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犬弓首蛔虫卵黄原蛋白DUF1943结构域的克隆及原核表达

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罗永莉, 朱宏宏, 江艾耘, 等. 犬弓首蛔虫卵黄原蛋白DUF1943结构域的克隆及原核表达[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2018, 40(1): 15-20. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.01.003
引用本文: 罗永莉, 朱宏宏, 江艾耘, 等. 犬弓首蛔虫卵黄原蛋白DUF1943结构域的克隆及原核表达[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2018, 40(1): 15-20. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.01.003
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Yong-li LUO, Hong-hong ZHU, Ai-yun JIANG, et al. Cloning and Prokaryotic Expression of the DUF1943 Domain of Toxocara canis Vitellogenin[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2018, 40(1): 15-20. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.01.003
Citation: Yong-li LUO, Hong-hong ZHU, Ai-yun JIANG, et al. Cloning and Prokaryotic Expression of the DUF1943 Domain of Toxocara canis Vitellogenin[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2018, 40(1): 15-20. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.01.003
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犬弓首蛔虫卵黄原蛋白DUF1943结构域的克隆及原核表达

  • 西南大学 动物科学学院，重庆 荣昌 402460

  • 基金项目: 国家自然科学基金项目(31172313)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(XDJK2016E087)
详细信息
    作者简介:

    罗永莉(1992-)，女，重庆綦江人，硕士，主要从事传染病学与寄生虫病学研究 .

    通讯作者: 周荣琼，教授

  • 中图分类号: S858.292

Cloning and Prokaryotic Expression of the DUF1943 Domain of Toxocara canis Vitellogenin

  • College of Animal Science, Southwest University, Rongchang Chongqing 402460, China

  • 摘要: 为克隆犬弓首蛔虫Toxocara canis，T. canis卵黄原蛋白DUF1943结构域(The domain of unknown function 1943，DUF1943)(Tc-duf1943)，构建其原核表达载体pET-28a(+)/duf1943，并检测重组蛋白在大肠杆菌Escherichia coli，E. coli中的表达形式.该文根据T. canis的转录组数据，以T. canis雌、雄虫cDNA为模板扩增Tc-duf1943，然后与表达载体pET-28a(+)连接，转化E. coli BL21(DE3)，经IPTG诱导，对目的蛋白的原核表达形式和蛋白质纯化进行鉴定.结果显示Tc-duf1943序列长度为864 bp，含有一个完整的开放阅读框，编码288个氨基酸；SDS-PAGE电泳结果表明，重组蛋白以包涵体形式存在，相对分子质量大小约为3.5×104；对表达条件进行优化后，以0.4 mmol/L IPTG，于37 ℃诱导4 h时可获得大量目的蛋白；利用Ni-NTA亲和层析柱纯化可以获得具有较高纯度的目的蛋白.该试验成功构建了pET-28a(+)/duf1943原核表达载体，为进一步研究TcDUF1943的生物学功能奠定了基础.
    Abstract: To clone the DUF1943 (the domain of unknown function 1943) of vitellogenin in Toxocara canis, the prokaryotic expression vector pET-28a (+) /duf1943 of Tc-duf1943 was constructed and its expression form in Escherichia coli was detected. According to the transcriptome data about T. canis, and using the cDNA of female and male as templates, Tc-duf1943 was cloned successfully. Then the target gene was connected with the prokaryotic expression vector pET-28a(+) (pET-28a(+)/duf1943), E. coli BL21 (DE3) was transformed and the prokaryotic expression and purification of the protein was identified. The results showed that Tc-duf1943 was 864 bp in length, with a complete open reading frame, encoding 288 amino acids, and SDS-PAGE indicated that the recombinant protein was expressed in inclusion bodies, with a molecular weight of about 3.5×104, The optimal condition of prokaryotic expression was induced by 0.4 mmol/L IPTG for 4 hours at 37 ℃. Purified with Ni-NTA affinity chromatography, target protein with high purity was obtained. In conclusion, this experiment successfully constructed the prokaryotic expression vector of pET-28a(+)/duf1943, which laid a foundation for further biological function study of TcDUF1943.
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  • 图 1  Tc-duf1943 PCR扩增及重组质粒pET-28a(+)/duf1943酶切

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    图 2  TcDUF1943的表达形式

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    图 3  TcDUF1943表达条件的优化

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    图 4  TcDUF1943纯化

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    表 1  引物序列

    基因名称 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3')
    Tc-duf1943 CGCGGATCCATGAGCAAATTCATGCATAGGAC CCCAAGCTTTTAAGTTTGTATCAACAGGATCT
    18S rRNA AATTGTTGGTCTTCAACGAGGA AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-03-06
  • 刊出日期:  2018-01-20

犬弓首蛔虫卵黄原蛋白DUF1943结构域的克隆及原核表达

    通讯作者: 周荣琼，教授
    作者简介: 罗永莉(1992-)，女，重庆綦江人，硕士，主要从事传染病学与寄生虫病学研究
  • 西南大学 动物科学学院，重庆 荣昌 402460
  • 收稿日期:  2017-03-06
基金项目:  国家自然科学基金项目(31172313)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(XDJK2016E087)

摘要: 为克隆犬弓首蛔虫Toxocara canis，T. canis卵黄原蛋白DUF1943结构域(The domain of unknown function 1943，DUF1943)(Tc-duf1943)，构建其原核表达载体pET-28a(+)/duf1943，并检测重组蛋白在大肠杆菌Escherichia coli，E. coli中的表达形式.该文根据T. canis的转录组数据，以T. canis雌、雄虫cDNA为模板扩增Tc-duf1943，然后与表达载体pET-28a(+)连接，转化E. coli BL21(DE3)，经IPTG诱导，对目的蛋白的原核表达形式和蛋白质纯化进行鉴定.结果显示Tc-duf1943序列长度为864 bp，含有一个完整的开放阅读框，编码288个氨基酸；SDS-PAGE电泳结果表明，重组蛋白以包涵体形式存在，相对分子质量大小约为3.5×104；对表达条件进行优化后，以0.4 mmol/L IPTG，于37 ℃诱导4 h时可获得大量目的蛋白；利用Ni-NTA亲和层析柱纯化可以获得具有较高纯度的目的蛋白.该试验成功构建了pET-28a(+)/duf1943原核表达载体，为进一步研究TcDUF1943的生物学功能奠定了基础.

English Abstract

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  • 犬弓首蛔虫Toxocara canis，T. canis是犬常见的胃肠道寄生线虫，其感染性幼虫可以感染人和多种动物[1]，是引起弓首蛔虫病的主要病原.该病的流行和分布极为广泛，据资料报道其感染率为1.4%~64.7%[2-3]. T. canis感染人和其他非特异性宿主可引起内脏幼虫移行症(Visceral larva migrans，VLM)、眼睛幼虫移行症(Ocular larva migrans，OLM)和神经幼虫移行症(Neurological larva migrans，NLM)，造成严重的病理综合征[4-7].

    卵黄原蛋白(vitellogenin，Vg)是脂质转运蛋白家族的成员之一[8-9]，普遍存在于卵生非哺乳动物体内[10].不同来源的卵黄原蛋白具有3个保守功能结构域：位于N端的功能结构域(Vitellogenin，LPD_N)、未知结构域(domain of unknow function，DUF1943)和位于C端的vWD结构域(von-Willebrand factor type D domain，vWD)[11-13]. Vg主要是在卵巢外组织中合成，分泌进入循环系统到达卵巢，通过受体介导的内吞作用进入卵母细胞，为正在发育的胚胎或幼虫提供营养物质[14-15].此外，Vg还具有免疫防御、粒子载体、抗氧化活性、筛选内分泌干扰物、调查环境毒理和污染等[16-19]作用.目前，对于昆虫、甲壳动物和脊椎动物的Vg研究较多[20-21]，但对于寄生虫卵黄原蛋白基因的研究相对较少.

    本研究拟运用分子生物学技术，克隆犬弓首蛔虫Tc-duf1943，构建pET-28a(+)/duf1943原核表达载体，以期能在大肠杆菌E. coli中得到表达，优化其表达条件，为进一步研究TcDUF1943的生物学功能奠定基础.

1.   材料与方法

    1.1.   材料

  • T. canis采自西南大学荣昌校区动物医院某患病犬，由本实验室分离鉴定，液氮速冻并保存.

    胶回收试剂盒、M-MLV反转录酶、SYBR® Premix Ex Taq TM Ⅱ、原核表达载体pET-28a(+)及限制性内切酶Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司.

    • 1.2.   方法

    1.2.1.   引物的设计与合成

  • 根据T. canis的转录组数据(GenBank：JPKZ01002217)，使用软件Primer premier(Version 5.0)分别对Tc-duf1943及18S rRNA基因进行引物设计(表 1)，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.下划线分别为限制性内切酶Bam H Ⅰ和Hind Ⅲ的识别位点.

    • 1.2.2.   总RNA的提取与反转录

  • 采用Trizol试剂分别对T. canis雌虫和雄虫成虫、雌虫生殖道、肠道、体壁及雄虫生殖道、肠道、体壁的总RNA进行提取，采用核酸测定仪检测总RNA的浓度和纯度，以提取的T. canis总RNA为模板，按M-MLV反转录试剂盒说明合成cDNA.

    • 1.2.3.   目的基因的PCR扩增

  • 以合成的cDNA为模板进行PCR扩增.反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，40个循环；最后72 ℃延伸10 min.扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶成像系统扫描并记录结果.

    • 1.2.4.   PCR产物的克隆

  • 利用TransGen Biotech公司的DNA胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，按体系将目的片段与pMDTM19-T载体进行连接：在0.2 mL离心管中加入5 μL的Ligation SolutionⅠ，3 μL的PCR纯化产物，1 μL的pMDTM19-T Vector，1 μL的ddH2O，16 ℃连接4 h.将上述连接产物转化至30 μL的DH5a感受态细胞，涂布于含IPTG(24 mg/mL)和X-gal(20 mg/mL)的LB/Amp琼脂平板中，于37 ℃恒温培养箱正置30 min，再倒置培养12~16 h.

    • 1.2.5.   原核表达载体的构建

  • 将测序正确的重组质粒与pET-28a(+)表达载体经限制性内切酶Bam H Ⅰ，Hind Ⅲ双酶切，回收酶切过后的目的基因与pET-28a(+)质粒，于反应体系中进行连接，重组表达载体经热激法转化E. coli DH5α感受态细胞，经LB/ Kan平板初筛，挑取单菌落于LB/ Kan液体培养基中，220 r/min振荡培养12 h，提取质粒，进行PCR、双酶切及测序鉴定.

    • 1.2.6.   诱导表达和SDS-PAGE分析

  • 提取重组质粒，转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种于LB/ Kan液体培养基，37 ℃ 220 r/min振荡培养，当OD600值达到0.6~1.0时，加入0.4 mmol/L的IPTG诱导4 h，将菌液于4 ℃，8 000 r/min进行离心，收集菌体，超声波破碎，分离上清和沉淀，并进行SDS-PAGE电泳检测，鉴定重组蛋白的相对分子质量、表达形式及表达量.检测到目的蛋白后，再分别进行IPTG浓度梯度和时间梯度的优化.

    • 1.2.7.   重组蛋白的纯化

  • 取大量诱导表达后的菌液，4 ℃ 6 000 r/min离心20 min，收集菌体，超声波破碎，离心收集目的蛋白，用8 M尿素溶解包涵体，4 ℃ 8 000 r/min离心30 min，上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化，SDS-PAGE检测纯化效果，-80 ℃保存备用.

2.   试验结果

    2.1.   Tc-duf1943克隆及原核表达载体的构建

  • 经PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在850 bp左右处可见清晰的条带，大小与预期的目的片段相符(图 1a).将Tc-duf1943亚克隆到pET-28a(+)载体，经双酶切鉴定，结果表明目的片段成功连接到pET-28a(+)载体上(图 1b).

    • 2.2.   重组蛋白的诱导表达及纯化

  • 将阳性重组质粒转化E. coli BL21(DE3)，经IPTG体外诱导表达，产物以包涵体的形式存在，大小约为3.5×104，与理论预测值相符(图 2)；对诱导条件进行优化，结果表明37 ℃，IPTG浓度为0.4 mmol/L，诱导4 h时，重组蛋白的表达量最高(图 3)；融合蛋白经Ni-NTA纯化，纯化后的蛋白具有较高的纯度(图 4).

3.   讨论

  • 卵黄原蛋白是一种高分子质量的磷酸脂糖蛋白(Lipophosphoglycoprotein)，在雌激素作用下，可以在除卵巢以外的其他组织中(如昆虫脂肪体、鱼类肝脏、甲壳动物肝胰腺、线虫肠细胞、海胆消化道细胞等)合成，随后分泌进入循环系统，到达卵巢，经卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor，VgR)介导的内吞作用进入卵母细胞，分解为卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin，Lv)、卵黄蛋白(Yolk glycoprotein，YP)和卵黄高磷蛋白(Phosvitin，Pv)等，为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、磷和硫等营养物质[16, 22-25].

    重组蛋白表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统及植物病毒系统等.其中大肠杆菌表达系统是目前最为成熟的原核表达系统，其对应的表达载体之一pET-28a(+)，具有组氨酸融合表达标签，该标签相对分子质量较小，对外源蛋白的空间结构和活性影响较小，能使外源目的蛋白实现融合表达；pET系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，外源蛋白处于沉默状态而不表达[26].试验中诱导表达的菌株是E. coli BL21菌株，该菌株缺少lon和ompT基因，是具有T7 RNA聚合酶基因的蛋白酶缺陷株，能减少重组蛋白的降解[27]，因此E. coli系统被广阔应用于生物学领域.

    卵黄原蛋白功能结构域DUF1943能与微生物的保守组件即病原相关模式分子(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)相结合，发挥免疫活性作用. Li等[28-29]报道Vg的2个功能结构域DUF1943和vWD均能与PAMPs相结合，例如革兰氏阴性菌的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、革兰氏阴性/阳性菌的肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(Lipoteichoic acid，LTA)和真菌的葡聚糖(Glucan)[30]等结合. Du等[31]发现后生动物大榔头珊瑚Euphyllia ancora，E. ancora的功能结构域Vitellogenin_N，DUF1943和vWD也可作为模式识别受体.而犬弓首蛔虫DUF1943是否具有同样的免疫活性作用，还需后续进一步的试验研究.

参考文献 (31)

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