.3.1.   样品制备

  • 采用Partec CyStain UV Precise T试剂盒，取约0.5 cm2的幼叶于直径55 mm的玻璃培养皿上，加400 μL萃取液，使用尖锐的刀片先纵后横用力切割样品，并浸泡2~5 min，之后将样本及液体用50 μm微孔滤膜过滤到样品管中，再加入1 600 μL DNA染色液，避光染色2~5 min.

    • 1.3.3.2.   数据获取与分析

  • 采用德国Partec公司的CyFlow space流式细胞仪，电压为220 V，UV LED激光波长为365 nm，粒子流速为1.0 μL/s，每个样本至少计数10 000个，重复10次，DNA含量分布曲线由FloMax软件自动生成.以二倍体植株做对照，通过DNA index确定植株倍性，统计不同倍性所占的比率.

    • 1.3.4.   染色体压片分析

  • 切取秋水仙素处理的植株根尖(长约5 mm)，在常温下置于0.7 mmol/L放线菌酮中预处理4 h，洗涤后的根尖先放入Canoy固定液中室温固定15~20 h，然后置于1 mol/L的浓盐酸中，在室温下解离5 min后再在60 ℃恒温下解离8 min，冲洗后用超纯水低渗20 min，最后置于载玻片上，加入1~2滴苯酚品红染色10 min后制片并摄像.

2.   结果与分析

    2.1.   秋水仙素处理对植株形态的影响

  • 不同秋水仙素处理对黑喉石斛植株形态的影响见表 1，与对照相比(图 1(a))，随着秋水仙素质量分数的升高及培养时间的加长，叶型指数变小，叶色深绿，叶片背面翻卷、粗糙(图 1(b))，植株生长缓慢，株高下降，茎粗增加，对照的叶型指数、茎粗及株高分别为(10.40±0.11)，(3.27±0.06) mm和(2.97±0.21) cm.叶型指数最小为3.27±0.08，即0.050%秋水仙素培养3 d的处理；茎粗最大为(6.00±1.00) mm，即0.010%秋水仙素培养3 d的处理；株高最低为(1.97±0.06) cm，即0.030%秋水仙素培养3d的处理.当质量分数超过0.050%、培养时间大于2 d时，出现少量畸形苗，表现为整株出现分叉现象(图 1(c)).

    • 2.2.   气孔观察

  • 根据表 2数据，变异株保卫细胞长度、宽度和气孔密度较二倍体植株的差异均具有统计学意义，保卫细胞长度、宽度明显增大，长和宽分别增长25.14%和41.00%，形态也有所变化，长宽比减少10.64%，气孔密度降低41.98%(图 2).

    • 2.3.   DNA倍性分析

  • 各处理流式细胞仪倍性分析结果见表 3，高质量分数和长时间诱导可得较高变异率.四倍体比率最高为80%，即0.010%秋水仙素培养3 d的处理；八倍体比率最高为70%，即0.100%秋水仙素培养2 d的处理，同时混倍体也大量存在.当质量分数超过0.050%、培养时间大于2 d时，八倍体比率显著增加.综合分析可知，适宜四倍体诱导的秋水仙素质量分数在0.010%~0.030%之间，适宜八倍体诱导的秋水仙素质量分数在0.050%~0.100%之间，处理时间均为2~3 d.二倍体(2x)与人工诱导的四倍体(4x)、八倍体(8x)植株叶片细胞的流式图结果见图 3.

    • 2.4.   根尖压片结果

  • 对经流式细胞仪筛选出的四倍体、八倍体和对照二倍体植株根尖生长点染色体压片鉴定后发现，对照的二倍体黑喉石斛染色体数目2n=2x=38条，四倍体和八倍体染色体数目发生改变，其染色体数目变化范围分别为2n=4x=76和2n=8x=152(图 4)，故经秋水仙素处理后的植株应为诱导产生的四倍体植株和八倍体植株.

3.   讨论

  • 石斛属植物的多倍体在自然界及离体培养中广泛存在[7-8]，具有古老的物种进化潜力，既具有短期效果(细胞、器官大小及基因表达的变化)，也具有长期(进化)的影响[9-11].筛选自然发生的多倍体进行杂交选育，发生频率低，选育周期长，而本实验以黑喉石斛原球茎为实验材料，可以获得足够数量的多倍体，以满足选种需要，且黑喉石斛嫩茎开花的特点大大缩短了育种周期.因此，本实验结果在杂交育种及种质遗传转化体系研究上皆具有重大价值.

    秋水仙素的质量分数和处理时间是影响多倍体产生的重要因素，形成不同物种多倍体所需的最佳质量分数和处理时间存在差异. Sarathum等人[3]报道指出0.075%的秋水仙素处理14 d时，可以获得43.1%的四倍体植株；Vichiato等人[4]报道指出金钗石斛四倍体产生的适宜质量分数和时间是0.1%和96 h；詹忠根等人[12]报道指出质量分数为0.05%、处理天数为10 d时，可以获得较多的铁皮石斛四倍体植株.一般而言，适合兰科植物的秋水仙素质量分数在0.05~0.1%之间[13]，而处理时间的长短取决于实验材料及处理方法.黑喉石斛对秋水仙素较为敏感，处理时间为2~3 d，0.010%~0.030%的秋水仙素质量分数适宜于黑喉石斛四倍体诱导，而稍高的秋水仙素质量分数(0.050%~0.100%)能诱导出黑喉石斛八倍体.多倍体器官巨大、产量高、抗逆性强，但是并不意味着倍数越大越好，本实验中八倍体相较于四倍体，发育更加迟缓，株型奇特，多表现为整株分叉.

    黑喉石斛多倍体形态及气孔观察与已有报道一致[1-2]，均表现出叶色深绿、叶片粗糙、株高下降、茎粗增大、气孔变大和密度变小等特征.对本实验筛选出的四倍体和八倍体植株可育成稳定品种，然后进行杂种优势利用，然而多倍体形成初期并不稳定[14]，除了生长缓慢[15]、严重不育外，还存在回复成二倍体的可能性，因此有必要对其进行扩繁稳定和育苗移栽，有目的地筛选出生长较快、抗逆性强的多倍体植株，形态及倍性筛选也应延续几个世代.

参考文献 (15)

目录

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