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牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证

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覃鸿妮, 谢钰珍, 薛高旭, 等. 牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2018, 40(6): 24-31. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.06.004
引用本文: 覃鸿妮, 谢钰珍, 薛高旭, 等. 牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2018, 40(6): 24-31. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.06.004
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Hong-ni QIN, Yu-zhen XIE, Gao-xu XUE, et al. Synthesis, Expression and Function Identification of Bovine Pancreatic Gene DNaseⅠ[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2018, 40(6): 24-31. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.06.004
Citation: Hong-ni QIN, Yu-zhen XIE, Gao-xu XUE, et al. Synthesis, Expression and Function Identification of Bovine Pancreatic Gene DNaseⅠ[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2018, 40(6): 24-31. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.06.004
shu

牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证

  • 1.

    苏州工业园区服务外包职业学院，江苏 苏州 215123

  • 2.

    金唯智生物科技有限公司，江苏 苏州 215123

  • 3.

    西南大学 玉米研究所，重庆 400715

  • 基金项目: 重庆市重大项目(cstc2016shms-ztzx80016)；苏州市高职高专院校教改项目(2017SZJG015)
详细信息
    作者简介:

    覃鸿妮(1983-)，女，博士，讲师，主要从事分子生物学的研究 .

  • 中图分类号: Q812

Synthesis, Expression and Function Identification of Bovine Pancreatic Gene DNaseⅠ

  • 1.

    Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing, Suzhou Jiangsu 215123, China

  • 2.

    Genewiz Biological Technology CO., LTD, Suzhou Jiangsu 215123, China

  • 3.

    Maize Reserch Institute, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 摘要: 从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列，利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化，设计并合成24条首尾重叠的引物合成786 bp的DNaseⅠ基因，构建重组载体pET30a-DNaseⅠ，转入BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)，BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达后，纯化目的蛋白并验证其活性.结果表明：BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常，且未纯化到目的蛋白，BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常，但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白，IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白.经验证，酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA，酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散，表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA.
    Abstract: Deoxyribonulease I (DNaseⅠ) sequence from bovine pancreas, 786 bp in size, acquired from NCBI and optimized by Codon Optimization, was synthesized, using SOE PCR(gene splicing by overlap extension PCR)with 24 overlapped primers. The recombinant expression vector pET30a-DNaseⅠ was successfully constituted, and was transformed into the competent cells of E. coli, BL21 (DE3), ArcticExpress(DE3) and BL21(DE3) pLysS. Then, DNaseⅠwas purified and its activity was detected. The results showed that the colonies in BL21(DE3) and ArcticExpress(DE3) did not grow properly and no target protein was gained. The colony in BL21(DE3) pLysS induced by glucose or without induction grew normally, but no purified target protein was obtained. In amplification culture of BL21(DE3) pLysS induced by IPTG, 0. 15 mg/mL DNaseⅠwas purified. DNaseⅠactivity detection indicated that the raw liquid of the enzyme could completely dissolveλ-DNA and plasmid DNA of various sizes, while its diluted liquid partially dissolvedλ-DNA only.
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  • 图 1  基因合成PCR产物电泳图

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    图 2  重组载体菌落PCR产物电泳图

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    图 3  BL21(DE3)感受态菌落PCR产物电泳图

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    图 4  蛋白质检测标准曲线

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    图 5  DNaseⅠ SDS-PAGE检测图

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    图 6  DNaseⅠ消化质粒电泳检测图

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    图 7  DNaseⅠ消化λ-DNA电泳检测图

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    表 1  PCR体系和PCR程序

    PCR体系 PCR程序
    试剂 体积/μL 步骤 温度/℃ 时间
    第一轮PCR 5× pfu Buffer 10 1.预变性 95 3 min
    引物混液 10 2.变性 95 15 s
    dNTP 1 3.退火 58 15 s
    pfu酶 0.5 4.延伸 72 15 s
    ddH2O Up to 50 5.循环(重复步骤2-4) - 25次
    6.最后延伸 72 1 min
    第二轮PCR 5× pfu Buffer 20 1.预变性 95 3 min
    第一轮PCR产物 2 2.变性 95 15 s
    第一条和最后一条引物 各1 3.退火 58 15 s
    dNTP 1 4.延伸 72 30 s
    pfu酶 1 5.循环(重复步骤2-4) - 25次
    ddH2O Up to 100 6.最后延伸 72 3 min
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    表 2  引物序列

    引物名字 序列 长度/bp
    DNaseⅠ-1 TTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGCTGAAAATCGCAGCCTTTAAC 52
    DNaseⅠ-2 TGCTCATTTTGGTCTCGCCAAAGGTGCGGATGTTAAAGGCTGCGATTTTCAG 52
    DNaseⅠ-3 GCGAGACCAAAATGAGCAACGCCACCCTGGCCAGCTATATTGTGCGCATCGTT 53
    DNaseⅠ-4 CTTCTTGAATCAGCACAATATCGTAGCGGCGAACGATGCGCACAATATAGC 51
    DNaseⅠ-5 CGATATTGTGCTGATTCAAGAAGTTCGCGATAGCCATCTGGTGGCAGTTGGCA 53
    DNaseⅠ-6 GTGTTCGGGTCGTCCTGATTCAGGTAATCCAGCAGCTTGCCAACTGCCACCAG 53
    DNaseⅠ-7 CAGGACGACCCGAACACCTACCATTATGTGGTGAGCGAACCGCTGGGCCGCAACA 55
    DNaseⅠ-8 GTTCGGGCGAAACAGGAACAGATAGCGCTCCTTGTAGCTGTTGCGGCCCAGC 52
    DNaseⅠ-9 CCTGTTTCGCCCGAACAAGGTGAGCGTTCTGGATACCTACCAGTACGATGATGGC 55
    DNaseⅠ-10 GCGGCTAAAGCTGTCGTTGCCGCAGCTCTCGCAGCCATCATCGTACTGGTAGGT 54
    DNaseⅠ-11 AACGACAGCTTTAGCCGCGAACCGGCAGTGGTTAAGTTCAGCAGCCATAGCA 52
    DNaseⅠ-12 GGGCCACAATGGCAAACTCCTTCACCTTGGTGCTATGGCTGCTGAACTTAA 51
    DNaseⅠ-13 TTGCCATTGTGGCCCTGCATAGTGCACCGAGCGATGCCGTTGCCGAGATCAATAG 55
    DNaseⅠ-14 TCTGCTGCACATCCAGGTACACATCATATAAGCTATTGATCTCGGCAACGG 51
    DNaseⅠ-15 ACCTGGATGTGCAGCAGAAGTGGCACCTGAACGACGTGATGCTGATGGGTGACTT 55
    DNaseⅠ-16 CTACTGGTCACGTAGCTGCAGTCGGCATTAAAGTCACCCATCAGCATCAC 50
    DNaseⅠ-17 CTGCAGCTACGTGACCAGTAGCCAGTGGAGCAGCATTCGCCTGCGTACCAGC 52
    DNaseⅠ-18 GTGTCTGCGCTGTCCGGAATCAGCCACTGAAAGGTGCTGCTGGTACGCAGGCG 53
    DNaseⅠ-19 CGGACAGCGCAGACACCACCGCAACCAGCACCAATTGCGCATACGACCGTATCG 54
    DNaseⅠ-20 GGCACCACACTGCTCTGCAGCAGGCTACCTGCCACAACGATACGGTCGTATGCGC 55
    DNaseⅠ-21 CAGAGCAGTGTGGTGCCGGGTAGTGCCGCACCGTTTGATTTTCAGGCCGCATACG 55
    DNaseⅠ-22 TGATCGCTGATGGCCAGGGCCATTTCATTGCTCAGACCGTATGCGGCCTGAAAAT 55
    DNaseⅠ-23 TGGCCATCAGCGATCACTATCCTGTGGAGGTTACCCTGACCCACCATCATCATCA 55
    DNaseⅠ-24 TATCAGCCATGGCCTTGTCGTCGTCGTCTTAATGATGATGATGATGGTGGGTCAG 55
    下载: 导出CSV
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图( 7) 表( 2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-01-09
  • 刊出日期:  2018-06-20

牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证

    作者简介: 覃鸿妮(1983-)，女，博士，讲师，主要从事分子生物学的研究
  • 1. 苏州工业园区服务外包职业学院，江苏 苏州 215123
  • 2. 金唯智生物科技有限公司，江苏 苏州 215123
  • 3. 西南大学 玉米研究所，重庆 400715
  • 收稿日期:  2017-01-09
基金项目:  重庆市重大项目(cstc2016shms-ztzx80016)；苏州市高职高专院校教改项目(2017SZJG015)

摘要: 从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列，利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化，设计并合成24条首尾重叠的引物合成786 bp的DNaseⅠ基因，构建重组载体pET30a-DNaseⅠ，转入BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)，BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达后，纯化目的蛋白并验证其活性.结果表明：BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常，且未纯化到目的蛋白，BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常，但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白，IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白.经验证，酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA，酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散，表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA.

English Abstract

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  • 1905年人类首次在牛胰腺中发现DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)，其生理功能远不止消化水解DNA[1]，而且与细胞凋亡、细胞坏死、系统性红斑狼疮、胃肠道肿瘤和心肌梗死等的发生密切相关[2-4]. DNaseⅠ是一种酸性糖蛋白，属二价金属离子(如Ca2+，Mg2+)依赖性核酸酶，对酸性条件敏感，pH值为3.0时，酶活性完全丧失，G肌动蛋白是DNaseⅠ的天然抑制剂，抗凝剂EDTA可抑制酶活性[5].在临床上，DNaseⅠ是亲子鉴定及犯罪学鉴定的良好标志物，血清DNaseⅠ活性增高可作为一种新的高敏感性的急性心肌缺血标志物，酶表型分析可用于预测疾病的易感性[1].

    在研究性实验室中，DNaseⅠ也有着广泛的应用，如除去蛋白质和核酸样品中的DNA，RT-PCR前除去基因组DNA，转录反应后DNA模板的降解，除去RNA样品中污染的基因组DNA，切口平移法进行放射性标记时在双链DNA上产生随机切口等[6-7].直接从牛胰腺组织中分离提取DNaseⅠ因操作复杂，耗时长，在提取过程中活性容易丧失，且其为动物源性产品，不能完全去除RNase，不适合大规模制备. 1990年，Worroll等通过人工合成法合成该基因并在大肠杆菌中表达，但由于当时基因合成及表达方法落后，导致蛋白表达量少且纯化后的蛋白基本没有活性[8]. 1997年，Chen等通过提取RNA，进而合成cDNA和DNaseⅠ基因，并转入大肠杆菌中表达，表达量也不高[9].本研究从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列，利用密码子优化软件进行序列优化，设计并合成24条首尾重叠的引物合成786 bp的DNaseⅠ基因，将合成的DNaseⅠ基因连接到表达载体pET-30a上，转入Top10感受态中，菌落PCR检测并测序显示载体构建成功后，将pET30a-DNase Ⅰ转入BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)，BL21(DE3)pLysS表达菌株中，经IPTG诱导表达.收集菌体采用亲和层析纯化DNaseⅠ目的蛋白，通过切割λDNA和质粒DNA验证其活性.

1.   材料与方法

    1.1.   试验材料

    1.1.1.   目的基因

  • NCBI(National Center for Biotechnology Information)中下载DNaseⅠ蛋白序列(accession：AAB20621).

    • 1.1.2.   载体与大肠杆菌感受态

  • 表达载体为pET-30a，大肠杆菌感受态Top10，BL21(DE3)(Invitrogen)，ArcticExpress(DE3)(Agilent)，BL21(DE3)pLysS(Invitrogen).

    • 1.2.   试验方法

    1.2.1.   目的基因的合成

  • 从NCBI中获取DNaseⅠ蛋白序列，利用金唯智生物科技有限公司的密码子优化软件(Codon Optimization)进行密码子优化，设计并合成多条首尾重叠的引物合成DNaseⅠ基因[10-13].引物拼接PCR的两轮反应体系和程序见表 1.

    • 1.2.2.   重组载体的构建及转化

  • 将载体pET-30a用NdeI和KpnI双酶切，使用NEB公司的Gibson Assembly© Master Mix试剂盒(Cat：E2611L)将酶切后的表达载体pET-30a与DNaseⅠ基因进行连接构建重组载体pET30a-DNaseⅠ，连接产物转化至Top10感受态中，37 ℃过夜培养.

    • 1.2.3.   重组子鉴定

  • 挑取10个单克隆37 ℃扩大培养，利用菌落PCR扩增目的基因，电泳检测到目的条带的克隆随机挑选4个进行目的基因测序.

    • 1.2.4.   基因表达

  • 将测序正确的重组质粒转化BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)，BL21(DE3)pLysS 3种感受态(培养基中加入Kana抗性)，每种感受态涂布两个平板，37 ℃过夜培养.

    • 1.2.5.   DNaseⅠ的纯化

  • 转入BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)感受态的菌落分别用IPTG和葡萄糖诱导，37 ℃扩大培养，收集菌体，于-20 ℃冰冻1 h后用100 mL A相溶解，并超声破碎，12 000 r/min离心10 min，收集上清使用带His标签的亲和层析柱进行纯化[14]，纯化使用GE公司的AKTA avant设备，纯化的蛋白使用723可见光分光光度计测定蛋白浓度.

    转入BL21(DE3)pLysS感受态的菌落随机挑取6个单克隆，加入液体培养基，其中3管转接到600 mL LB培养基中扩大培养并IPTG 15 ℃过夜诱导，进行亲和纯化.其他3管中1管直接加IPTG 37 ℃诱导3 h，1管不诱导，1管加葡萄糖.采用SDS-PAGE验证DNaseⅠ的分子量大小[15].

    • 1.2.6.   验证DNaseⅠ的酶活性

  • 将DNaseⅠ酶原液和5，10，20倍酶稀释液分别消化48.5 kb的λ-DNA，及1.5 kb，2 kb，3 kb，5 kb的质粒，琼脂糖凝胶电泳检测消化结果.

2.   结果与分析

    2.1.   DNaseⅠ基因合成

    2.1.1.   基因序列的优化

  • 采用密码子优化软件优化的序列如下：

    ATGCTGAAAATCGCAGCCTTTAACATCCGCACCTTTGGCGAGACCAAAATGAGCAACGCCACCCTGGCCAGCTATATTGTGCGCATCGTTCGCCGCTACGATATTGTGCTGATTCAAGAAGTTCGCGATAGCCATCTGGTGGCAGTTGGCAAGCTGCTGGATTACCTGAATCAGGACGACCCGAACACCTACCATTATGTGGTGAGCGAACCGCTGGGCCGCAACAGCTACAAGGAGCGCTATCTGTTCCTGTTTCGCCCGAACAAGGTGAGCGTTCTGGATACCTACCAGTACGATGATGGCTGCGAGAGCTGCGGCAACGACAGCTTTAGCCGCGAACCGGCAGTGGTTAAGTTCAGCAGCCATAGCACCAAGGTGAAGGAGTTTGCCATTGTGGCCCTGCATAGTGCACCGAGCGATGCCGTTGCCGAGATCAATAGCTTATATGATGTGTACCTGGATGTGCAGCAGAAGTGGCACCTGAACGACGTGATGCTGATGGGTGACTTTAATGCCGACTGCAGCTACGTGACCAGTAGCCAGTGGAGCAGCATTCGCCTGCGTACCAGCAGCACCTTTCAGTGGCTGATTCCGGACAGCGCAGACACCACCGCAACCAGCACCAATTGCGCATACGACCGTATCGTTGTGGCAGGTAGCCTGCTGCAGAGCAGTGTGGTGCCGGGTAGTGCCGCACCGTTTGATTTTCAGGCCGCATACGGTCTGAGCAATGAAATGGCCCTGGCCATCAGCGATCACTATCCTGTGGAGGTTACCCTGACCTAA.

    • 2.1.2.   引物的设计

  • 根据基因序列设计了24条引物，序列如表 2，合成所有引物用于DNaseⅠ基因的合成.

    • 2.1.3.   基因的合成与检测

  • 利用引物拼接PCR技术合成优化后的DNaseⅠ基因序列，电泳检测可见：样品1-4条带大小均在750 bp~1 000 bp之间(图 1)，与理论值786 bp相符，初步判断目的基因合成正确.

    • 2.2.   重组载体的构建及检测

  • 重组载体转入Top10感受态，37 ℃过夜培养后，由菌落PCR电泳图可见，挑取的10个单克隆1-9号均在750~1 000 bp的位置处出现特异的亮带，为阳性克隆(图 2).在这9个阳性克隆中随机选取的4个克隆测序，结果与目的基因序列一致.

    • 2.3.   基因表达

    2.3.1.   菌落生长情况

  • 1) BL21(DE3)感受态：两个平板只有1个菌落光滑圆润，其他菌落形态异常，质地不均匀.

    2) ArcticExpress(DE3)感受态：两个平板菌落形态异常，质地不均匀.

    3) BL21(DE3)pLysS感受态：两个平板菌落质地均匀圆润，生长一致.

    • 2.3.2.   纯化蛋白浓度检测

  • 1) BL21(DE3)感受态：挑取菌落形态正常的1个菌落和异常的2个菌落进行菌落PCR检测(图 3)，1号泳道为正常菌落，未检测到目的条带，2，3号泳道为异常菌落，反而可以检测到特异目的条带.将有目的条带的菌落经IPTG诱导37 ℃扩大培养，未纯化到目的蛋白.

    2) ArcticExpress(DE3)感受态：挑取菌落形态异常的两个菌落进行培养，菌落无法生长.

    3) BL21(DE3)pLysS感受态：IPTG诱导扩大培养的3个菌落经亲和纯化，总共纯化到7 mL目的产物.直接加IPTG 37 ℃诱导3 h，不诱导和加葡萄糖诱导的3个菌落均未纯化到目的蛋白.

    • 2.3.3.   考马斯亮蓝法测蛋白质的质量浓度

  • 配置0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的BSA溶液，使用723可见光分光光度计测得吸光度OD595，分别为0.14，0.293，0.424，0.569，0.702，作出标准曲线(图 4)，纯化的DNaseⅠ吸光度为0.22，带入公式计算浓度为0.15 mg/mL.

    • 2.3.4.   纯化蛋白的分子量检测

  • 1-3分别为BL21(DE3)pLysS感受态直接加IPTG 37 ℃诱导3 h，不诱导和加葡萄糖诱导的蛋白纯化后的条带，4为IPTG诱导扩大培养的3个菌落经AKTA纯化后的总产物条带(图 5)，可见4号条带对应分子量约为30 kD，与目的蛋白31 kD大小一致[16]，其他1-3号未得到目的蛋白.

    • 2.4.   基因功能验证

    2.4.1.   消化质粒DNA

  • 如图 6，1-12号为不同片段大小的质粒(质粒大小依次为1.5 kb，2 kb，3 kb，3 kb，2 kb，5 kb)，其中奇数号泳道为不加DNaseⅠ处理的质粒对照，偶数号泳道为DNaseⅠ消化后的质粒，酶使用量是1 μL，质粒DNA使用量是5 μg.电泳结果表明DNaseⅠ能够将质粒消化完全.

    • 2.4.2.   消化λ-DNA

  • 如图 7，1为不加DNaseⅠ的对照，2-5分别为DNaseⅠ酶原液和5，10，20倍酶稀释液，酶使用量是1 μL，λ-DNA使用量是1 μg.电泳检测显示：稀释后的酶液对λ-DNA消化不完全，消化后呈弥散状，稀释倍数越高，消化越不完全.酶原液可完全消化λ-DNA.

3.   结论与讨论

    3.1.   结论

  • 利用引物拼接PCR技术合成牛DNaseⅠ基因，构建重组载体pET30a-DNaseⅠ，转入BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)，BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达，其中BL21(DE3)，ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常且未纯化到目的蛋白，BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常，但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白，IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白，经验证，酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA，酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散，表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA.

    • 3.2.   讨论

  • BL21(DE3)菌株是实验室应用最为广泛的表达菌株[17-19]，很多外源基因都能够在该菌株中大量表达，但是由于该菌株有较高的本底表达，所以适合用来表达对宿主没有毒性的外源基因；ArcticExpress(DE3)菌株由于表达在低温(4~12 ℃)具有较高活性的Cpn10和Cpn60分子伴侣，这些分子伴侣能够在低温诱导的条件下最大限度地帮助未折叠或部分折叠的外源蛋白进行正确的折叠，降低包涵体的表达量，提高可溶性蛋白的含量，因此非常适合低温诱导可溶性表达外源基因[20]；BL21(DE3)PLysS菌株因为表达T7溶菌酶极大地降低了外源基因的本底表达，因此非常适合用于表达对宿主有毒性的外源基因[21-22].

    本研究中的DNaseⅠ由于对宿主有很大的毒性[7]，因此在BL21(DE3)以及ArcticExpress(DE3)菌株中表达失败，但是在BL21(DE3)PLysS菌株中成功表达，纯化的DNaseⅠ具有很好的酶活性，能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA，为实验室制备DNaseⅠ提供了可行的方法.

    2 400 mL的LB培养基最终纯化得到1 mg(0.15 mg/mL)的DNaseⅠ，考虑到DNaseⅠ对宿主有很大的毒性，这样的表达量不算太低.相对于BL21(DE3)PLysS菌株，Invitrogen公司的BL21(DE3)PLysE菌株由于能够表达更高的T7溶菌酶[23]，能够更大程度地抑制外源基因的本底表达，因此使用该菌株有可能进一步提高DNaseⅠ表达量.

参考文献 (23)

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